CORSO REGIONALE SULLA ROSOLIA CONGENITA E NUOVE STRATEGIE DI PREVENZIONE

CORSO REGIONALE SULLA ROSOLIA CONGENITA E NUOVE STRATEGIE DI PREVENZIONE Padova 11 giugno 2007 Conferma di Laboratorio della Rosolia e Significato del Dosaggio degli Anticorpi Anna Piazza Giorgio Palù Microbiologia e Virologia Azienda ospedaliera Università Padova

CONFERMA DI LABORATORIO DELLA ROSOLIA DIAGNOSI DIRETTA entro 4 giorni dalla comparsa del rash cutaneo da tamponi vie aeree superiori, sangue, urine, LSF, liquido amniotico Isolamento del virus Ricerca RNA virale PCR DIAGNOSI INDIRETTA Ricerca di IgM specifiche anti-rosolia Ricerca di IgG specifiche anti-rosolia Test di avidita delle IgG

DIAGNOSI INDIRETTA RICERCA DI IgM SPECIFICHE ANTI-ROSOLIA entro 1 settimana dall esantema o dopo il contatto persistono per 6-8 settimane, ma anche per mesi o anni; FP infezioni virali, malattie autoimmuni RICERCA DI IgG SPECIFICHE ANTI-ROSOLIA entro 1 settimana dall esantema o dopo il contatto e dopo 7-14 giorni se ancora negative ripetere dopo 6 settimane dal primo prelievo

TEST DI AVIDITA DELLE IgG L avidità di un anticorpo nei confronti di un antigene esprime la capacità che ha l anticorpo stesso di formare legami stabili con l antigene L avidità delle IgG con test ELISA si ottiene confrontando, ad opportuna diluizione, le densità ottiche ottenute con e senza lavaggio del campione con soluzioni dissocianti di urea La percentuale di IgG residue legate è tanto più bassa quanto maggiore è la percentuale di IgG giovani, poco avide, rimosse dal lavaggio BASSA AVIDITÀ < 20% coincide con una infezione acquisita negli ultimi due-tre mesi: INFEZIONE ACUTA o ACUTA RECENTE MEDIA- ALTA AVIDITA > 20 % coincide con una infezione acquisita prima degli ultimi tre mesi: INFEZIONE PREGRESSA

METODI SIEROLOGICI PER LA DETERMINAZIONE DELLE IgM e IgG INIBIZIONE DELL EMOAGGLUTINAZIONE FLUORESCENZA INDIRETTA RIA WESTERN BLOT ELISA

METODI SIEROLOGICI PER LA DETERMINAZIONE DELLE IgM Metodica immunoenzimatica su micropiastra (Enzyme Linked Immunosorbent AssaY ) Antigene inattivato e purificato ottenuto da colture cellulari renali di Baby- Hamster ( cellule BHK 21) infettate con il virus della rosolia Ricerca di IgM specifiche anti-rosolia a cattura : Metodo qualitativo : < 0.200 Negativo 0.201-0.220 Dubbio 0.221-0.300 Deb. Positivo > 0.301 Positivo Sensibilità del test : 98 % Specificità del test : 97.3 % Variabilità intra-serie : 4.9 % Variabilità inter-serie : 5.4 %

METODI SIEROLOGICI PER LA DETERMINAZIONE DELLE IgG Metodica immunoenzimatica su micropiastra (Enzyme Linked Immunosorbent AssaY ) Antigene inattivato e purificato ottenuto da colture cellulari renali di Baby- Hamster ( cellule BHK 21) infettate con il virus della rosolia Metodo quantitativo: < 4 UI/ml Negativo 5 10 UI/ml Dubbio 11 20 UI/ml Deb. Positivo > 20 UI/ml Positivo Sensibilità del test : 100 % Specificità del test : 98.5 % Variabilità intra-serie : 8.8 % Variabilità inter-serie : 9.9 % VPP? VPN?

SIGNIFICATO DEL DOSAGGIO DEGLI ANTICORPI ANTI- ROSOLIA IgM IgG AVIDITA- IgG INTERPRETAZIONE - - N.E. RECETTIVO + - N.E. INFEZIONE ACUTA PRIMARIA? + + BASSA INFEZIONE ACUTA PRIMARIA + + ALTA REINFEZIONE? - + ALTA IMMUNE

ROSOLIA: APPROPIATEZZA DELLE INDAGINI DI LABORATORIO IN EPOCA PRECONCEZIONALE IN GRAVIDANZA NEONATO PERIODO PRENATALE

IN EPOCA PRECONCEZIONALE Valutazione dello stato sierologico della donna fertile: - mancata conoscenza dello stato sierologico - mancato ricordo anamnestico di eventuale infezione o di vaccinazione in età scolare conferma di laboratorio IgM negative, IgG positive soggetto immune IgM negative, IgG negative soggetto recettivo vaccinazione controllo efficacia vaccinazione

