La proporzione tra cellule e plasma è regolata affinché rimanga relativamente COSTANTE

METODI EMATOLOGICI

EMATOLOGIA: studio del sangue e dei tessuti emopoietici SANGUE: insieme di cellule sospese in un liquido detto PLASMA, composto da sali minerali ed organici; in un uomo adulto costituisce circa 1/12 del peso corporeo e corrisponde a 5-6 litri. ERITROCITI (globuli rossi) CELLULE: LEUCOCITI (globuli bianchi) TROMBOCITI (piastrine) ~45 %, chiamate anche elementi figurati. SIERO: plasma privo di fibrinogeno COAGULO: aggregazione del fibrinogeno ~55 % La proporzione tra cellule e plasma è regolata affinché rimanga relativamente COSTANTE

Globuli rossi: contenendo EMOGLOBINA, trasportano OSSIGENO a tutti i tessuti Globuli bianchi: responsabili delle difese dell organismo Piastrine: impediscono perdite di sangue dovute ad emorragie Proteine del plasma: trasporto di nutrienti o di metaboliti destinati all escrezione EMATOCRITO (HCT): misura dell altezza del sedimento eritrocitario, rapportata a quella dell intero campione di sangue (porzione % dei globuli rossi, packed cell volume,pcv)

Il compito del laboratorio è quello di valutare la normalità o l anormalità dei vari componenti del sangue e di caratterizzare la natura di eventuali alterazioni: a tale scopo si usano esami QUANTITATIVI (conteggio e dimensionamento) o QUALITATIVI (morfometria, citochimica, citofluorimetria ecc.)

EMOPOIESI Formazione e maturazione di TUTTI I TIPI DI CELLULE del sangue a partire dai precursori ADULTO: le cellule si formano nell interstizio extravascolare del midollo osseo, sede delle cellule staminali totipotenti L emopoiesi è controllata da regolazioni di contatto CELLULA-CELLULA, da una regolazione UMORALE (fattori di crescita glicoproteici) e da particolari esigenze dell organismo

Indagini QUANTITATIVE e QUALITATIVE sulle cellule del sangue periferico: L EMOGRAMMA Più noto come ESAME EMOCROMOCITOMETRICO con FORMULA LEUCOCITARIA Serie di valutazioni degli elementi del sangue periferico: conta e dimensionamento dei globuli rossi e delle piastrine, valore dell ematocrito, determinazione della concentrazione di emoglobina e conta differenziale dei leucociti del sangue periferico. Inoltre vengono presi in considerazione altri parametri, come le concentrazioni sieriche di ferro, ferritina, transferrina e del recettore solubile della transferrina.

Conta dei globuli rossi Conta globuli bianchi ERITROPOIESI LEUCOCITOPOIESI Conta delle piastrine MEGACARIOCITOPOIESI

ERITROPOIESI La produzione di eritrociti, che trasportano ossigeno ai tessuti, è regolata dal livello di ossigenazione dei tessuti Valutazione di laboratorio dell eritropoiesi: Citologia midollare Conteggio dei Reticolociti Determinazione dell Eritropoietina

Citologia midollare PROERITROBLASTO ERITROBLASTO BASOFILO (2A) ERITROBLASTO POLICROMATOFILO (2B, 3E) ERITROBLASTO ORTOCROMATICO (2C,3F) RETICOLOCITA ERITROCITA MATURO

CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI Comunemente utilizzato come misura della produzione eritroide. Negli adulti e nei bambini, il normale valore dei reticolociti, globuli rossi giovani, ancora immaturi, in percentuale è da 0,5% a 2,5% dei globuli rossi circolanti totali, nei neonati è dal 2% al 6%. Il valore assoluto è tra 25.000 e 80.000 per mm 3. L'interpretazione di questo valore deve tenere conto anche di altri fattori; per esempio: se la concentrazione di emoglobina è normale, un numero di reticolociti pari a 0,5-2,5% indica una normale attività midollare; invece, un conteggio elevato di reticolociti (reticolocitosi) indica che sono stati perduti o distrutti globuli rossi, ma che il midollo ha compensato aumentandone la produzione; se, invece, la concentrazione di emoglobina è bassa ed i reticolociti sono normali inadeguata risposta all'anemia.

Nelle malattie ematologiche il conteggio reticolocitario assoluto rappresenta un indicatore dell'eritropoiesi efficace, mentre la percentuale di reticolociti ad alta fluorescenza (> RNA ribosomiale) esprime in modo più diretto l'intensità della stimolazione eritropoietinica. Il numero dei reticolociti nel sangue periferico, valutato mediante esame al microscopio dopo colorazione cellulare, è stato considerato, per il passato, nell'epoca precedente all'automazione, come uno dei mezzi diagnostici più semplici ed economici per l'iniziale classificazione delle anemie (analisi semi-quantitativa). Il conteggio dei reticolociti, effettuato con gli attuali metodi automatizzati (citometria a flusso e deviazione della luce laser da parte dei filamenti di RNA) è più rapido e meno soggetto alle cause di imprecisione e di inaccuratezza legate ai fattori umani di soggettività e a quelli statistici riguardanti il numero di cellule analizzate. La determinazione quantitativa dell'intensità di fluorescenza ha ormai acquisito di diritto la valenza di nuovo parametro dell'ematologia di laboratorio, che arricchisce e completa il valore diagnostico del conteggio reticolocitario.

ERITROPOIETINA Ormone glicoproteico prodotto dalle cellule interstiziali peritubulari renali che STIMOLA la velocità di crescita e di maturazione dei precursori eritroidi. Dosata con RIA o ELISA Livelli Epo nel sangue: 10-30 mui/ml La concentrazione di Epo plasmatica consente una valutazione del grado di eritropoiesi

Aumentano i livelli di Epo in casi di IPOSSIA TISSUTALE (dovuta a diminuita concentrazione di Hb o alterato scambio di ossigeno a livello respiratorio o a diminuzione flusso sanguigno ecc), con funzionalità renale adeguata,. In presenza di una eritropoiesi efficace e di un adeguato apporto al midollo di ferro, acido folico e vitamina B 12, l Epo accelera quasi tutti gli stadi di produzione di eritrociti, causando un aumento di velocità di divisione cellulare, di incorporazione di Fe nel precursore eritroide e favorendo l entrata in circolo di globuli rossi giovani (Reticolociti). L intervento dell ormone si può evidenziare in laboratorio con il conteggio dei reticolociti, visto in precedenza.

