HAV M. ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti IgM Anti-HAV

ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti IgM Anti-HAV HAV M 845 0124 Impiego Per la determinazione qualitativa in vitro dell anticorpo IgM del virus dell epatite A (HAV) nel siero o nel plasma umano (EDTA, eparina o citrato). Da utilizzare come sussidio nella diagnosi d infezione da epatite A acuta o recente. Compendio e spiegazione del dosaggio Gli anticorpi IgM anti-hav sono rilevabili già all esordio dei sintomi 1,2. La persistenza della risposta IgM è estremamente variabile: in alcuni casi sono state rilevate IgM specifiche entro un mese, in altri entro un anno 3,4. Nella maggioranza dei casi, gli anticorpi IgM anti-hav persistono per un periodo di 3-6 mesi dopodiché essi scendono a livelli non più misurabili. Il dosaggio IgM anti-hav della VITROS è studiato per rilevare la presenza di anticorpo IgM anti-hav a livelli di sensibilità adeguati quale sussidio nella diagnosi dell infezione da epatite A acuta o recente. La determinazione della presenza di IgM anti-hav può risultare utile nella diagnosi differenziale dell epatite A rispetto ad altre forme di epatite virale. Principi della procedura Il dosaggio IgM anti-hav della VITROS viene effettuato utilizzando la confezione di reagente IgM anti-hav della VITROS e il calibratore IgM anti-hav per prodotti immunodiagnostici VITROS sul sistema immunodiagnostico VITROS. Viene adottata una tecnica a cattura di anticorpo 5, che prevede la diluizione del campione e la reazione simultanea dell IgM umana nel campione diluito con anticorpo IgM anti-umano monoclonale di ratto biotinilato. L immuno-complesso viene catturato mediante streptavidina sui pozzetti, i materiali non legati vengono rimossi mediante lavaggio. L anticorpo anti-hav monoclonale di ratto marcato con perossidasi di rafano (HRP), complessato con antigene HAV inattivato (coniugato), viene quindi catturato da IgM anti-hav specifica legata ai pozzetti. Il materiale non legato viene rimosso mediante lavaggio. Il coniugato HRP legato viene misurato mediante reazione luminescente 6. Ai pozzetti vengono aggiunti reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed agente di trasferimento degli elettroni. L HRP presente nel coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, producendo luce. L agente di trasferimento degli elettroni (acetanilide sostituito) aumenta il livello di luce prodotto, prolungandone altresì l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato HRP legato è direttamente proporzionale alla concentrazione di IgM Anti-HAV presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale Potenzialmente Infettivo Il reagente coniugato IgM anti-hav della VITROS contiene virus dell epatite A inattivato con formaldeide. Il calibratore IgM anti-hav della VITROS contiene plasma positivo a IgM anti-hav umana di donatori sottoposti a test individuali e risultati negativi all antigene di superficie dell epatite B (HBsAg), agli anticorpi del virus da immunodeficienza umana (HIV 1+2) e al virus dell epatite C (HCV), tramite metodiche approvate (immunodosaggi enzimatici, EIA). Si raccomanda di usare la dovuta cautela nella manipolazione di materiali di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, HCV, HIV 1+2 e di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es.direttiva M29 del NCCLS 7 ). Versione 1.0 Pubb. n. GEM1230_IT 1

