CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Anno Accademico 2007/2008 Corso di: Laboratorio di Biologia II Chimica Biologica Dott. Marcello MEROLA Parziale purificazione dell enzima Alcool Deidrogenasi (ADH) da estratto di lievito mediante cromatografia a scambio anionico - Cromatografia a scambio ionico - Elettroforesi su gel di acrilammide in condizioni denaturanti e riducenti - Saggio di attività enzimatica per l enzima Alcool deidrogenasi Studente:.. Matricola:. 1
Il campione da cromatografare è rappresentato da un estratto di lievito (Saccharomyces Cerevisiae) equilibrato in tampone sodio-fosfato 10 mm, ph 7,0; 1 mm MgCl 2. In quest organismo, la via metabolica della fermentazione alcolica riveste un importanza industriale rilevante ed è stat caratterizzata in modo dettagliato. Di seguito verranno date alcune informazioni sull enzima alcool deidrogenasi, importanti per la comprensione del risultato di questo laboratorio. Basandosi su di esse, alla fine dell esperienza dovete essere in grado di spiegare il comportamento cromatografico e elettroforetico dell enzima. L alcool deidrogenasi (ADH) (o anche NAD-dipendente alcool deidrogenasi; NADH- Aldeide deidrogenasi; ecc.) è un enzima che catalizza preferenzialmente la conversione di alcool primari non ramificati nella loro corrispondente aldeide (EC 1.1.1.1 ossidoreduttasi; riconosce gruppi-oh; NAD o NADP dipendente; primo membro del gruppo). L enzima nativo da lievito ha un peso molecolare di circa 140 kda. E composta da subunità il cui numero dovete determinarlo sperimentalmente dal risultato del gel in SDS. In questo estratto sono presenti 2 isoforme dell enzima le cui subunità, contenenti lo stesso numero di residui, differiscono nella composizione di pochissimi amminoacidi (93,4% di residui identici). Le due isoforme, infine, hanno peso molecolare indistinguibile in SDS e punto isoelettrico simile (ph 5,4 l una e 5,48 l altra) In questa esperienza di laboratorio, la cromatografia a scambio anionico su DEAE- Sepharose verrà usata come primo passaggio cromatografico di purificazione dell alcool deidrogenasi. Basandosi sul grafico che costruirete con la misurazione dell assorbanza delle frazioni eluite e dell attività enzimatica contenute in esse e, in aggiunta, del risultato dell elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti e riducenti, dovrete valutare se è stata effettuata una effettiva purificazione dell enzima. Infine, calcolando il peso molecolare della subunità dell enzima, dovrete stabilire di quante catene è composto l enzima nativo. Alla fine dell esperienza, dovrete rispondere al questionario di valutazione e consegnarlo con le specifiche del nome, cognome e numero di matricola. 2
CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO La resina DEAE-Sepharose è costituita di una matrice di agarosio a cui è covalentemente legato il gruppo dietilamminoetile [-CH 2 -CH 2 -N + H-(CH 2 -CH 3 ) 2, pk~ 8.5] ed è equilibrata in tampone sodio-fosfato 10 mm, ph 7,0; 1 mm MgCl 2. La cromatografia verrà sviluppata al flusso di 0.8 ml/min utilizzando una pompa peristaltica; l eluato verrà raccolto in frazioni di circa 3.0 ml di volume mediante un collettore automatico. 3
METODICA dopo avere rimosso il tampone presente sulla resina, caricare 1 ml di estratto; lavare la resina con 10 ml di tampone sodio-fosfato 10 mm, ph 7,0; 1 mm MgCl 2 ; eluire con un gradiente salino di NaCl da 0 M a 0.2 M in tampone sodio-fosfato 10 mm, ph 7,0; 1 mm MgCl 2 (30 ml di tampone sodio-fosfato 10 mm, ph 7,0; 1 mm MgCl 2 e 30 ml di tampone sodio-fosfato 10 mm, ph 7,0; 1 mm MgCl 2 ; 0.2 M NaCl); eluire con 20 ml di tampone sodio-fosfato 10 mm, ph 7,0; 1 mm MgCl 2 ; 1 M NaCl ; leggere i valori di assorbanza a 280 nm delle singole frazioni eluite dalla colonna e riportare in grafico i dati ottenuti. Frazioni A 280 nm Frazioni A 280 nm 1. 22. 2. 23. 3. 24. 4. 25. 5. 26. 6. 27. 7. 28. 8. 29. 9. 30. 10. 31. 11. 32. 12. 33. 13. 34. 14. 35. 15. 36. 16. 37. 17. 38. 18. 39. 19. 40. 20. 41. 21. 42. 4
Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in SDS L elettroforesi si basa sulla proprietà di una molecola dotata di carica netta di muoversi in un campo elettrico µ=q/f µ è la mobilità elettroforetica, q è la carica dello ione, f è il coefficiente frizionale che dipende dalla grandezza, dalla forma e dallo stato di solvatazione dello ione e dalla viscosità della soluzione. In Biochimica, le tecniche elettroforetiche di gran lunga più utilizzate si servono di una matrice di supporto porosa che agisce come un setaccio molecolare. Tale matrice ritarda o ostruisce il movimento delle molecole in misura proporzionale alla grandezza delle molecole stesse. A seconda della grandezza delle molecole da analizzare è possibile variare la grandezza dei pori della matrice così che nessuna specie sia impedita nella migrazione ma ciascuna ritardata in misura proporzionale alla sua dimensione. In tal modo si ottiene una separazione delle differenti specie presenti in un campione. 5
L elettroforesi in condizioni denaturanti prevede il trattamento con un detergente ad alte temperature per distruggere la struttura terziaria, e quaternaria in assenza di ponti disulfuro intercatena, delle proteine. Quando il detergente è l SDS (Sodio Deodecil Solfato, CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 -O-SO - 3 ), le proteine vengono interamente ricoperte da questo e le loro cariche mascherate dalla coda idrofobica dell SDS. I complessi SDS-proteina assumeranno carica netta negativa (dovuta alla ionizzazione del solfato) e migrano verso l anodo sotto l azione di un campo elettrico. Per le proprietà di setaccio molecolare del gel, le proteine a minor peso molecolare si muovono più velocemente mentre quelle a maggior peso molecolare migrano più lentamente. L elettroforesi in condizioni denaturanti e riducenti prevede un ultriore trattamento con un agente riducente (2-Mercaptoetanolo, HS-CH 2 - CH 2 -OH) i ponti disolfuro tra residui di Cisteina. Le proteine dopo separazione possono essere visualizzate mediante l uso di un colorante specifico (Coomassie Blue) che forma un complesso colorato in blu. Dopo trattamento del gel con la soluzione di Coomassie, si evidenzieranno una serie di bande corrispondenti al numero di proteine presenti nel campione la cui distanza dall origine di migrazione è funzione del peso molecolare di ciascuna proteina. La slab-gel-elettroforesi (strati di gel di 1 mm di spessore e di dimensioni 7 x 5 cm) è rapida ( 1 hr), sensibile (meno di 1μg di proteina) e permette di distinguere proteine che differiscono di circa il 2% in massa (es. 40 41 kda). Sistema Elettroforetico. gel di poliacrilammide al 10% (lower), al 4% (upper); tampone di corsa Tris-glicina ph 8.3; soluzione denaturante e riducente per campioni: Tris.HCl 0.5 M ph 6,8, SDS 4%, glicerolo 10%, 2-mercaptoetanolo 1%, Blu di Bromofenolo 1%. soluzione colorazione gel: Preparato contenente Blu di Coomassie. soluzione per la decolorazione del gel: H 2 O distillata. 6
campioni: 1. Miscela di proteine di peso molecolare noto: Miosina (Viola) 220 kda BSA (Rosa) 100 kda GDH (Blu) 60 kda LDH (Rosa) 45 kda Anidrasi carbonica (Arancio) 30 kda Inibitore tripsina (Blu) 20 kda Lisozima (Rosa) 12 kda Aprotinina (Blu) 8 kda 2. Estratto di lievito 3. Frazione di proteine non legate dalla resina DEAE 4. ADH eluita da DEAE-Sepharose 5. ADH purificata Dopo aver sistemato la lastrine contenenti il gel nell apposito apparecchio ed aver riempito le apposite vaschette con il tampone di corsa, i campioni vengono stratificati nei diversi pozzetti, utilizzando il pipettatore automatico. Collegati gli elettrodi all alimentatore di corrente (200 V), si fa avvenire la corsa elettroforetica sino a quando il tracciante (Blu di Bromofenolo) raggiunge l estremità del gel. Ad elettroforesi terminata, smontato l apparecchio il gel viene liberato dalle lastrine e immerso nella soluzione di colorante per circa 20 minuti e poi nella soluzione di decolorante. Lettura del gel: Calcolare la migrazione elettroforetica (cm) dei marcatori di peso molecolare e allestire la retta mettendo in grafico su carta millimetrata in scala logarirmica il peso molecolare (ordinate) in funzione della migrazione (ascisse); calcolare il peso molecolare delle subunità dell ADH in condizioni denaturanti e riducenti. Ricavare il numero di subunità che compongono l ADH nativa considerando che il peso molecolare dell ADH è di circa 140 kda. 7
METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Dosaggio dell attività enzimatica della alcool Deidrogenasi (ADH) L ADH da lievito catalizza l ossidazione di alcooli primari in presenza del coenzima NAD +, ad un ph optimum di 8.8. ADH CH 3 -CH 2 -OH + NAD + O=CH-CH 3 + NADH +H + La quantità di NADH che si forma durante la reazione è funzione della quantità di enzima presente nel campione. L analisi spettrofotometrica della miscela di reazione permette il dosaggio dell NADH formatosi in seguito all azione della ADH. Ciò è possibile perché nello spettro di assorbimento del NADH appare un picco a 340 nm assente nel NAD +, dal cui valore è ricavabile la quantità di prodotto che si forma ai tempi iniziali della reazione (1 μmole di NADH = 1 μmole di aldeide). NAD Assorbanza NADH 260 200 400 lunghezza d'onda (nm) 340 La formazione del prodotto si misura ai tempi iniziali della reazione sia perché la velocità di una reazione è funzione della concentrazione di substrato sia perché la formazione dei prodotti promuove anche la reazione inversa (la riduzione dell aldeide con conseguente consumo di NADH). 8
Nella miscela di rezione dell ADH, la misura dell assorbanza a 340 nm è correlata alla quantità di NADH prodotta (vedi legge di Lambert e Beer in basso) che quindi è misura dell attività enzimatica (vedi definizione di unità enzimatica). Definizione di Unità enzimatica: UNA UNITÀ ENZIMATICA È LA QUANTITÀ DI ENZIMA CHE CONVERTE IN PRODOTTO UNA µmole DI SUBSTRATO PER MINUTO A 25 C NELLE CONDIZIONI OTTIMALI PER IL SAGGIO Determinazione della concentrazione di NADH in soluzione: É possibile determinare la concentrazione di una sostanza pura direttamente dal assorbanza (A) misurata grazie alla legge di Lambert-Beer: A = є c l dove l =1 (lunghezza del cammino ottico generalmente di 1 cm) c è la concentrazione della sostanza ed є è il coefficiente di estinzione espresso in unità di concentrazione (moli/litro, mg/ml ecc.). Per il NADH il valore di є M (Coefficiente di Estinzione molare, moli/litro) è di 6.200 O.D.* a 340 nm. Altrimenti detto, una soluzione che a 340 nm legge 6.200 OD ha una concentrazione di 1 M, una soluzione che legge 6,2 OD ha una concentrazione di 1mM, una che legge 0,062 OD 340 = 10 μm e così via. (*OD Optical Densities = Unità di misura dell Assorbanza). 9
Procedura per il saggio di attività dell alcool deidrogenasi (ADH): La determinazione dell attività enzimatica della ADH si effettua ad ph di 8,8 e la miscela di reazione per il saggio richiede la presenza del substrato (etanolo) e del coenzima ossidato NAD +. Le concentrazioni finali nella miscela di reazione sono: 0.025 M tampone sodio-fosfato, ph 8,8 4 mm NAD + 3,2% etanolo 1. Mescolare 5 ml di tampone Sodio Fosfato 0.1 M ph 8.8, 0,66 ml di etanolo 96%, 0.8 ml di NAD + 100 mm e portare a 20 ml con H 2 O; Allestire i saggi di attività utilizzando 1 ml di miscela di reazione in una cuvetta. Dopo aver azzerato l apparecchio a 340 nm contro questa miscela, registrare l incremento di assorbanza a 340 nm in 30 secondi dopo aggiunta di 2,5 μl di estratto di lievito. Ripetere la procedura per le frazioni di eluato da analizzare utilizzandone 25 μl per ognuna di esse. 2. Dopo aver ottenuto tutti i valori di assorbanza per i campioni di interesse, calcolare le µmoli di NADH formate in 1 ml di miscela di reazione (da cui ricavare le Unità Enzimatiche). Questo valore si ottiene dividendo l incremento di assorbanza per minuto (ΔA/min) per il coefficiente di estinzione millimolare (mmoli/litro = µmoli/ml) dell NADH (є mm a 340 nm = 6. 2). 10
3. Calcolare le unità di attività enzimatica contenute nel volume dei campioni usato per il saggio di attività (cioè tenendo conto di quanti µl di ciascun campione estratto e frazioni della colonna sono stati usati) e riportarle ad unità di attività enzimatica per millilitro (U.E./ml) di ogni campione saggiato. 4. Riportare sul grafico i valori di U.E./ml calcolati. Esempio di calcolo di U.E./ml a partire dall assorbanza misurata: ΔA misurato in 30 sec = 0.2 OD utilizzando 100 μl di un campione ΔA/min = 0.4 OD (incremento per minuto) 0.4/6.2 = 0,064 mm, ossia 0,064 μmoli/ml di NADH prodotto 0,064 μmoli/minuto = 0,064 Unità in 100 μl 1 ml equivale a 1000 μl, quindi 0, 64 Unità/ml di ADH 11
Campione ΔA/30 sec ΔA/min Unità enzimatiche --------------------------- Volume Estratto 2,5 μl Unità enzimatiche/ml 12