IFOM Fondazione Istituto FIRC di Oncologia Molecolare Ufficio Scolastico Regionale per la Lombardia Agenzia Nazionale per lo Sviluppo dall Autonomia Scolastica Ex IRRE Lombardia LO STUDENTE RICERCATORE Anno 2009 Progetto di integrazione tra ricerca e scuola Due settimane in laboratorio RELAZIONE FINALE SCIENTIFICA DELLO STUDENTE (rapporto di ricerca) A cura degli studenti ricercatori Nome e cognome dello studente: Lucrezia Bertino Periodo trascorso presso il Campus IFOM-IEO: 20/07/09-3/07/09 Gruppo di lavoro: Giuliana Pellicci Nome tutor: Daniela Osti Se lo studente lo desidera o lo ritiene opportuno (ad esempio nel caso di lavoro di stage svolto all estero), la presente relazione può essere redatta in lingua inglese.
Relazione finale scientifica2. Titolo dell attività svolta: LA FUNZIONE DELLA PROTEINA RAI NELLA MIGRAZIONE DELLE CELLULE STAMINALI NEURONALI MURINE (mnscs) 2. Sommario dell attività svolta (Abstract): Dagli anni novanta la comunità scientifica sta svolgendo studi riguardo le cellule staminali neuronali (NSCs). Uno fra i tanti campi di ricerca è quello che riguarda la correlazione tra le cellule staminali neuronali e i tumori al cervello. E stato, infatti, dimostrato che le cellule tumorali derivano dalla trasformazione di normali cellule staminali normali. Il lavoro descritto ha per oggetto lo studio del ruolo della proteina adattatrice Rai in cellule staminali neuronali isolate da topi di ceppo C57BL/6J. Dati preliminari del laboratorio indicano che Rai regola la migrazione delle cellule staminali neuronali. Nella relazione verrà, quindi, mostrato un saggio di migrazione, eseguito per verificare la capacità di migrare delle NSCs ottenute da topi WT e KO per Rai. Per verificare che il difetto di migrazione, osservato in cellule KO per Rai, sia effettivamente dovuto alla mancanza di questa proteina, le cellule KO sono state infettate con il c-dna codificante, in modo tale da esprimere Rai. L avvenuta infezione e stata confermata per western blot. 2 Lo schema qui proposto è nel formato convenzionale di un articolo di ricerca scientifica. Tale schema ha ovviamente senso solo nell ipotesi che lo studente abbia compiuto, durante la propria permanenza nei laboratori del campus IFOM-IEO, un percorso di ricerca omogeneo, nel quale le singole attività fossero integrate e rivolte a un obiettivo finale generale. Qualora invece lo studente, per le necessità e la struttura del gruppo di lavoro nel quale era inserito, avesse svolto attività diversificate e non riconducibili a un unico obiettivo, si consiglia di stendere un diario di lavoro con la descrizione delle singole attività svolte. 2
3. Descrizione dettagliata dell attività svolta 3. Premessa: Le cellule staminali neuronali (NSCs) sono cellule non differenziate che sono presenti sia durante lo sviluppo embrionale che nell adulto in due specifiche regioni del sistema nervoso centrale la zona sottoventricolare e il giro dentato dell ippocampo -. Possiedono la caratteristica di autorinnovarsi e di differenziarsi in neuroni, astrociti, oligodendrociti (fig.). Fig. Le NSCs possono dare origine a altre cellule staminali neuronali oppure possono differenziarsi e dare origine a neuroni, astrociti o oligodendrociti. Il gruppo di ricerca con cui ho lavorato ha in corso varie ricerche sulle NSCs, sia normali isolate dal topo che umane derivate da campioni tumorali, e in particolare si occupa dello studio di una proteina neuronale espressa in queste cellule. La proteina Rai (chiamata anche ShcC) appartiene alla famiglia Shc, proteine adattatrici citoplasmatiche coinvolte nella trasmissione del segnale. Rai ha due isoforme, p52 e p64, che differisce da p52 per il dominio CH2 (fig.2). Le differenze funzionali tra le due isoforme non sono al momento note. CH2 PTB CH SH2 PTB CH SH2 R A I 3 p64 p52