Significato clinico del dosaggio di Epo: La sua concentrazione cresce in maniera direttamente proporzionale all ematocrito Consente di riconoscere forme di anemia nelle quali non vi è un adeguata risposta dell Epo all ipossia tissutale Conoscere i livelli Epo può consentire di differenziare una policitemia primaria da una eritrocitosi secondaria

ERITRONE: insieme dei precursori della serie rossa e degli eritrociti maturi, regolato dai livelli di Epo e di pressione di O 2 FUNZIONE: favorire lo scambio di gas respiratori, O 2 e CO 2, tra cuore, polmoni e tessuti

METABOLISMO DEI GLOBULI ROSSI In assenza di mitocondri, è assai scarsa la capacità di metabolizzare acidi grassi e aminoacidi. L energia è generata pressoché esclusivamente attraverso la degradazione del glucosio. La via non-ossidativa o anaerobica (ciclo di Embden-Meyerhof) è responsabile dell utilizzo di circa il 90% del glucosio cellulare. Nella conversione del glucosio a lattato, il guadagno netto di molecole di ATP fornisce i fosfati ad alta energia, necessari per il mantenimento della forma e della flessibilità cellulare, per preservare i lipidi di membrana e per rifornire di energia le pompe metaboliche che controllano gli scambi di sodio, potassio e calcio. Quando l ATP è deficitario a causa dei difetti acquisiti o ereditari della glicolisi, la sopravvivenza della cellula è drasticamente ridotta e ne consegue un anemia emolitica.

Il ciclo di Embden-Meyerhof ha un ruolo essenziale nel mantenere i piridinnucleotidi in forma ridotta per provvedere alla riduzione della metaemoglobina (via della emoglobina-reduttasi), e nella sintesi del 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) (ciclo di Rapaport-Luebering). Il significato del 2,3-DPG sta nella sua capacità di modulare la liberazione dell ossigeno a seconda delle esigenze dei tessuti. Questa risposta è attivata da una variazione della proporzione di ossigeno estratta dai tessuti; ogni volta che il sangue venoso contiene un aumentata produzione di emoglobina deossigenata, la glicolisi viene stimolata ad una maggiore produzione di DPG. Ciò diminuisce l affinità dell emoglobina per l ossigeno consentendo una maggiore liberazione di questo per una data tensione di ossigeno nei tessuti.

Altra via metabolica è lo shunt degli esoso-monofosfati (via del fosfogluconato). Questo sistema energetico accoppia il metabolismo ossidativo con la riduzione del piridin-nucleotide e del glutatione, proteggendo il globulo rosso da ossidanti ambientali. Quando questa via metabolica è funzionalmente deficitaria o quando ossidanti ambientali ne eccedono la capacità riducente, si verifica una denaturazione della globina e l emoglobina forma un precipitato noto come Corpi di Heinz lungo la superficie interna della membrana eritrocitaria. Questa forma di distruzione ossidativa del globulo rosso si verifica solitamente nei pazienti con deficienza della glucosio-6-fosfato-deidrogenasi legata al cromosoma X, l enzima principale della via metabolica del fosfogluconato.

Riassunto.. VIA DEL FOSFOGLUCONATO

Eritrociti devono contenere il pigmento che lega l ossigeno... EME Molecola di porfirina che coordina uno ione ferroso Fe(II), posto leggermente al di fuori del piano della molecola: L'eme costituisce il gruppo prostetico, cioè la parte non proteica, di una serie di proteine tra cui l emoglobina, la mioglobina e i citocromi

La sintesi dell EME ha luogo nel mitocondrio e nel citoplasma della cellula Gli organi preposti alla sintesi dell'eme sono il midollo osseo e il fegato. Gli eritrociti maturi non lo producono, in quanto non sono più cellule vitali (sono prive di nucleo); l'eme viene, invece, sintetizzato dai loro precursori, a livello soprattutto del midollo osseo. Il ferro centrale lega l ossigeno solo nello stato di ossidazione +2 (ferroso)

PATHWAY DI BIOSINTESI DELL EME

4 gruppi EME sono contenuti all interno di 4 globuli proteici, detti GLOBINA. Quindi, l'emoglobina è una proteina globulare di struttura quaternaria, solubile, di colore rosso, presente nei globuli rossi del sangue dei vertebrati, responsabile del trasporto dell ossigeno molecolare da un compartimento ad alta concentrazione di O 2 ai tessuti che ne hanno bisogno.

L'emoglobina (che si indica con il simbolo Hb o Hgb), viene sintetizzata inizialmente a livello dei proeritroblasti policromatofili (precursori dei globuli rossi), rimanendo poi in alte concentrazioni all'interno dell eritrocita maturo. Quando si lega all'ossigeno viene chiamata ossiemoglobina, nella forma non legata deossiemoglobina. Le alterazioni di origine genetica della struttura primaria della molecola, che ne alterano la funzione, o della sua espressione che alterano la quantità in circolo, vanno sotto il nome di emoglobinopatie

SENESCENZA DEGLI ERITROCITI E CATABOLISMO DELL EMOGLOBINA Vita media di un eritrocita maturo: 120 giorni. Emocateresi: rimozione di tutti gli elementi figurati del sangue, in particolare degli eritrociti vecchi dal circolo sanguigno, ad opera di macrofagi della milza, del fegato e del midollo osseo. Durante l invecchiamento, progressivo decadimento metabolico lisi osmotica; Nel SRE eliminato 1% dei GR al giorno, rimpiazzato dai reticolociti provenienti dal midollo; catabolizzati 5-7 g emoglobina/giorno. L emoglobina liberata per emocateresi subisce una serie di trasformazioni cataboliche, al termine delle quali si ottiene un pigmento con alta affinità per l elastina dei tessuti: la BILIRUBINA. Dal catabolismo dell emoglobina deriva il 95% di FERRO riciclato (fabbisogno giornaliero: 20-25 mg).

LISI EXTRAVASCOLARE

Soltanto 5-10% GR viene distrutto ALL INTERNO del sistema vascolare (emolisi intravascolare); L Hb in circolo si dissocia nei dimeri α e β e si lega all aptoglobina (un α 2 - globulina) per essere trasportata al fegato, dove è metabolizzata ed il ferro viene recuperato e riciclato; Quando la capacità di legame dell aptoglobina è superata, Hb libera compare nel plasma (emoglobinemia) e nelle urine (emoglobinuria); Altri parametri per l emolisi intravascolare sono LDH e bilirubina indiretta (non coniugata). LISI INTRAVASCOLARE

Conta e dimensionamento dei globuli rossi Per svolgere la loro funzione, devono mantenere: Forma a disco biconcavo Ambiente interno costante, per mantenere l emoglobina in forma ridotta Elasticità necessario mantenere un complesso equilibrio tra i meccanismi preposti alla sintesi dell emoglobina e quelli preposti alla maturazione dell eritrocita difetti in qualsiasi punto di tali processi compromettono l apporto di ossigeno ai tessuti Determinazioni QUANTITATIVE: capacità di trasportare ossigeno Determinazioni QUALITATIVE: la valutazione dell aspetto morfologico può evidenziare difetti di membrana

Parametri valutabili (esame emocromocitometrico): 1. Quantità di emoglobina (Hb) 2. Ematocrito (rapporto tra volume complessivo GR e volume totale di sangue) 3. Numero assoluto di eritrociti nel sangue (RBC) 4. Indici corpuscolari o eritrocitari 1. Quantità di emoglobina Il metodo principale per la determinazione dell emoglobina (Hb) è basato, anche nei contatori elettronici, su misure spettrofotometriche (picco di assorbimento a 540 nm) effettuate sull emolisato. Nei counters elettronici si sfruttano anche fenomeni di riflessione, trasmissione, rifrazione e scattering (luce dispersa): l indice di rifrazione dipende essenzialmente dalla concentrazione corpuscolare di emoglobina.