HAV M ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti AVVERTENZA: Contiene Kathon e ProClin 300 Il reagente coniugato contenente del Kathon e il reagente anticorpo biotinilato contenente del ProClin 300. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Materiali forniti 1 confezione dei reagenti contenente: 100 pozzetti rivestiti (streptavidina, lega 3 ng biotina/pozzetto). 19,4 ml di reagente anticorpo biotinilato (biotina-igm anti-umana IgG monoclonale di ratto, 0,5 µg/ml) in tampone con agente antimicrobico. 20,6 ml di reagente coniugato (HRP-IgG anti-hav monoclonale di ratto 36 ng/ml, con antigene di epatite A inattivato, titolo 1/95) in tampone con agente antimicrobico. NOTA: Contiene sieroalbumina bovina e gamma globulina bovina. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema immunodiagnostico VITROS e i seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: IgM Anti-HAV Calibratore (comprese la scheda di calibrazione del lotto e le schede dei protocolli), il reagente di segnale, il reagente di lavaggio universale, diluente del campione ad elevata concentrazione B, scatola di conservazione della confezione di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti sigillati con essiccante a secco. Il calibratore IgM Anti-HAV viene fornito pronto per l uso. Conservare in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Dopo l apertura conservare per un massimo di 10 settimane a 2-8 C o 10 settimane a -20 C (non è ammesso più di 1 ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Si possono utilizzare campioni di siero o plasma (EDTA, eparina e citrato). I risultati ottenuti con campioni plasmatici (citrato) saranno proporzionalmente inferiori a motivo della diluizione con anticoagulante liquido. Raccogliere i campioni ematici con procedure standard. I campioni devono essere accuratamente separati da tutto il materiale cellulare, altrimenti si rischia di ottenere risultati falsamente elevati. I campioni di siero e plasma possono essere conservati per un massimo di 7 giorni a 2-8 C o 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Non utilizzare campioni resi inattivi dal calore. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 8. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con il sistema VITROS. Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. La calibrazione è specifica per i singoli lotti; i calibratori e le confezioni di reagenti vengono associati in base al numero di lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la stessa calibrazione, che dev essere effettuata con calibratore con lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a 15-30 C prima dell uso. Il calibratore IgM Anti-HAV viene elaborato automaticamente in duplicato. 2 Pubb. n. GEM1230_IT Versione 1.0

ISTRUZIONI PER L USO Procedura HAV M Manipolare i campioni, i calibratori e i controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Riportarli a 2-8 C quanto prima dopo l uso oppure caricare soltanto un quantitativo sufficiente per un singolo impiego. Il calibratore può essere suddiviso/possono suddivisi in aliquote in contenitori alternativi, che devono essere identificati mediante le etichette con codice a barre fornite in dotazione. Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti e la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale, diluente del campione ad elevata concentrazione B e Reagenti calibrati sufficienti a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio richiede l esecuzione di controlli per la verifica delle prestazioni del dosaggio. Sono disponibili 2 controlli IgM Anti-HAV VITROS (IgM Anti-HAV negativo e IgM Anti-HAV positivo). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente ad una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). O ad intervalli più vicini ove richiesto dalle procedure di controllo qualità in uso presso il laboratorio. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è Anti-HAV IgM. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio è HAV M. Se necessario è possibile riconfigurare questi valori predefiniti dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. Procedura Il dosaggio per IgM Anti-HAV VITROS richiede 10 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola, indipendentemente dal volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio per IgM Anti-HAV VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 14 giorni. Il dosaggio per anti-hav IgM VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. ATTENZIONE: per questo dosaggio non utilizzare la funzione Reflex Processing (elaborazione reflex) nei sistemi VITROS in cui sia presente una versione software inferiore a 3.1. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema immunodiagnostico VITROS, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema. A questo punto viene visualizzato il pulsante relativo alle diverse determinazioni sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti per immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). Accertatevi di avere a disposizione una quantità sufficiente di diluente del campione ad elevata concentrazione B VITROS per l impiego previsto. NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i settori sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi di campionamento vengono effettuate automaticamente. Verificare che nel dispositivo di alimentazione dei puntali ausiliari sia presente un numero sufficiente di puntali monouso per il lavoro programmato. 4. Analizzare i calibratori come se si trattasse di campioni (caricare un quantitativo sufficiente per la misura automatica in duplicato), che devono essere identificati mediante le etichette con codice a barre fornite in dotazione. Se si usano etichette con codici a barre non occorre programmare la calibrazione, la calibrazione verrà effettuata automaticamente. Risultati I risultati sono calcolati come un segnale normalizzato, relativo ad un valore di cut-off. Durante la procedura di calibrazione viene utilizzato un parametro specifico del lotto, codificato sulla scheda di calibrazione dei lotti, ai fini della determinazione di un valore di cut-off memorizzato valido per il sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Risultato= Segnale per il campione di prova Valore di cut-off Un risultato di 1,20 indica un campione reattivo e l eventuale presenza di IgM Anti-HAV. Un risultato di <0,80 indica un campione non reattivo, negativo per IgM Anti-HAV. Un risultato di 0,80 e <1,20 indica un campione borderline. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1230_IT 3

