Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: +.0.5.599 Fax: +.0.5.570 Email: reagents@sanquin.nl Website: www.sanquinreagents.com M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 kit ELISA per la determinazione quantitativa delle sottoclassi di IgG umane nel siero (it) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL it Anticorpi diretti contro Nero Tampone Calibratore Coniugato Controllo DIL GREEN HRP HUM HO MOU it Diluizione Verde HRP Umano Perossido di idrogeno Topo RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS it Rosso Sigilli per piastra Stock Stop Sottoclassi Substrato WASH WELL YELLOW it Lavaggio Pozzetti Giallo Intervallo ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M805 50 ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M809 0.5 ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS
it I. INTRODUZIONE Le IgG umane comprendono quattro sottoclassi: IgG, IgG, IgG e IgG. Le caratteristiche biochimiche delle sottoclassi di IgG sono state ampiamente descritte (5). Le differenze tra le sottoclassi si riflettono in numerose importanti funzioni biologiche quali il riconoscimento dell'antigene, l'attivazione del complemento ed il legame con i recettori cellulari di superficie. Molti studi h indicato che la presenza di anomalie nei livelli serici delle sottoclassi di IgG può essere associata a diversi stati patologici. In modo particolare, è stata ampiamente documentata la correlazione tra la carenza di immunoglobuline appartenenti alla sottoclasse IgG ed una maggiore suscettibilità ad infezioni batteriche o virali (,5). In pazienti affetti da infezioni ricorrenti a carico delle vie respiratorie superiori o inferiori sono stati riscontrati livelli serici bassi di IgG o IgG. In altri casi è stata riscontrata un'associazione tra concentrazioni seriche di IgG molto basse ed infezioni sinopolmonari ricorrenti (). Anomalie nella concentrazione serica delle sottoclassi di IgG sono state osservate anche in pazienti affetti da patologie autoimmunitarie, disturbi neurologici ed infezioni da HIV (). II. RIFERIMENTI TECNICI Il kit ELISA Sottoclassi umane PeliClass è un saggio enzimatico immunologico di tipo 'sandwich'. Il kit contiene strisce di micropozzetti rivestiti con anticorpi monoclonali altamente avidi, ognuno specifico per una sottoclasse di IgG umane. I campioni da analizzare, il calibratore ed il siero di controllo sono incubati nei rispettivi pozzetti. La sottoclasse di IgG da determinare si legherà alla fase solida e le IgG non legate sar rimosse con il lavaggio. Successivamente, ad ogni pozzetto si aggiunge l'antisiero anti IgG coniugato alla perossidasi e l'anticorpo coniugato non legato è eliminato mediante lavaggio. Dopo l'incubazione con la soluzione contenente il substrato (ABTS) e HO,la reazione è bloccata mediante aggiunta di un tampone acido. Il prodotto di reazione, di colore verde, è stimato rilevandone l'assorbanza e la concentrazione della sottoclasse di IgG nel campione è calcolata per confronto con una curva di riferimento. Il siero di controllo è saggiato per verificare la validità della curva di calibrazione e l'accuratezza delle determinazioni. I livelli delle sottoclassi di IgG nel calibratore(i) sono stati determinati utilizzando un calibratore derivato dalla preparazione di riferimento WHO 7/97. I valori target utilizzati sono quelli raccomandati (5,0 g/l per IgG;, g/l per IgG; 0, g/l per IgG e 0,5 g/l per IgG) (7). III. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Conservare il kit ELISA Sottoclassi umane PeliClass in posizione verticale a 8 C. Il kit può essere utilizzato fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. Dopo l'apertura, se conservati a 8 C, tutti i componenti sono stabili fino ad settimana. Le condizioni di trasporto possono differire dalle condizioni di conservazione. IV. CONTENUTO DEL KIT Vedere la tabella all inizio del foglietto illustrativo. Il kit ELISA Sottoclassi umane PeliClass contiene una quantità di reagenti sufficiente per 8 test per ogni sottoclasse, incluso i calibratori, i controlli ed il bianco. Gli anticorpi monoclinali sono stati purificati da asciti o da terreni di coltura mediante tecnica cromatografica (cromatografia a scambio ionico e cromatografia di affinità). Il calibratore ed il controllo sono costituiti da siero umano liquido. V. ALTRO MATERIALE RICHIESTO Acqua distillata per la diluizione del tampone di lavaggio e del tampone del substrato. Pipette in grado di garantire una distribuzione accurata dei volumi. Un incubatore (7 ± C). Un dispositivo standard per il lavaggio delle piastre ELISA o una bottiglia di plastica a spruzzo da 500 ml per il lavaggio automatico o manuale delle strisce. Un lettore ELISA standard per la misurazione dell'assorbanza a nm o 05 nm. Foglio logaritmico lineare. VI. TRATTAMENTO DEI CAMPIONI DA ANALIZZARE Analizzare solo campioni di siero. I campioni devono essere quanto più freschi è possibile o devono essere conservati congelati. I campioni devono essere diluiti manualmente prima dell'uso (vedere la sezione Vll: PROTOCOLLO DEL SAGGIO). VII. PROTOCOLLO DEL SAGGIO Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (85 C) e miscelare con cura. Evitare la formazione di bolle o di schiuma. Si consiglia di analizzare in doppio tutti i campioni, i controlli e le diluizioni del calibratore.. MICROPIASTRE Il kit ELISA Sottoclassi di IgG umane PeliClass garantisce la possibilità di utilizzare le piastre parzialmente in occasioni differenti. Prima di aprire l'involucro di plastica, determinare il numero di strisce necessarie per analizzare il numero desiderato dei campioni più pozzetti per i calibratori, i controlli ed il bianco in duplicato. Rimuovere le strisce che non sar utilizzate dal telaio della piastra, richiuderle nell'involucro plastificato contenente l'essiccante e conservarle a 8 C.. TAMPONI Tampone di lavaggio: Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo tutto il tampone concentrato contenuto nella bottiglia a 950 ml di acqua distillata. Il tampone di lavaggio diluito deve essere conservato a 8 C ed è stabile per settimana. Nota: Il tampone concentrato può contenere cristalli di sale. Prima di preparare il tampone alla concentrazione di lavoro, riscaldare BREVEMENTE il tampone concentrato a 7 C per dissolvere i cristalli. Tampone di diluizione: Calcolare la quantità di tampone di diluizione richiesto (circa ml di tampone concentrato per ogni striscia di micropozzetti) e preparare una soluzione alla concentrazione di lavoro diluendo il tampone 0 volte in acqua distillata.. PREPARAZIONE DEL CALIBRATORE E DEI SIERI DI CONTROLLO Per le concentrazioni vedere le tabelle e riportate nel foglietto illustrativo accluso. Calibratore: (Vedere la tabella del riportata nel foglietto illustrativo accluso) Etichettare una provetta da 0 ml con ':500' ed 8 provette da ml con 'Cal a Cal8' rispettivamente. Pipettare,99 ml di tampone di diluizione nella provetta da 0 ml ed aggiungere 0 µl di siero di calibrazione (diluizione iniziale :500). Pipettare,9 ml di tampone di diluizione nella provetta etichettata 'Cal' e,0 ml nelle provette etichettate 'Cal Cal8'.