Il valore centrale della distribuzione degli indici di rifrazione rappresenta la CONCENTRAZIONE CORPUSCOLARE MEDIA DI EMOGLOBINA (MCHC). L ampiezza della distribuzione (σ)delle concentrazioni di Hb rapportata al valore della media (MCHC) dà luogo ad un indice eritrocitario noto come ANISOCROMIA (hemoglobin distribution width, HDW). Se aumenta il numero di eritrociti con valore basso di emoglobina corpuscolare (ipocromici), la base dell istogramma si sposta a sx; sono, invece, rare le situazioni di aumento di Hb corpuscolare (sferocitosi ereditaria o acquisita) ed in tali casi l istogramma si sposta verso dx. Valori normali Hb: UOMINI: 13,5-18 g/dl DONNE: 12-16 g/dl

2. Ematocrito L altezza del sedimento eritrocitario, ottenuto dopo centrifugazione, rapportata a quella dell intero campione di sangue, fornisce la percentuale di GR nel sangue (metodo diretto); Tuttavia, di norma viene calcolato nei moderni contaglobuli automatizzati, indirettamente come: M CV(fl)x RBC(x 10 Ht(%) 1000 RBC (red blood cells): numero di GR MCV (mean corpuscolar volume): volume corpuscolare medio dei GR 12 /l) Valori anomali dell ematocrito possono ritrovarsi in condizioni di policitemia, macrocitosi, sferocitosi, anemie ipocromiche, alterazioni morfologiche degli eritrociti.

Valori normali Ht: UOMINI: 40-54 % DONNE: 38-47 % 3. Numero assoluto di eritrociti nel sangue (RBC) Può essere valutato con metodi diretti (microscopia ottica, con camere di conta) o con metodi indiretti, tramite contatori elettronici (counters)

4. Indici corpuscolari o eritrocitari (ampiamente utilizzati nelle classificazioni dielle anemie) MCV (mean cellular volume): rappresenta il volume cellulare medio di un globulo rosso; si considera l insieme di valori (insieme di volumi) di luce scatterata (dispersa) nei contaglobuli automatizzati e si calcola il valore medio (MCV). L intervallo di riferimento è: 80-100 fl (femtolitri). Rispetto al volume, il GR può essere definito NORMOCITA se ha MCV normale, MICROCITA con valore di MCV più basso del normale e MACROCITA con valore di MCV più alto del normale. Nella MICROCITOSI, la quota di microciti totali aumenta tanto da rappresentare la maggioranza degli eritrociti; nella MACROCITOSI accade il contrario. Il rapporto tra il grado di dispersione dei volumi (σ), che corrisponde all ampiezza della base dell istogramma, ed il valore medio (MCV) consente di calcolare l INDICE DI ANISOCITOSI, RDW (red cell distribution width), il cui valore esprime il grado di eterogeneità dei volumi dei GR. L intervallo di riferimento è: 11,6-14,6 %. Un valore più alto, che indica elevata eterogeneità, è caratteristico di anemie, talassemie, emoglobinopatie.

Ampiezza MCV RDW = Ampiezza/MCV MCH (mean corpuscolar hemoglobin): espresso in picogrammi, è il rapporto tra il valore della concentrazione di emoglobina ed il numero di globuli rossi per mm 3. L intervallo di riferimento è: 26-32 pg (emazie NORMOCROMICHE). Valori inferiori a 26 pg indicano IPOCROMIA delle emazie, valori superiori a 32 pg indicano IPERCROMIA delle emazie. MCHC (mean corpuscolar hemoglobin concentration): espresso in percentuale, è il rapporto tra il valore della concentrazione di emoglobina e l ematocrito L intervallo di riferimento è: 32-36 %.

Volume corpuscolare medio (MCV) Interpretazione indici eritrocitari Macrocitica ipocromica Macrocitica normocromica Macrocitica ipercromica Normocitica ipocromica Normocitica normocromica Normocitica ipercromica Microcitica ipocromica Microcitica normocromica Microcitica ipercromica Concentrazione emoglobinica corpuscolare media (MCHC)

Striscio di sangue periferico Usato sangue capillare o sangue venoso appena prelevato (event. trattato con EDTA, che consente per alcune ore una buona conservazione degli elementi figurati). Si deposita sul vetrino una piccola goccia di sangue vicino all estremità destra, vi si appoggia sopra il margine del vetrino molato (a formare un angolo di circa 30 ); si fa scorrere il vetrino inclinato verso sinistra. Il movimento di scorrimento deve essere piuttosto rapido ed uniforme. Si fa asciugare lo striscio all aria per circa 30, ma senza farlo essiccare, e si effettua la colorazione di May Grunwald-Giemsa, che, oltre a colorare, serve per fissare lo striscio. La soluzione di May Grunwald è una soluzione metilica di blu di metilene (basico) ed eosina (acido); la soluzione di Giemsa è una soluzione glicero-metilica di Azur II ed eosina a ph 7. La colorazione avviene aggiungendo per 3 il reattivo di May-Grunwald, facendo cadere sul vetrino tante gocce di colorante finché sarà coperto completamente. Si aggiunge acqua distillata direttamente sul liquido colorante e si lascia agire per 1. Si lava abbondantemente con acqua distillata. Colorare con reattivo di Giemsa (diluito 1:3 con acqua tamponata) per 15, lavare con acqua.

1. Raccolta del campione 2. Preparazione del vetrino 3. Fissaggio con May-Grunwald 4. Colorazione con Giemsa (blu di metilene ed eosina) 5. Montaggio e osservazione

A fine colorazione: gli eritrociti (GR) appariranno in rosa intenso; il nucleo dei leucociti (GB) dovrà apparire in violetto intenso; i granuli dei granulociti neutrofili in rosa pallido; quelli dei gran. eosinofili in rosa intenso; quelli dei gran. basofili in bleu. A-D : Leucociti Neutrofili B-E : Leucociti Eosinofili C : Leucocita Basofilo G-H-I : Linfociti J-K-L : Monociti F : Plasma Cellula

Esame morfologico dei GR In uno striscio ben eseguito, i globuli rossi si presentano disposti gli uni accanto agli altri e appaiono come dischi biconcavi (schiacciati al centro). Esaminando i GR in uno striscio di sangue si terranno presenti i seguenti caratteri : dimensioni, forma e colore. Dimensioni: il valore normale è 7,2-7,8 μm Se il valore > 7,8 μm : macrociti; se il valore < 7,2 μm : microciti Se in uno striscio prevalgono i microciti o i macrociti, si parla rispettivamente di microcitosi o macrocitosi L insieme di GR con dimensioni diverse prende il nome di anisocitosi. Normali Macrocitosi Microcitosi

Forma: i globuli rossi devono essere tondeggianti. In molte forme di anemia, accanto a GR a contorni tondeggianti, se ne trovano altri con forme irregolari (ovoidali, a pera, a falce, sferica, frammenti globulari, ecc.). Questi GR presentanti forme irregolari vengono indicati col termine di poichilociti e la loro presenza in uno striscio viene indicata col termine di poichilocitosi. Ovalociti GR a forma di falce Sferocitosi

Colore: i globuli rossi appaiono di un colore roseo-grigiastro; normalmente presentano una colorazione più intensa alla periferia, mentre nella parte centrale appaiono meno colorati. Quelli colorati più intensamente del normale vengono indicati col termine di ipercromici: questi presentano spesso una colorazione uniforme e in essi non è visibile, o è molto meno evidente, l area centrale meno colorata. I GR meno colorati dei normali sono indicati col termine di ipocromici: l area centrale meno colorata è assai più estesa e il globulo rosso appare trasformato in un dischetto chiaro circondato da un sottile alone colorato in rosa. ipercromici ipocromici cellule a bersaglio

Striscio di sangue periferico umano, colorazione May Grunwald-Giemsa. Due granulociti neutrofili (N) ed un linfocita (L). Nei granulociti il nucleo è lobato e il citoplasma presenta abbondantissime granulazioni fini. Il linfocita è caratterizzato dal nucleo tondeggiante, che occupa gran parte della cellula. E anche presente una piastrina.