IN GRAVIDANZA Valutazione dello stato sierologico della donna gravida: Conferma di laboratorio: IgM negative IgG positive IgM negative, IgG negative Gravida immune indagare solo se: Gravida recettiva rischio di infezione acuta - sintomi compatibili primaria follow-up - esposta a caso di rosolia ( reinfezione )

GRAVIDA IMMUNE : conferma di laboratorio Indagare in caso di esposizione ad un caso di rosolia e/o sintomi compatibili con rosolia reinfezione D D: Isolamento virale RNA- PCR D I: IgM positive fugaci IgG: positive con incremento del titolo ad un secondo prelievo dopo 15 gg Avidità delle IgG: alta

GRAVIDA RECETTIVA Conferma di laboratorio di infezione acuta D D: Isolamento virale RNA- PCR DI : Sieroconversione Positività delle IgM specifiche Positività delle IgG con incremento del titolo Test di avidità delle IgG: basso

La conferma di laboratorio in dettaglio/1 Isolamento virale: da campione biologico (sangue, urine, tampone faringeo, saliva), raccolto entro 4 giorni dalla comparsa dall esantema. Nota: i 4 giorni dall esantema rappresentano il periodo ottimale, ma il virus della rosolia può essere isolato da una settimana prima fino a 2 settimane dopo la comparsa dell esantema. PCR: test positivo per RNA virale mediante la metodica di RT-PCR, su un campione biologico raccolto come sopra.

La conferma di laboratorio in dettaglio/2 Sieroconversione: comparsa ex novo di anticorpi IgM o IgG virusspecifici Nota: ci deve essere un precedente test negativo! Positività IgM: deve essere associata a sintomi clinici compatibili e/o di a un test positivo per IgG specifiche a bassa avidità. Incremento IgG: Aumento di almeno 4 volte rispetto ai livelli iniziali. Il primo campione prelevato entro 7-10 giorni dalla comparsa dell esantema o subito dopo il contatto con un soggetto infetto (fase acuta) il secondo almeno 2 settimane dopo (fase convalescente) per dimostrare l incremento, i due campioni devono essere esaminati nel corso della stessa seduta analitica.

COME DIAGNOSTICARE UN INFEZIONE ACUTA IN GRAVIDANZA Positività delle IgM in gravidanza Prelievo successivo dopo 20 gg ( sieroconversione, innalzamento delle IgG ) Determinazione dell avidità delle IgG Avidita inferiore al 20 % Avidita superiore al 20 % Infezione acuta Infezione pregressa ( entro 3 mesi precedenti ) ( oltre i 3 mesi precedenti ) Scelte Diagnostica prenatale IVG

DIAGNOSI PRENATALE Conferma di laboratorio D D: Isolamento virale ( sangue del cordone ombelicale e/o liquido amniotico ) Rna- PCR D I : Determinazione delle IgM specifiche su sangue del cordone ombelicale e/o liquido amniotico a partire dalla 20 settimana di gravidanza

NEONATO: DIAGNOSI DI ROSOLIA CONGENITA Si esegue in tutti i nati da madre con rosolia in gravidanza e/o i nati che presentano sintomi o segni suggestivi per rosolia congenita D D: Isolamento virale RNA- PCR Conferma di laboratorio D I: Positività delle IgM specifiche Positività delle IgG

La conferma di laboratorio in dettaglio/1 Isolamento virale: da campioni biologici (sangue, liquor, urine, biopsie d organo, etc.) Genoma virale identificato mediante la metodica di RT-PCR da campioni biologici

La conferma di laboratorio in dettaglio/2 Ricerca delle IgM specifiche La positività delle IgM entro un mese di vita pone diagnosi di infezione congenita con una elevata sensibilità e specificità. Va tenuto presente che non tutti i neonati con infezione congenita risultano IgM positivi alla nascita. Quindi, sia i nati da madre con sospetta rosolia in gravidanza, sia i neonati con sintomi o segni suggestivi per rosolia congenita che risultino IgM negativi alla nascita, dovranno ripetere il test all età di un mese di vita.

La conferma di laboratorio in dettaglio/2 Ricerca delle IgG specifiche Dosaggio delle IgG rosolia-specifiche ogni mese per i primi sei mesi di vita. La persistenza delle IgG specifiche a titoli più elevati e per periodi più lunghi rispetto a quanto atteso in un lattante (cioè, i cui livelli non diminuiscono del 50% ogni mese) depone per infezione contratta in utero, anche in assenza di altri dati di laboratorio. La scomparsa delle IgG specifiche nel secondo semestre di vita consente invece di escludere l infezione congenita.

SIGNIFICATO DEL DOSAGGIO DEGLI ANTICORPI ANTI- ROSOLIA

CONCLUSIONI Non si può fare diagnosi e non si può attuare sorveglianza senza una collaborazione fra laboratoristi e clinici. GRAZIE PER L ATTENZIONE