Pipettare 00 µl del calibratore diluito :500 nella provetta Cal e, a partire da questa provetta, fare sette diluizioni seriali doppie aggiungendo,0 ml dalla diluizione precedente nella successive provetta 'Cal'. Selezionare le serie di diluizioni del calibratore per ogni sottoclasse di IgG: IgG :80.000 :.80.000 IgG, IgG e IgG :0.000 :0.000. Controllo: Etichettare una provetta con :500, e due provette da ml rispettivamente con :0.000 (per IgG,, ) e :0.000 (per IgG). Pipettare,99 ml di tampone di diluizione e 0 µl di siero di controllo nella provetta etichettata :500. Pipettare 885 µl di tampone di diluizione e 5 µl di diluizione :500 nella provetta etichettata :0.000. Pipettare 875 µl di tampone di diluizione e 5 µl di diluizione :0.000 nella provetta etichettata :0.000. Preparare una provetta da ml con ml di tampone (bianco).. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Diluire i campioni da analizzare con il buffer di diluizione seguendo il protocollo relativo al siero di controllo. In caso di risultati che ricadono al di fuori degli intervalli stabiliti (vedere la tabella contenuta nel foglietto illustrativo accluso) ripetere il test con una diversa diluizione del campione. 5. PRIMO LAVAGGIO Lavare quattro volte i micropozzetti nel telaio della piastra con il tampone di lavaggio. in caso di lavaggio manuale, riempire completamente i pozzetti (> 00 µl) con il tampone di lavaggio ed eliminarlo, ripetere la procedura tre volte. Alla fine, i pozzetti devono essere completamente vuoti. Aggiungere immediatamente il reagente successivo evitando che i pozzetti restino asciutti per periodi di tempo prolungati.. PRIMA INCUBAZIONE Aggiungere 00 µl di calibratori diluiti, controlli, campioni e bianchi nei pozzetti appropriati Coprire la piastra con sigillante adesivo, agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da mischiare il contenuto di ogni pozzetto. Incubare per ora a 7 C. Subito prima dei lavaggi, preparare il reagente per la successiva incubazione così come descritto al punto 8. 7. SECONDO LAVAGGIO Aspirare il surnatante dai pozzetti e lavare la piastra come descritto al punto 5. 8. INCUBAZIONE CON ANTICORPO CONTRO LE IgG UMANE CONIUGATO CON HRP Diluire il coniugato :500 aggiungendo 0 µl del coniugato a,97 ml di tampone di diluizione. Diluire ulteriormente il coniugato a: :000 aggiungendo, ml della diluizione :500 a,0 ml di tampone di diluizione. :000 aggiungendo,0 ml della diluizione :500 a,0 ml di tampone di diluizione. :000 aggiungendo,5 ml della diluizione :500 a,5 ml di tampone di diluizione. Aggiungere: 00 µl della diluizione :500 ai pozzetti delle antiigg; 00 µl della diluizione :000 ai pozzetti delle antiigg; 00 µl della diluizione :000 ai pozzetti delle antiigg; 00 µl della diluizione :000 ai pozzetti delle antiigg; Coprire la piastra con sigillante adesivo, agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da mischiare il contenuto di ogni pozzetto. Incubare per ora a 7 C. Subito prima dei lavaggi, preparare il reagente per la successiva incubazione così come descritto al punto 0. 9. TERZO LAVAGGIO Aspirare il surnatante dai pozzetti e lavare la piastra come descritto al punto 5. 0. INCUBAZIONE CON SUBSTRATO ABTS Calcolare la quantità necessaria di soluzione contenente il substrato (approssimativamente sono necessari 0,9 ml per ogni striscia). Aggiungere gli equivalenti di 00 µl di soluzione stock di perossido di idrogeno e 00 µl di soluzione stock di ABTS a 0 ml di tampone del substrato alla concentrazione di lavoro ( ml di soluzione stock del substrato + 8 ml di acqua distillata). Aggiungere 00 µl di soluzione del substrato a tutti i pozzetti. Agitare con cautela picchiettando sul bordo della micropiastra per pochi secondi in modo da mischiare il contenuto di ogni pozzetto. Incubare per 0 minuti a temperatura ambiente (85ºC).. ARRESTO DELLA REAZIONE ENZIMATICA Aggiungere 50 µl di soluzione bloccante a tutti i pozzetti.. LETTURA DELLA PIASTRA Leggere entro ora a (preferibilmente) o 05 nm in un lettore per piastre ELISA. VIII. RISULTATI ED INTERPRETAZIONE DEI DATI Registrare l'assorbanza a (preferibilmente) o 05 nm per ogni pozzetto e fare la media delle letture in doppio. Per ogni campione, le due letture non devono differire di più de 5% dal valore medio. Se almeno una delle due letture differisce maggiormente il test deve essere ripetuto. Riportare i valori medi