Striscio di sangue periferico umano, colorazione May Grunwald-Giemsa. Granulocita eosinofilo (E) e linfocita (L). L eosinofilo, o acidofilo, presenta nucleo lobato e citoplasma con abbondantissime granulazioni grossolane colorabili in arancione dall eosina, colorante acido. Il linfocita è caratterizzato dal nucleo tondeggiante, che occupa gran parte della cellula. Si osservano anche piastrine (P) con la porzione centrale violetta ed un alone periferico scarsamente colorato.

Striscio di sangue periferico umano, colorazione May Grunwald-Giemsa. Un granulocita basofilo (B) ed un granulocita neutrofilo (N), rispettivamente il più raro ed il più abbondante dei globuli bianchi. In ambedue le cellule il nucleo è lobato. Il basofilo è ben riconoscibile per i grossi granuli intensamente tingibili e poco numerosi, mentre nel citoplasma del neutrofilo sono presenti abbondantissime granulazioni fini. Nel riquadro grande un linfocita (L) ed alcune piastrine (P).

Velocità di eritrosedimentazione (VES) La VES è un test di laboratorio che misura la velocità di sedimentazione (in mm/h) degli eritrociti nel plasma in cui sono sospesi, o meglio misura la distanza percorsa da un eritrocita in una provetta verticale in un determinato intervallo di tempo; La sedimentazione dei globuli rossi dipende dalla loro capacità di aggregarsi, formando i cosiddetti rouleaux, cioè pile di cellule, che si formano per semplice attrazione delle superfici; V 2 2r 2 ( d1 d 9 ) g In condizioni normali, la capacità di aggregarsi è relativamente bassa perché tra i globuli rossi esistono delle forze di repulsione che li tengono sospesi nel plasma. Se nel sangue aumenta la presenza di globuline o di fibrinogeno (si riducono le forze di repulsione che allontanano i globuli rossi uno dall'altro ed aumenta la viscosità plasmatica), i rouleaux si formano più facilmente e, di conseguenza, la VES aumenta. La formazione degli aggregati dipende dalla forma degli eritrociti e dalla composizione del plasma Importanza diagnostica della misura della VES

Il metodo di determinazione più usato è il Westergren: campione di sangue con sodio citrato (reso, così, incoagulabile) lasciato sedimentare per un ora in una provetta di vetro lunga 20 cm e di piccolo calibro. La misura della VES ha principalmente tre scopi: segnalare la presenza di un processo infiammatorio controllare il decorso o lo stato di attività di una malattia individuare patologie occulte Pur mancando di specificità e di sensibilità, il test è ancora largamente usato perché economico e di facile esecuzione. È inoltre utile come test di primo livello perché la maggior parte dei processi infiammatori acuti e cronici e delle malattie neoplastiche si associano ad un aumento della VES.

LEUCOCITOPOIESI Leucociti: Granulociti (Neutrofili, Eosinofili, Basofili) Linfociti Monociti/Macrofagi I globuli bianchi si differenziano dai globuli rossi per il fatto che possiedono un nucleo. Effettuata la conta assoluta dei GB; il conteggio differenziale (FORMULA LEUCOCITARIA) consente di misurare la percentuale di ogni tipo cellulare presente (non sempre fatto). Per effettuare la conta assoluta usate camere di conta (Burker) o contaglobuli automatizzati; per la conta differenziale il metodo più usato è l esame al microscopio dello striscio di sangue. Intervallo di riferimento GB totali: 4000-11000/μl

Granulociti Costituiscono più della metà dei GB circolanti; I granuli contengono diversi composti chimici ed enzimatici; La maturazione avviene solo nel midollo osseo; una volta liberati in circolo, non possono più riprodursi; Se ne riconoscono di tre tipi (neutrofili, eosinofili e basofili), caratterizzati dalla diversa colorabilità con coloranti acidi e basici; I granulociti sono riscontrabili: nel midollo, come riserva che viene riversata in circolo al bisogno; nel sangue, come cellule circolanti; nei tessuti, dove migrano dal sangue per diapedesi, attirati da fattori chemiotattici rilasciati in caso di infezione. I granulociti una volta usciti dal circolo sanguigno non sono più in grado di rientrarvi, al contrario di quanto accade per i linfociti.

Neutrofili Costituiscono gran parte dei granulociti circolanti (40-75% dei leucociti circolanti); Nelle cellule mature, il nucleo appare segmentato in lobi collegati tra loro da filamenti di cromatina (LEUCOCITI POLIMORFONUCLEATI, PMN); Costituiscono la prima barriera difensiva, sia in caso di danno tissutale che di penetrazione di materiale estraneo nell organismo; Eosinofili Sono presenti in percentuale compresa tra 0-7%; Nelle cellule mature, il nucleo appare bilobato ed il citoplasma ricco di granuli; Non esercitano apprezzabile attività battericida, ma contengono numerosi enzimi (es. istaminasi) che inattivano mediatori dell infiammazione; Basofili Costituiscono <1% del leucociti circolanti; Presente un nucleo di forma irregolare, con granuli citoplasmatici che si colorano di blu con coloranti basici e che contengono mucopolisaccaridi, acido ialuronico e istamina; Non è nota la funzione dei basofili in circolo;

Linfociti Costituiscono 20-45% del leucociti circolanti; Sono componenti essenziali del sistema immunitario: la loro funzione principale è interagire con gli antigeni ed organizzare la risposta immunitaria (che può essere UMORALE (linfociti B), CELLULO-MEDIATA (linfociti T), CITOTOSSICA (NK)). Monociti Costituiscono 5-8 % del leucociti circolanti; Rispetto al totale, solo una piccola parte si trova in circolo in ogni momento; il monocita maturo rimane in circolo per breve tempo prima di entrare nei tessuti e diventare un macrofago; Nel processo infiammatorio acuto i monociti migrano dal sangue ai tessuti, a velocità inferiore rispetto ai neutrofili; svolgono comunque un ruolo vitale in molti meccanismi di difesa dell organismo (attivi nel fagocitare e uccidere microrganismi, produzione di citochine).