Fig.2 Le due isoforme di Rai sono costituite entrambe dai domini PTB, CH, SH2, mentre Rai p64 contiene anche il dominio CH2. Nei neuroni adulti Rai stimola la sopravvivenza in condizione fisiologiche in risposta a stimolazione con il fattore di crescita GDNF o in conseguenza di uno stress (stress ossidativi o ipossico) (fig.3). Nelle cellule staminali neuronali Rai, secondo le recenti scoperte, avrebbe un ruolo nella regolazione della migrazione. Non è ancora noto se abbia un ruolo nella sopravvivenza delle NSCs. Fig.3 Rai nei neuroni adulti ha funzione di sopravvivenza e può essere attivata sia dal recettore Ret sia da uno stress ossidativo. Anche nei topi ha una funzione protettiva a seguito di danno da ischemia. Di seguito si fornisce una descrizione del comportamento delle cellule staminali wildtype(wt) e knock-out (KO) per Rai, compreso il loro mantenimento in vitro (fig.4). 4
Rai -/- WT Fig.4 Si possono vedere neurosfere di cellule WT e KO ad uno stadio in cui non si notano differenze tra i due tipi. 3.2 Risultati e discussione (allegare eventuali figure, grafici e tabelle, chiaramente numerati e corredati di didascalie): Isolamento, coltura e propagazione delle cellule staminali neuronali murine Per comprendere il ruolo della proteina Rai in cellule staminali neuronali adulte, cellule WT e KO per Rai sono state isolate rispettivamente da topi WT e KO di ceppo C57BL/6J. Per proliferare le cellule staminali hanno bisogno di un terreno di coltura apposito, privo di siero e contenente fattori di crescita EGF e FGF-2. Le cellule sono seminate a una densità bassa (5 04 cellule/cm2); man mano che le cellule proliferano formano degli agglomerati sferici sospesi nel terreno che prendono il nome di neurosfere (fig.5). Queste ultime sono costituite in parte di cellule staminali (0%-50%) e in parte da cellule morte e da progenitori (fig.6). A B C Fig.5 Si può vedere una cellula singola (A) che a poco a poco cresce(b) fino a diventare una neurosfera (C) dopo 4-5 giorni. 5
Fig.6 Le neurosfere sono costituite da NSCs (rosse), da cellule sul punto di morire (gialle) e da cellule differenziate (verdi). Ogni passaggio di coltura permette di eliminare le cellule verdi e gialle. Rimangono solo le NSCs che sono in grado ogni volta di ricreare una nuova neurosfera. Dopo 4-5 giorni le neurosfere raggiungono la dimensione ottimale per essere dissociate e ripiastrate. Se piastrate prima quando sono ancora piccole la resa in numero di cellule sarà molto bassa. Al contrario, se le neurosfere sono troppo grosse il numero di cellule morte sarà più elevato rispetto a quello delle cellule staminali vive e di conseguenza,anche in questo caso, la resa sarà bassa. Questo procedimento può essere ripetuto più volte. Crioconservazione delle cellule Dopo aver ottenuto un numero sufficiente di cellule queste possono essere conservate criopreservandole. Tale operazione è utile nel caso in cui si vogliano compiere esperimenti futuri sulle cellule. Inoltre, la crioconservazione, anche se ripetuta più volte, non altera le proprietà delle cellule. E importante però non dissociare le neurosfere prima di congelarle: aumenterebbe il numero di cellule morte. 6
Saggio di migrazione delle cellule Una delle principali caratteristiche delle cellule staminali neuronali e la capacità migratoria, importante processo che permette il corretto posizionamento delle nuove cellule nel cervello. Dati precedenti del laboratorio hanno dimostrato che Rai regola la migrazione delle cellule staminali neuronali. Nello specifico, mnscs WT migrano di più rispetto alle cellule KO per Rai. L esperimento può avvenire in due modi: attraverso il wound healing, in cui si crea una ferita su un monostrato di cellule valutando la loro capacità di riempire la ferita attraverso la boyden chamber, in cui viene valutata la capacità dei progenitori di migrare da un terreno senza fattori di crescita a uno che li contiene, attraverso una membrana (fig.7). Alla fine del saggio il colorante crystalviolet mette in rilievo le cellule che hanno attraversato la membrana. Boyden chamber assay Cells in serum-free basal medium without growth factors chemoattractant Scrape off unmigrated cells migration fix and stain t nei dar g sr ot c af ht wor g Matrigel coating A B Fig.7 A) struttura di una celletta B) migrazione delle cellule dalla parte superiore della membrana alla parte inferiore. Dopo 48 ore dalla semina ho valutato la capacita di migrazione delle cellule WT e KO, ma il saggio realizzato (fig.8) ha mostrato che ogni singola transwell è diversa da tutte le altre. Questo fatto compromette l esperimento perché non è riproducibile. Inoltre, il risultato non è chiaro perché non si capisce se migrino di più le cellule WT o le KO. Ciò che invece si dovrebbe vedere a conclusione del saggio è mostrato in fig.9. WT KO 7