di assorbanza dei calibratori sull'asse delle y e la concentrazione della sottoclasse correlata, in ng/ml, sull'asse delle x del foglio logaritmico lineare. Le concentrazioni delle sottoclassi di IgG nel siero di controllo devono ricadere all'interno dell'intervallo(i) illustrato nella tabella contenuta nel foglietto illustrativo accluso. Interpolare i valori medi di assorbanza relativi ad ogni campione sulla curva di riferimento. I campioni con un valore medio di assorbenza che ricade all'esterno dell'intervallo delimitato dalla curva di riferimento devono essere diluiti in modo appropriato. Per una valutazione della concentrazione delle sottoclassi di IgG in un campione, confrontare i livelli relativi a valori normali delle sottoclassi di IgG (vedere X INTERVALLI DI RIFERIMENTO). IX. INTERVALLI DELL'ANALISI Per gli intervalli di saggio specifici consultare la tabella contenuta nel foglietto informativo accluso
X. INTERVALLI DI RIFERIMENTO Intervalli di riferimento (g/l) relativi alle sottoclassi di IgG in campioni di siero di individui caucasici sani (8). Per altre popolazioni riferirsi a diversi intervalli di riferimento. Età IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a CARATTERISTICHE SPECIFICHE DI FUNZIONAMENTO Riproducibilità Concentrazione sottoclassi IgG IgG IgG IgG IgG Variazione intrasaggio (%) Variazione intersaggio (%) 7 7 b Confronto tra il kit Sottoclassi di IgG umane PeliClass e Mancini Le concentrazioni di IgG, IgG, IgG e IgG nei sieri sono state determinate con saggio ELISA e confrontate con i valori corrispondenti trovati in Mancini. Di seguito sono riportate le correlazioni stabilite: sottoclasse IgG linea di regressione lineare correlazione IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Nota: I valori riportati per le caratteristiche specifiche di funzionamento del test rappresentano risultati tipici e non devono essere considerati specifici per questo kit. XII. LIMITAZIONI. L'utente deve essere istruito e deve familiarizzare con la tecnica ELISA e con la procedura dell'analisi.. Non utilizzare campioni molto emolizzati o lipemici. Campioni contenenti fattori reumatoidi, livelli alti di bilirubina o altri immunocomplessi circolanti possono dare risultati inattesi. Analizzare questi campioni con metodi diversi.. Campioni che ricadono all'esterno degli intervalli di riferimento, ad esempio in caso di paraproteine, devono essere analizzati nuovamente utilizzando diluizioni differenti.. Un risultato che evidenzia un livello ridotto di una delle sottoclassi IgG non può mai considerarsi una diagnosi definitiva. Al contrario, esso deve essere considerato l'indicazione di un disturbo a carico del sistema immunitario che richiede ulteriori ricerche diagnostiche. 5. Utilizzare sempre il siero di controllo per verificare la validità delle curve di calibrazione. Quando il controllo ricade al di fuori dell'intervallo, i risultati del test non sono attendibili. Il test deve essere ripetuto.. I reagenti di lotti differenti non sono interscambiabili. 7. Non miscelare residui di reagenti (p.e. volume morto) con il contenuto di flaconcini appena aperti. 8. I tappi ed I flaconcini non sono interscambiabili. Rimettere il tappo sul flaconcino corrispondente. 9. Sebbene il calibratore umano ed i sieri di controllo siano stati testati per i marcatori di agenti specifici di trasmissione di patologie, secondo le linee guida UE per le GMP, e siano stati trovati non reattivi, tutti i componenti di origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. 0. Conservante: Thiomersal 0,00%.. Nel corso dell'esperimento ELISA, utilizzare un nuovo sigillante per ogni fase di incubazione/fissazione per evitare contaminazioni incrociate. Non utilizzare fogli di alluminio.. Utilizzare puntali per pipette monouso per ogni trasferimento per evitare contaminazioni incrociate.. Preparare diluizioni fresche dei calibratori, del coniugato e dei tamponi ogni volta che si utilizza il kit.. Non utilizzare reagenti o strisce di micropozzetti diversi da quelli forniti con il kit. 5. La sodiazide inattiva l'hrp; non utilizzare soluzioni contenenti sodiazide; non aggiungere sodiazide ai tamponi forniti.. Eseguire lo smaltimento dei rifiuti nel rispetto delle normative interne di laboratorio.
XIII. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI. Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5