Alterazioni nella formula leucocitaria

MEGACARIOCITOPOIESI I megacariociti sono i precursori delle piastrine circolanti; Le piastrine sono determinanti nell EMOSTASI, ossia impediscono le emorragie formando una sorta di tappo sulle lesioni dei capilari e favoriscono la coagulazione del sangue; La proliferazione e la maturazione delle piastrine è regolata da un ormone simile all Epo, ossia la TROMBOPOIETINA (TPO). Le piastrine circolanti non possiedono il nucleo, perso durante la maturazione; si colorano in blu chiaro ed hanno numerosi granuli citoplasmatici contenenti elementi importanti per l emostasi; Il numero di piastrine circolanti è mantenuto in limiti ristretti, regolato da fattori come la loro massa totale nell organismo ed il rilascio di TPO; In risposta a stimoli adeguati la quantità può aumentare fino a tre volte.

Il conteggio delle piastrine (PLT) è uno dei parametri dell emostasi; Una diminuzione delle piastrine circolanti (TROMBOCITOPENIA) può essere causato da un difetto del midollo o da un emorragia, che però è evidente solo al di sotto delle 40000 piastrine/mm 3. Intervallo di riferimento piastrine: 150000-450000/μl

Metabolismo del Ferro Ogni ml di globuli rossi richiede 1 mg di Fe Ogni giorno la richiesta di Fe è di 20-25 mg 95% riciclato (da eritrociti distrutti nel turnover cellulare e dal catabolismo dell emoglobina). Il Fe libero è tossico in deposito legato a proteine (ferritina ed emosiderina)

Assorbimento del ferro Avviene a livello gastro-intestinale, con un massimo a livello del duodeno (favorito dal valore di ph); Il livello di assorbimento è variabile: assimilata solo la quantità sufficiente a coprire le perdite, il resto è eliminato; Favoriscono l assorbimento di ferro non EME: volume ed acidità del succo gastrico, acido ascorbico, acido citrico (riduzione del metallo a ione ferroso); ostacolano l assorbimento di ferro non EME : fibre, polifenoli, tannini, farmaci antiacido ecc.

Deposito e trasporto del ferro Circa il 10-20% del ferro corporeo totale è immagazzinato come FERRITINA, presente essenzialmente nel fegato, nella milza, e nel tessuto eritropoietico. La componente proteica è data dall APOFERRITINA e nella cavità interna possono essere immagazzinati più di 4500 atomi di ferro sotto forma di un complesso polinucleare in associazione con fosfato. La ferritina del siero (Ferritinemia) si ritrova in concentrazioni molto basse (20-280 μg/l), dimostrando di essere un ottimo indicatore delle riserve di ferro nei tessuti: valori molto elevati sono indicazione di un sovraccarico di ferro (leucemia, neoplasie, emocromatosi ), valori molto bassi indicano deplezione delle riserve di ferro (anemia sideropenica, deficit nutrizionali, emorragie, gravidanza,...). Anche l emosiderina è una proteina di deposito del ferro: deriva dalla ferritina, che ha subito parziale digestione, e composta da materiale glucidico, proteico e lipidico; presente come complessi insolubili nelle cellule del SRE, più difficilmente mobilizzabili.

Il ferro assunto nella mucosa intestinale è trasferito al sangue, dove si lega ad una proteina di trasporto, la TRANSFERRINA (Tf), una β-globulina plasmatica sintetizzata dal fegato che presenta due siti per la captazione degli ioni ferrici, alle estremità N- e C- terminali Si lega a recettori di membrana specifici (TfR) sui precursori degli eritrociti e cede loro il ferro necessario per la sintesi dell eme nei mitocondri. Normalmente nel sangue 1/9 di tutta la transferrina è saturata in entrambi i siti di legame, i 4/9 in uno dei due siti e i restanti 4/9 presentano siti insaturi (fondamentali per la captazione del ferro libero). La sua sintesi avviene con una velocità inversamente proporzionale alle scorte di ferro. Di conseguenza la concentrazione di transferrina plasmatica tende ad aumentare in caso di sideropenia. (Transferrinemia: 240-380 mg/dl)

Deposito Produzione GR

Valutazione di laboratorio dello stato del ferro 1. Striscio di sangue periferico ANEMIA MICROCITICA IPOCROMICA DA CARENZA DI FERRO Notare le piccole cellule con un stretto bordo di emoglobina situato in zona periferica, in contrasto con le sporadiche cellule completamente colorate (emoglobinizzate) derivanti da sangue appena trasfuso nel paziente

2. Ferro nel siero (SIDEREMIA) Ferro non legato all emoglobina, misurato con metodo colorimetrico e spesso in abbinamento con la Capacità Totale di Legare il Ferro. Essendo la quota di ferro libero nel sangue trascurabile (perché tossico), la sideremia di fatto misura il ferro legato alla transferrina: la quota di transferrina legata coincide con il valore della sideremia. Effettuata al mattino, dopo digiuno di 12 ore e dopo sospensione di trattamenti farmacologici a base di ferro per 12-24 ore. Aspetti patologici: si ha diminuzione di ferro nelle infezioni croniche e nei tumori maligni; si ha aumento nell avvelenamento da ferro, nell emolisi intravascolare, nella necrosi epatica, nell anemia perniciosa e nell emocromatosi.

3. Capacità Totale di Legare il Ferro (TIBC) Misura la capacità delle proteine plasmatiche di legare il ferro: è una misura indiretta della transferrina. Dopo aver aggiunto un eccesso di Fe 3+, per saturare tutti i siti leganti della transferrina, e aver lavato via l eccesso, si determina, con metodo colorimetrico, la quantità di ferro capace di saturare al 100% la transferrina plasmatica. Valori di riferimento: 250-450 μg/dl Aumento in caso di carenza di ferro, in caso di danno epatico acuto ed in gravidanza, diminuzione in emocromatosi, in cirrosi del fegato, in sovraccarico di ferro, in malattie croniche e in casi di malnutrizione

4. Saturazione della Transferrina Sideremia Percentual e di saturazione: x 100 Valori di riferimento: 20-50 % TIBC Aumento in caso di anemia sideroblastica, nell avvelenamento da ferro, nell emolisi cardiovascolare e nell emocromatosi, mentre si ha diminuzione in caso di carenza di ferro e in malattie croniche. 5. Ferritina sierica (FERRITINEMIA) La ferritina presente nel plasma, in una concentrazione molto bassa, è in equilibrio con quella presente nei tessuti buon indicatore dei depositi di ferro. Misurata con tecniche IRMA o ELISA; Valori di riferimento: 20-250 μg/l per l uomo e 10-200 μg/l per la donna e i bambini; Utile per distinguere anemie microcitiche ipocromiche causate da carenza di ferro da quelle con diversa eziologia (associate a malattie croniche) Valori elevati si hanno in processi infiammatori, nelle malattie epatiche, nei tumori maligni; valori bassi (<10 μg/l) si hanno in caso di carenze di ferro.