HAV M ISTRUZIONI PER L USO Controllo di qualità Controllo di qualità I risultati delle calibrazione vengono valutati a fronte di due parametri di qualità secondo quanto indicato nella Visualizzazione dei parametri di calibrazione, cui si accede dallwa videata Opzioni e configurazione - Revisione/Calibrazioni dell utente. Il mancato rispetto dei parametri di qualità definiti viene codificato nel rapporto di calibrazione. Per le azioni da mettere in atto in seguito ad una calibrazione non andata a buon fine, vedere la Guida dell operatore, capitolo 8, Revisione dei risultati. I valori del campione dei paziente vengono identificati come Negativo, Borderline o Reattivo. I valori di controllo vengono identificati se la DS 2 rispetto alla media di baseline definita. La qualità della calibrazione non può essere descritta appieno da un singolo parametro. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento ai valori di controllo ai fini della determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. Un risultato negativo del test non esclude la possibilità di essere esposti al virus dell epatite A. Livelli di IgM anti-hbc possono essere al di sotto del limite estremo nelle infezioni allo stadio iniziale e in quelle in stato avanzato. Gli anticorpi eterofili nei campioni di siero o di plasma possono provocare interferenze negli immunodosaggi 9. Questi anticorpi possono essere presenti nei campioni di sangue provenienti da individui a contatto con animali o che sono stati curati con prodotti derivati da siero animale. I risultati che sono contraddittori con le osservazioni cliniche indicano che sono necessari altri test. I campioni contenenti trioleina (<33,9 mmol/l), emoglobina (<5,0 g/l) o bilirubina (<0,257 mmol/l) non interferiscono con l interpretazione clinica dei risultati. Non usare campioni torbidi. I livelli di biotina nel siero restano elevati fino a 24 ore in seguito a somministrazione di biotina per via orale o intravenosa. I campioni contenenti 10 ng di biotina/ml non interferiscono con l interpretazione clinica dei risultati. Interpretazione dei risultati Un risultato negativo indica che non sono stati rilevati IgM Anti-HAV a livelli tali da indicare un infezione virale acuta o recente da epatite A. Un risultato reattivo è indice di infezione acuta o recente da epatite A. Un campione risultato borderline nel dosaggio IgM Anti-HAV VITROS andrà sottoposto ad ulteriore analisi in duplicato per verificarne lo stato effettivo. Prima d essere ulteriormente analizzato, il campione deve essere centrifugato in modo da rimuovere cellule, depositi cellulari e fibrina. Se i risultati del test ripetuto sono <0,80 per entrambi i replicati, il campione deve essere ritenuto negativo. Se i risultati del test ripetuto sono 1,20 per entrambi i replicati, il campione deve essere considerato reattivo. Nel caso di risultati ripetutamente borderline, si raccomanda l esecuzione di analisi di follow-up. ATTENZIONE: per questo dosaggio non utilizzare la funzione Reflex Processing (elaborazione reflex) nei sistemi VITROS in cui sia presente una versione software inferiore a 3.1. Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla La calibrazione del dosaggio anti-hav IgM VITROS è tracciabile contro un calibratore di riferimento interno a cui è stato assegnato un valore in grado di ottimizzare la sensibilità clinica e le performance di specificità. 4 Pubb. n. GEM1230_IT Versione 1.0