Fig.8 Saggio di migrazione mediante Boyden Chamber 0/FGF+EGF WT Fig.9 Risultato che dimostra quanto è stato studiato. Le cellule WT (sopra) migrano di più delle KO (sotto) KO Infezione di mnscs WT e Rai KO Per dimostrare che la ridotta capacita di migrazione osservata nelle cellule Rai KO dipende esclusivamente dalla mancanza di Rai, mnscs KO sono state infettate con virus recante il c-dna codificante l isoforma p64 di Rai. mnscs WT e KO sono state infettate con un virus vuoto come controllo negativo dell infezione. I virus sono stati prodotti da cellule ingegnerizzate di nome Finix anfotropiche. Al termine dell infezione sono state ottenuti 4 gruppi di cellule: WT infettate con virus non codificante (WT ) WT infettate con virus codificante (WT p 64) KO infettate con virus codificante (KO p 64 ) KO non infettate con virus non codificante ( KO ) Controllo dell espresione di Raiin mnscs infettate Per controllare l avvenuta infezione, le cellule sono state raccolte a pochi passaggi dall infezione, sono state lisate e i lisati sono stati analizzati per western blot. Il western blot è una tecnica che permette di verificare la presenza di una determinata proteina nelle cellule. Il western eseguito è stato, perciò, effettuato per verificare la presenza di Rai nelle cellule. Inoltre, è stata verificata la presenza della vinculina, proteina presente sia in WT che in KO. Il suo valore serve per normalizzare il valore che si ottiene di Rai. Alla fine del saggio le cellule sono risultate essere infettate (fig.0-). A seguito di questo western blot si potrà effettuare un altro saggio di migrazione con KO esprimenti Rai e WT per verificare che realmente Rai sia rilevante per la migrazione delle cellule. 8
Fig.0 Risultato del western blot La prima linea di bande è quella della vinculina. Il loro spessore deve essere uguale per tutte le colonne del western blot per indicare che e stata caricata la sessa quantita di proteina. Le altre due linee di bande sono quelle di Rai p64 e Rai p52. Rai è presente in tutte le cellule tranne nelle KO. La dimensione delle bande indica la quantità delle proteine contenute nel campione. Normalizzazione RAI 60000 50000 40000 30000 RAI 20000 0000 20 p 0p 64 2 ko ko _Ø p2 0_ p p t_ p6 4_ 20 w Ø t_ w 64 ko Ø 2p 2 p p ko _ p p6 4_ t_ w w t_ Ø p 0 Fig. Le bande della proteina Rai sono state normalizzate secondo le bande della proteina vinculina. Dopo la normalizzazione risulta che KO è overesprimente rispetto la rai nelle WT. 3.3 Conclusioni: i risultati ottenuti dimostrano che le cellule WT e KO sono state efficacemente infettate. Saranno, quindi, il punto di partenza per i successivi studi per dimostrar se l espressione di Rai in cellule KO permette il recupero del fenotipo WT. 9
Continuare a compiere ricerche sulla proteina Rai potrebbe portare a interessanti scoperte per applicazioni farmacologiche per combattere la capacita invasiva dei tumori cerebrali. 4 Materiali e metodi Coltura delle cellule staminali neuronali murine Dopo 4-5 giorni dal piastramento, le neurosfere devono essererecuperate,dissociate e ripiastrate. Si aspira il terreno contenuto nella fiasca (T25) e lo si raccoglie in una falcon da 5 ml. Si centrifuga a 400 rpm per 0 minuti. Si aspira il surnatante lasciandone nella falcon circa 500 µl e si dissocia meccanicamente il pellet (circa 50 pipettate) fino a ottenere una sospensione omogenea di cellule singole. A questo punto si procede alla conta vitale delle cellule. A 5µL di sospensione cellulare si giungono 95 µl di Trypan Blue ottenendo una soluzione a diluizione :20. Il Trypan blue ha la caratteristica di penetrare attraverso la membrana delle cellule morte permettendo di vedere al microscopio solo le cellule vive. Si immette per capillarità la miscela in una camera di Burker (composta da 9 riquadri) e si contano le cellule in almeno 3 riquadri. Si applica, quindi, la formula per ottenere il numero di