ANEMIE Definizione: Riduzione quantità Hb circolante negli eritrociti del sangue periferico. I valori devono essere inferiori a: 11 g/dl per i bambini e in gravidanza 12 g/dl per donne 13 g/dl per i maschi

Esami di laboratorio di routine nella diagnosi dell anemia 1. Esame Emocromocitometrico 2. Indicatori metabolismo Ferro 3. Conteggio Reticolociti 4. Striscio sangue periferico (esame morfologia eritrocitaria) 5. Bilirubina 6. LDH

1. Esame Emocromocitometrico Comprende: Conta globuli rossi, globuli bianchi e formula leucocitaria, piastrine Dosaggio Hb, Ht 2. Indicatori metabolismo del ferro Sideremia: ferro plasmatico Valori di riferimento: ~50-150 μg/dl Transferrinemia plasmatica: espressa come TIBC ( capacità totale di legare il ferro ), dà la misura di ferro che la transferrina del plasma è in grado di legare. Valori riferimento: 250-450 μg/dl Saturazione transferrinica (%): rapporto percentuale fra sideremia e TIBC Valori riferimento: 20-50% Ferritina plasmatica : è in equilibrio con la Ferritina dei depositi; ci dà un indicazione sulle riserve di ferro che possono venire mobilizzate per la sintesi dell Hb Valori riferimento: 20-250 μg/l uomini, 10/200 μg/l donne

5. Bilirubina La bilirubina è un prodotto del catabolismo dell'emoglobina; è un pigmento di colore giallo-rossastro; Proviene per l 80% dalla distruzione di globuli rossi senescenti nel SRE e per il 20% dal catabolismo di emoproteine (mioglobina, citocromi, catalasi); L'emoglobina contenuta nei GR viene catabolizzata e l'eme che viene liberato viene convertito, negli epatociti, in biliverdina, grazie all eme-ossigenasi, con distacco del ferro e della globina:

HO-1 BVR Bilirubina EME Biliverdina La biliverdina diventa bilirubina grazie all enzima biliverdina-reduttasi. Questa è la bilirubina non coniugata (o indiretta), è insolubile e quindi per essere trasportata all'interno del sangue deve essere legata ad una proteina sierica prodotta dal fegato, l'albumina. All interno delle cellule epatiche si distacca dall'albumina e viene coniugata con acido glucuronico con formazione della bilirubina diretta o coniugata.

Nelle patologie in cui viene distrutta troppa emoglobina oppure l'eliminazione di bilirubina non funziona bene, quest ultima si accumula nel sangue e nel corpo IPERBILIRUBINEMIA = ITTERO Si possono distinguerne diverse forme: a) ittero emolitico, dovuto ad elevata distruzione di globuli rossi (anemie ereditarie, quali la talassemia, anemie tossiche e immunologiche, incompatibilità fra sangue materno e fetale). In questo tipo di ittero aumenta principalmente o esclusivamente la frazione libera della bilirubina, ovvero l indiretta. b) ittero da alterazione di escrezione della bilirubina da parte del fegato (epatiti virali, tossiche o dismetaboliche, cirrosi, cancro); c) ittero da stasi di bile (ostruzioni delle vie biliari intra o extraepatiche, da calcoli, restringimenti e compressioni); Valori di riferimento nel siero: Bilirubina Totale: 0,3-1,1 mg/dl Bilirubina Diretta: 0-0,4 mg/dl Bilirubina Indiretta: 0,3-1 mg/dl

Classificazione anemie Diversi sono i criteri i base ai quali si possono classificare varie forme di anemia: 1. Sulla base del contenuto di emoglobina, l anemia può essere IPOCROMICA o NORMOCROMICA; 2. Sulla base delle dimensioni degli eritrociti può essere NORMOCITICA, MICROCITICA o MACROCITICA; 3. Su base fisiopatologica, che relaziona le anemie a diversi meccanismi che le determinano, che sono principalmente di due tipi: INSUFFICIENTE PRODUZIONE MIDOLLARE, cui si associa un numero normale o ridotto di reticolociti (ANEMIE NORMO-IPORIGENERATIVE). ANOMALIE DEL SANGUE CIRCOLANTE, CON PERDITA O DISTRUZIONE DI EMAZIE CIRCOLANTI (numero reticolociti normale o aumentato) (ANEMIE RIGENERATIVE).

Per un primo, iniziale orientamento, dunque, si effettua un emocromo, da cui, oltre al dosaggio di emoglobina, si valuta il valore dell MCV, mediante il quale si possono classificare le anemie così:

Per quel che riguarda i RETICOLOCITI, i valori normali in % sono riferiti ai globuli rossi totali (0,8-2,5 %), ma in caso di anemia si avrebbe un aumento NON REALE della % dei reticolociti: è, quindi, preferibile usare un valore assoluto del numero dei reticolociti (valori normali: 40000-80000/mm 3 ); la conta del numero assoluto dei reticolociti permette, come si è visto, la suddivisione in: ANEMIE IPER-RIGENERATIVE (reticolociti aumentati) ANEMIE NORMO-IPORIGENERATIVE (reticolociti normali o ridotti) Infine, per l inquadramento delle anemie, sono importanti i parametri del metabolismo del ferro (metabolismo marziale) e l esame morfologico mediante striscio di sangue visualizzato al microscopio.

ANEMIE MICROCITICHE NORMO-IPORIGENERATIVE MCV < 80 fl e numero assoluto reticolociti normale o basso Anemia sideropenica Talassemia Anemie associate a malattie croniche Anemia sideroblastica Sono tutte associate a sintesi emoglobinica anomala o ridotta Anemia sideropenica Causata da carenza di ferro, è l anemia più frequente in assoluto. È dovuta allo squilibrio tra le esigenze di ferro per la sintesi di Hb e la disponibilità presente nei depositi. Il midollo, così, non riesce a produrre emazie sufficienti né a dotarle di una sufficiente quantità di Hb e s instaura un anemia ipocromica e microcitica.

Le cause della carenza di ferro possono essere: Gravidanze; Emorragie digestive occulte (ulcera peptica, tumori intestinali, malattie infiammatorie croniche intestinali, varici esofagee); Malassorbimento (gastrectomia totale o parziale, celiachia); Scarso apporto alimentare (dieta esclusivamente vegetariana, lattanti con dieta esclusivamente lattea) Richiesto sempre l approfondimento diagnostico

Talassemie (EMOGLOBINOPATIE) Le talassemie (ANEMIA MEDITERRANEA) sono un gruppo eterogeneo di emopatie ereditarie recessive, caratterizzate dalla RIDOTTA O ASSENTE SINTESI dell'emoglobina (ipocromia). Ridotta sintesi catene α α -TALASSEMIE Ridotta sintesi catene β β -TALASSEMIE α -TALASSEMIE Malattia ereditaria autosomica recessiva e che si manifesta fenotipicamente con vari livelli di patologia ematologica. Infatti, in ogni cromosoma 16 si trovano due geni α- globinici, quindi ogni individuo possiede 4 geni α; la gravità della malattia varia in base al numero di geni deleti. α 0 -talassemie: sintesi α -catene soppressa α + -talassemie: sintesi α -catene ridotta

1. Delezione un gene = Portatore silente 2. Delezione due geni= Talassemia minor (tratto talassemico) 3. Delezione tre geni = Malattia da HbH 4. Delezione quattro geni = Idrope fetale placentare Genotipo fenotipo Hb Bart Emoglobina / Normal --- Normal / - Silent carrier --- Normal /- - or -/ - -thal. trait 2-10% in newborn Mild hypochromic anemia. -/-- Hb H disease 20-40% newborn; 5-40% Hb H in adults Hemolytic disease; ineff. erythropoiesis --/-- Hydrops fetalis ~100% in cord blood Stillborn, anemic macerated fetus.