ISTRUZIONI PER L USO Prestazioni metodologiche HAV M Precisione La precisione è stata valutata in conformità al protocollo EP5-T2 10 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Due replicati, ciascuno di 4 campioni pannello e 1 plasma di controllo liofilizzati sono stati dosati in una singola occasione al giorno per almeno 20 giorni -diversi. L esperimento è stato effettuato usando 2 lotti di reagenti, su sistemi diversi. I dati riportati sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 1: Precisione Risultatovo Intra-dosaggio Intracalibrazione Intralaboratorio Rappresentati DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 2,77 0,0613 2,3 0,142 5,1 0,148 5,4 1,90 0,0676 3,5 0,119 6,2 0,125 6,6 0,53 0,0220 4,0 0,0468 8,8 0,0474 8,9 1,13 0,0405 3,5 0,0765 6,8 0,0755 6,7 2,00 0,0595 3,0 0,115 5,8 0,118 6,0 * Quadratica media Giornaliera: Precisione fra un duplicato e l altro, con media ottenuta su tutti i replicati. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variazione infra-replica e l altra e da un giorno all altro. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Sensibilità 230 campioni di pazienti precedentemente determinati reattivi all IgM Anti-HAV in un diverso dosaggio disponibile in commercio sono stati sottoposti ad analisi con il dosaggio IgM Anti-HBc VITROS. Si è calcolato che la sensibilità di questa popolazione di campioni IgM Anti-HAV VITROS corrisponde a 99,6% (229/230). Inoltre, sono stati sottoposti ad analisi 3 campioni rappresentativi di sieroconversione disponibili in commercio. Il dosaggio IgM Anti-HAV VITROS ha mostrato una sensibilità di sieroconversione equivalente o maggiore per 3/3 campioni rappresentativi, laddove confrontati con i risultati resi noti da altri dosaggi disponibili in commercio. La sensibilità del dosaggio IgM Anti-HAV è stata definita in modo tale che un risultato reattivo è indice di infezione acuta o recente da epatite A. Specificità Campioni di 508 donatori di sangue in apparente buona salute e 60 campioni clinici sono stati testati con dosaggio IgM Anti-HAV VITROS e altro dosaggio del commercio. Campioni Numero di campioni analizzati Inizialmente reattivi Ripetutamente reattivi Confermati positivi Donatore 508 0 0 0 Clinici 60 0 0 0 La specificità del dosaggio IgM Anti-HAV VITROS per i donatori di sangue è stata calcolata come 100% (508/508) basandosi su reattivi ripetuti. La specificità del dosaggio IgM Anti-HAV VITROS per la popolazione di clinici è stata calcolata del 100% (60/60) basandosi su reattivi ripetuti. Inoltre 154 sono stati testati con il dosaggio IgM Anti-HAV VITROS campioni dei seguenti sottogruppi potenzialmente cross-reagenti: CMV, malattie epatiche non-virali, epatite B acuta (IgM core elevata), campioni anti-hcv positivi, IgG anti-hav positiva/igm anti-hav negativa, fottore reumatoide positivo, altre malattie autoimmunitarie, altre malattie virali. Di tali campioni nessuno è stato riscontrato ripetutamente reattivo con il dosaggio IgM Anti-HAV VITROS. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1230_IT 5

HAV M ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia Bibliografia 1. Flehmig, B et al. A solid phase radioimmunoassay for Detection of IgM Antibodies to Hepatitis A Virus; The Journal Of Infectious Diseases, (1979) 140: 169-175. 2. Lemon, S.M., et al. Immunoglobulin M Response to Hepatitis A Virus Determined by Solid Phase Radioimmunoassay; Infection and Immunity, (1980) 28: 927-936. 3. Kao, H.W., et al. The persistence of Hepatitis A IgM antibody after Acute Clinical Hepatitis A; Hepatology (1984) 4: 933-936. 4. Liaw, Y.F., et al. Appearance and Persistence of Hepatitis A IgM antibody after Acute Clinical Hepatitis A Observed in a Outbreak; Infection, (1986) 14: 156-158. 5. Gerlich et al: Detection of IgM Antibody against Core Antigen of Hepatitis B Virus by a Modified Enzyme Immunoassay, J Med Virol 4: 227-238 (1979). 6. Summers M et al. Luminogenic Reagent Using 3-Chloro 4-HydroxyAcetanilide to Enhance Peroxidase/Luminol Chemiluminscence, Clin Chem 41: 573 (1995). 7. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved quideline. NCCLS Document M29-A (ISBN 1-56238-339-6). NCCLS, Wayne, PA 19087; 1997. 8. Calam RR. Specimen Processing Separator Gels: An Update, J Clin Immunoassay 11: 86-90 (1988). 9. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference, J Clin Immunoassay 15: 108-115 (1992). 10. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices - Second Edition. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-T2. (1992). Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM1230_IT Versione 1.0

ISTRUZIONI PER L USO Revisioni HAV M Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* 2005-09-16 1.0 Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1230/106.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 1.0 Pubb. n. GEM1230_IT 7

HAV M ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. CHIRON Corporation Emeryville, CA 94608-2916 Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson 50-100 Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., 2005. 8 Pubb. n. GEM1230_IT Versione 1.0