cellule/ml: N totale cell.3 riquadri/3 x fattore di diluizione (20) x 0 4 (fattore di correzione camera di Burker) Noto il numero di cellule, si calcola quanti µl di sospensione bisogna mettere in una nuova fiasca T25 per avere la concentrazione desiderata. Prima della sospensione nella fiasca va messo il terreno (4 ml per T25). Le cellule vengono cosi mantenute in incubazione a 37 C in atmosfera umidificata al 5% di CO2. Saggio di migrazione Recuperare mnscs WT in una falcon da 5mL. Centrifugare per 0 minuti a 400 rpm, aspirare il surnatante lasciandone circa 300 µl. Fare lo stesso per le cellule KO. Dissociare, quindi, le neurosfere WT e KO fino a ottenere una sospensione di cellule singole. Contare le cellule sia per controllare di aver dissociato bene le cellule sia per determinare quanti µl di sospensione si devono prelevare per avere 00000 cellule in ogni celletta. Mettere le cellule in una eppendorf e centrifugarle a 3000 rpm per 5 secondi. Aspirare il surnatante e fare un lavaggio con PBS. Infine seminare le cellule nei transwell (6 cellette per WT e 6 per KO). Insieme alle cellule metto 00 µl di terreno privo di fattori di crescita. Dall altro lato della membrana di Matrigel mettere 600 µl di un terreno con fattori di crescita. Dopo 48 ore togliere i due terreni e pulire con un cotonfioc l interno del transwell. Versare il colorante crystalviolet nei pozzetti e incubare per 0 minuti. Quindi risciacquare i transwell e osservare la membrana (più il colore viola è intenso più le cellule sono migrate). Transfezione per calcio fosfato Aliquotare in una provetta eppendorf 5 µg di DNA plasmidico codificante per l isoforma p64 di Rai, e aggiungere 50 µl di CaCl2 e H2O fino a un volume finale di 500 µl. Gocciolare la sospensione in 500 µl di HBSS 2X e incubare 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, gocciolare la soluzione sulle cellule Finix anfotropiche (ml per ogni piastra da 0 cm di diametro). Dopo 48 ore dalla transfezione il virus è impacchettato dalle cellule. Western blot 0
Raccogliere del pellet di cellule e conservarle a -80 C. Preparare il lysis buffer e metterne 20 µl per pellet, lasciando il tutto a 4 C per 5 minuti. Quindi, centrifugare le eppendorf a 3000 rpm per 30 minuti e eliminare il pellet formatosi. Preparare 2ml di Biorad 5X in 8ml di H20 per la quantificazione delle proteine. Quantifico allo spettrometro le cuvette contenenti 698 µl di Biorad e 700µL di soluzione contenente le proteine. Preparare, quindi, i campioni mettendo X µl di campione (20µg di proteina), 4 µl di laemmli 5X e (6-X) µl di H2O. preparare 0 ml separating gel, mettere dell isopropanolo per livellare e poi, dopo averlo tolto, versare 5mL di stacking gel. Intanto preparare il running buffer(900ml di H 2O e 00 ml di buffer) e fare bollire le eppendorf per 5 minuti a 95 C e centrifugarli. Caricare i pozzetti del gel con i campioni e il marker, dopo aver messo il gel nella camera di corsa con il running buffer. Fare correre a 00V per h. Togliere il gel dalla camera di corsa e procedere con il trasferimento sulla membrana di nitrocellulosa (spugna-carta assorbente-gel-carta assorbente-spuga). Mettere il tutto nella cameretta per l elettro-blotting per h a 00V con il transfer buffer. Estrarre la membrana e colorarla con ponceau. Tagliare poi la membrana e fare un blocking per h in milk per bloccare i siti non specifici. togliere il latte e incubare overnight con il primo anticorpo a 4 C. il giorno seguente togliere l anticorpo e fare due lavaggi con TBST di 5minuti. Mettere il secondo anticorpo antimouse e fare un blocking per h. Togliere l anticorpo e fare 3 lavaggi con TBST di 0 minuti. Incubare la membrana con una soluzione chemioluminescente e sviluppare la membrana in camera oscura. 5 Eventuale bibliografia Coltures of Stem Cells of Central Nervuos Sistem. Gritti A., Galli R., Vescovi A.L. Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed. 6 Elenco degli allegati3 alle presente relazione: Data: 3 luglio 2009 3 Oltre a figure, grafici e tabelle di cui alla sezione 3.2, è possibile allegare qualsiasi altro tipo di materiale esplicativo dell attività svolta (presentazioni power point, pagine html, ecc.).