β -TALASSEMIE In ogni cromosoma 11 c è un locus β-globinico, quindi gli individui eterozigoti avranno un gene normale ed uno alterato, mentre gli omozigoti avranno entrambi i geni alterati β 0 -talassemie: sintesi β -catene soppressa (Talassemia Major, Morbo di Cooley o anemia mediterranea) β + -talassemie: sintesi β -catene ridotta (Talassemia Minor) Non è evidenziabile immediatamente alla nascita (HbF, α 2 γ 2 ); verso i 3-6 mesi si manifesterà eritropoiesi inefficace causata da emolisi intramidollare

Genotype Phenotype Hematologic Findings Heterozygote ( / ) Silent carrier or thalsessemia minima Normal Heterozygote ( / or / ) Homozygote or compd hetero. ( / ) Thalassemia minor Thalassemia intermedia Mild hypochromic anemia. Moderate hemolytic anemia & ineffective erythropoiesis Homozygote or compd hetero. ( / ) Thalassemia major Severe hemolytic anemia & ineffective erythropoiesis

Anemie associate a malattie croniche Malattie croniche, come infezioni croniche (tubercolosi, malaria), processi infiammatori cronici (artrite reumatoide, morbo di Crohn, collagenopatie), tumori maligni, sono caratterizzate da anemia microcitica ipocromica e non vanno per questo confuse con anemie da carenza di ferro Il difetto di base è un inefficiente utilizzazione del ferro per l eritropoiesi

Anemie sideroblastiche Gruppo eterogeneo di disordini eritrocitari che presentano difettosa sintesi dell EME da parte degli eritroblasti. DIAGNOSI DI LABORATORIO: Anemia IPOCROMICA MICROCITICA Presenza nel midollo di sideroblasti ad anello nel midollo (eritroblasti abnormi in cui il ferro non emoglobinico si distribuisce in granuli disposti ad anello in zona perinucleare) necessità di esame al microscopio Sono sia congenite che acquisite; > Sideremia, Saturazione Transferrinica,Ferritina

ANEMIE MACROCITICHE NORMO-IPORIGENERATIVE MCV >100 fl e numero assoluto reticolociti normale o basso

ANEMIE MEGALOBLASTICHE Dovute a carenze di fattori alimentari (vitamina B12 e/o folati) o di costituenti fisiologici (Fattore Intrinseco) o alla presenza di anticorpi diretti contro il fattore intrinseco. In tali anemie è presente un alterata sintesi del DNA, che nel midollo si evidenzia con un eritropoiesi megaloblastica e si accompagna anche ad altre alterazioni morfologiche di altri elementi del sangue. Le cause di anemia megaloblastica più frequenti sono: Deficit di vitamina B12 Deficit di folati (vitamina B9-folacina)

Vitamina B12 (cobalamina) L uomo non può sintetizzare tale vitamina e l assume con la dieta (carne, pesce, uova, latte e derivati); una dieta normale contiene 5-30 μg/die, di cui 1-5 μg vengono assorbiti nello stomaco e poi immagazzinati nel fegato. In natura esistono 2 forme principali: la cianocobalamina (legata al radicale CN) e la idrossicobalamina (legata al radicale OH), e nell organismo sono convertite in metilcobalamina ed in 5 -desossiadenosilcobalamina. Parte della sua struttura è molto simile all eme, ma al posto del ferro si ha un atomo di cobalto, e poi non è sintetizzata dall organismo:

La presenza di cianocobalamina (e dell acido folico) è di vitale importanza nella sintesi e negli scambi intermolecolari di residui mono e bi-carboniosi, da cui dipende la sintesi di purine e pirimidine, e quindi del DNA. In carenza di questi composti, si ha alterata sintesi di DNA, uno sviluppo anormale del nucleo e del citoplasma e produzione di megaloblasti. L assorbimento di vitamina B12 avviene nella porzione distale dell ileo, grazie a un insieme di proteine, tra le quali vi è il Fattore Intrinseco (FI), glicoproteina bivalente prodotta dalle cellule parietali del corpo e del fondo dello stomaco. I depositi nell organismo sono rilevanti (possono bastare per anni!!), per cui normalmente è difficile avere carenze da dieta (soggetti vegetariani); Dopo l assorbimento, è trasportata in circolo da proteine plasmatiche chiamate transcobalamine; Un suo mancato assorbimento è dovuto a malassorbimento (gastrectomie totali o parziali, sindrome dell ansa cieca, morbo di Crohn, malattia celiaca, insufficienze pancreatiche) o a deficit di fattore intrinseco (anemia perniciosa da presenza di autoanticorpi contro il FI);

Anemia perniciosa Forma anemica dovuta a carenza di vitamina B12, conseguente a mancata secrezione da parte delle cellule parietali dello stomaco del fattore intrinseco (per azione di autoanticorpi anti-fi); Si manifesta con il tipico quadro ematologico dell anemia macrocitica megaloblastica, accompagnato da lesioni neurologiche e dell epitelio del tubo gastroenterico; È sempre importante, in questi casi, valutare la concentrazione di cobalamina* ed acido folico in quanto anche la carenza di quest'ultimo provoca un quadro di anemia megaloblastica senza, però, interessamento nervoso. L'aggiunta di acido folico in una situazione di anemia perniciosa migliora il quadro anemico ma non ha nessun effetto sui disturbi del sistema nervoso che, anzi, continuano a peggiorare. La terapia è semplice: somministrazione per via parenterale di vitamina B12. * Test di Schilling: monitoraggio per 48h dell assorbimento di vitamina B12 marcata; in caso di ridotto assorbimento la si ritrova nelle urine.

Acido folico Insieme ai suoi derivati, è largamente presente nei cibi, soprattutto vegetali (l uomo non è in grado di sintetizzarli); Diversamente dalla vitamina B12, i suoi depositi nell organismo possono bastare solo alcuni mesi, per cui in caso di carenza, l anemia si presenta precocemente; La forma attiva è l acido tetraidrofolico, la forma ridotta dell acido folico, che interviene nelle reazioni di trasferimento delle unità monocarboniose (-CH 3, -CH 2 -, CHO, -CHNH), come nel metabolismo della timidina (da desossiuridina a desossitimidina), che influenza quindi la sintesi del DNA. L acido folico interviene anche nel catabolismo dell istidina, nella sintesi delle purine, nell interconversione tra glicina e serina; Una carenza di acido folico (carenze alimentari, malassorbimento per celiachia, gastrectomia, diabete mellito o per certi farmaci o aumentato fabbisogno, come in gravidanza) ha come effetto uno sbilanciamento della sintesi di timidina, e quindi di DNA (ma non di RNA) e grandi quantità di acido formiminoglutammico (FIGLU), il cui aumento nelle urine consente la diagnosi di deficit di folati.

Numerosi farmaci possono indurre anemia megaloblastica, ed alcuni interferiscono con il metabolismo dei folati: il metotrexato ed il trimetoprim inibiscono l enzima reduttasi che dà luogo alla forma attiva dell acido folico; altri farmaci, come gli antiepilettici, i barbiturici, i contraccettivi orali inibiscono l assorbimento dei folati.

Diagnosi di laboratorio anemie macrocitiche iporigenerative

ANEMIE NORMOCITICHE IPORIGENERATIVE Sono anemie in cui si ha una riduzione quantitativa del tessuto midollare, o per diminuzione del numero assoluto di cellule staminali o per la presenza di cellule staminali anormali. Tali alterazioni coinvolgono non solo la linea eritroide, ma anche le altre linee, potendo quindi generare: Eritrocitopenia Leucopenia Trombocitopenia PANCITOPENIA

Anemia aplastica L anemia aplastica è la più grave tra le anemie iporigenerative, con diminuzione o deplezione delle cellule staminali emopoietiche midollari; il midollo è sostituito da tessuto adiposo e ciò determina marcata ipocellularità; E una malattia rara (1/100000 persone), o idiopatica o spesso messa in rapporto all assunzione di alcuni farmaci (cloramfenicolo, fenilbutazone), all esposizione di radiazioni (in caso di radioterapia), solventi chimici, pesticidi, arsenico, benzene o essere preceduta da infezioni virali (epatite B, CMV, virus di Epstein-Barr); anche patologie autoimmuni (LES, artrite reumatoide) possono essere associate a tali anemie ipoproliferativo; I pazienti affetti da anemia aplastica presentano pancitopenia con reticolocitopenia (necessario un esame del midollo); La forma grave (piastrine < 20000/μl, reticolociti < 10000/μl, neutrofili < 500/μl, marcata ipocellularità midollare) è fatale, ma risultati incoraggianti ci sono con trapianti di midollo e trattamenti immunosoppressori

Sostituzione midollare Una pancitopenia può instaurarsi in seguito alla sostituzione delle normali cellule del midollo osseo con altre, tipo quelle metastatiche o magari sempre emopietiche, ma con anomali caratteristiche proliferative (leucemie, mieloma multiplo), o, infine, può trattarsi di mielofibrosi, cioè sostituzione del midollo con tessuto connettivo fibrotico; I tumori più frequentemente responsabili di queste infiltrazioni sono, quindi, leucemie, linfomi, mieloma multiplo, carcinomi della prostata, del polmone, della mammella. Anemia refrattaria (sindromi mielodisplastiche) Gruppo eterogeneo di malattie caratterizzate da disordini della cellula staminale emopoietica, che possono evolvere in LEUCEMIA ACUTA NON LINFOCITICA, spesso insensibile a qualunque trattamento.

Diagnosi di laboratorio anemie normocitiche iporigenerative Reperto di Pancitopenia, la cui gravità è variabile ; Sono di tipo Normocromico, Normocitico, (MCV e MCH normali); I reticolociti saranno ridotti di numero; Sideremia, Saturazione transferrinica, Ferritina possono essere aumentati perché il ferro non viene utilizzato; La diagnosi di certezza si basa sull esame del midollo osseo, che è povero o anche quasi privo di cellule in base alla gravità della malattia; Nelle SINDROMI MIELODISPLASTICHE il midollo si presenta Iperplastico con caratteristiche anomalie dei precursori eritroidi.

ANEMIE IPER-RIGENERATIVE Sono anemie dovute a cause che risiedono nel sangue circolante e si rende evidente con la PERDITA o DISTRUZIONE DELLE EMAZIE CIRCOLANTI: ANEMIE EMORRAGICHE ACUTE ANEMIE EMOLITICHE E semplice distinguere tra le due situazioni, poiché il sanguinamento è manifesto (a meno di un sanguinamento interno) o i reperti di laboratorio indicano chiara emolisi (aumento di LDH e di bilirubina e diminuzione di aptoglobina). L aumento dei reticolociti è quasi sempre presente in entrambi i casi.

Anemia da emorragia Nelle anemie dovuta a emorragia (la risposta eritropoietica impiega circa una settimana per compensare la perdita di sangue; al contrario, si instaurano in poche ore trombocitopoiesi e leucocitopoiesi), in genere normocromiche e normocitiche, si verifica anossia tissutale che, a livello renale, entro 6-7 ore dall evento causa un incremento di Epo che stimola l eritropoiesi, che dopo 24-48 h si manifesta con l aumento del numero di reticolociti circolanti. Se il sangue si riversa nelle cavità corporee o nei tessuti molli (invece che all esterno), le cellule e l emoglobina devono essere degradate: ciò provoca aumentati livelli ematici di urea e di bilirubina

Anemie emolitiche Sono anemie dovute alla breve sopravvivenza delle emazie in circolo, dovute a : Difetti intracorpuscolari (intrinseci) Difetti extracorpuscolari (estrinseci) Il grado e la severità dell anemia dipendono, ovviamente, dalla velocità con cui vengono distrutti gli eritrociti circolanti e dalla capacità del midollo di compensare tale perdita

Anemie emolitiche da difetti intracorpuscolari Alterazioni membrana eritrocitaria Alterazioni da deficit enzimatici Alterazioni qualitative Hb (emoglobinopatie) Sindromi talassemiche (già viste)

Alterazioni membrana eritrocitaria Importanza del mantenimento dell integrità strutturale della membrana eritrocitaria, che deve resistere alle forze meccaniche che tendono a deformarla durante il passaggio attraverso i capillari: per resistere a tali forze ed allo stress osmotico, la membrana DEVE ESSERE DEFORMABILE importante il ruolo delle proteine dello scheletro (spec. spectrina, actina); Deficit molecolari a carico di proteine dello scheletro di membrana provocano perdita di frammenti della membrana stessa, con diminuzione del rapporto superficie/volume e aumento di sensibilità cellulare alla lisi osmotica SFEROCITOSI, ELLISSOCITOSI, STOMATOCITOSI ecc

Sferocitosi

Difetti ereditari di enzimi eritrocitari La presenza di enzimopatie può essere associata ad alterazioni del metabolismo cellulare degli eritrociti, che può comportare una riduzione della sua vita media. Sono molto rare, ad eccezione del deficit di GLUCOSIO - 6-FOSFATO DEIDROGENASI (G6PDH) Il G6PDH, enzima della prima tappa della via dei pentoso-fosfati, è il solo mezzo per produrre NADPH nell eritrocita; il NADPH consente agli eritrociti di resistere agli stress ossidativi (mediante produzione di GSH), ed un suo deficit impedisce ai GR di neutralizzare i fattori ossidanti, i quali provocano denaturazione ossidativa di molte proteine, compresa l emoglobina che si distaccherà dalla membrana eritrocitaria precipitando come corpi di Heinz.

RICORDANDO GLUCOSIO-6-FOSFATO DEIDROGENASI (G6PDH) E l'enzima che catalizza la prima reazione della via dei pentoso fosfati: D-glucosio 6-fosfato + NADP + D-glucono-1,5-lattone 6-fosfato + NADPH + H +