Proteine da stress e chaperon molecolari Sono state recentemente descritte alcune proteine che sono coinvolte in generale nel ripiegamento di altre proteine. Furono, in origine, descritte come proteine da shock termico. Per esempio (vedi figura), nelle cellule di Drosophila, è normalmente sintetizzata una proteina di P.M. 70000 la cui concentrazione aumenta notevolmente per esposizione della cellula a temperature di 35 e 37 C. Cioè assistiamo ad un calo di sintesi delle altre proteine della cellula e i dispositivi deputati alla sintesi proteica lavorano ad elevati regimi per la sintesi della proteina di P.M. 70000. Tale proteina è stata contraddistinta con la sigla hsp70 (heat shock protein). Addirittura si possono osservare dei rigonfiamenti, indotti dall aumento di pochi gradi di temperatura, sui cromosomi delle cellule di Drosophila (1974). In tali rigonfiamenti viene innescata una aumentata sintesi di RNA messaggero che codifica hsp70.con queste premesse è stato dimostrato che le hsp sono proteine prodotte da tutte le cellule in risposta, non solo ad un aumento della temperatura, ma anche in risposta ad una varietà di stimoli o agenti tossici (metalli pesanti, alcoli e varie tossine metaboliche). Si è arrivati alla conclusione che le hsp rappresentano un meccanismo generale di difesa delle cellule. Altrettanto generale è il loro tipo di intervento. 8
Le proteine da stress possono essere indotte da: Fattori ambientali Shock termico Metalli pesanti di transizione Inibitori del metabolismo energetico Analoghi degli amminoacidi Agenti chemioterapici Stati patologici Infezioni virali Febbre Infiammazioni Ischemia Lesioni da ossidanti Neoplasie Fattori cellulari normali Ciclo di divisione cellulare Fattori di crescita Sviluppo e differenziamento A) Le hsp sono altamente conservate Confrontando la struttura primaria (sequenza amminoacidica) di molte hsp si è giunti alla conclusione che presentano un elevata omologia di sequenza. È chiaro che le hsp (o proteine da stress, più in generale) devono essersi conservate lungo tutto il corso dell evoluzione e probabilmente hanno svolto una funzione analoga ed importante in tutti gli organismi. Struttura primaria di hsp-70 N Dominio ATPasico Dominio di riconoscimento del substrato C 450 AA Esiste una forte omologia tra le varie chaperonine. 200 AA B) Le hsp sono costitutive e/o indotte Molte proteine da stress si esprimono anche normalmente, e quindi non soltanto in cellule sottoposte a stress o traumatizzate. È possibile dividerle in due gruppi: quelle costitutive (espresse in condizione di crescita normale), e quelle indotte (solo in cellule sottoposte a stress). Come mai tanti stimoli tossici di natura così diversa generano la sintesi più o meno della stessa proteina (o di una famiglia di proteine simili)? Gli agenti stressanti sono, in genere, denaturanti nei confronti delle proteine cellulari, e le proteine da stress difendono dalla denaturazione l apparente generalità delle proteine. Ecco quindi identificato un comune denominatore. Infatti Richard Voellmy e Alfred Goldberg dimostrano che l iniezione di proteine denaturate in cellule viventi basta per indurre una risposta allo stress. La sintesi proteica è ovviamente della massima importanza per la vitalità cellulare. Fu dimostrato che la hsp70 si accumula nel nucleolo e controlla il corretto assemblaggio delle numerose proteine ribosomiali. 9
Ripiegamento delle proteine e proteine da stress Le proteine si ripiegano, in genere, spontaneamente, ma una certa percentuale può seguire spontaneamente una via che porta a proteine non funzionali. In presenza, invece, di proteine da stress (che sono poi riciclate), il ripiegamento è sempre corretto. Espletando tale funzione, tali proteine sono anche denominate chaperon molecolari o chaperonine (chaperon = accompagnatore, assistente). È stato dimostrato che tale processo ha un costo in termini di energia. Infatti le chaperonine possiedono una specifica proprietà enzimatica: sono ATP-asi, cioè scindono ATP, che è consumato, in ultima analisi, per assistere il corretto ripiegamento di proteine. 10
hsp10 e hsp60 E stato dimostrato che l assenza di due proteine di P.M. 10000 e 60000, nei batteri, rende questi incapaci di provvedere alla crescita di piccoli virus, dipendenti dalla macchina cellulare dei batteri stessi. Tali proteine vengono denominate gro-el e gro-es. L assemblaggio del batteriofago λ (una specie di siringa che contiene DNA fagico) avviene separatamente per la testa e la coda. È il primo stadio di assemblaggio della pro-testa che viene assistito dalle gro-el e gro-es. La gro-el è una delle proteine più abbondanti dell E.coli. (vedi pag.8) Proteine con omologia di sequenza con le gro- EL e le gro-es sono state identificate nei mitocondri di cellule superiori (anche nei cloroplasti). Sono state denominate hsp-10 e hsp-60. Nei cloroplasti esiste una proteina omologa della gro-el che assiste il ripiegamento dell importante enzima oligomerico che fissa la CO 2 nelle piante superiori (ribulosio bis-fosfato carbossilasi). Nei mitocondri la hsp-60 forma due anelli sovrapposti, ciascuno costituito da 7 membri. Nei mitocondri esiste anche la hsp70 e le tre proteine, hsp10-60-70, cooperano per il corretto ripiegamento (che consuma ATP) delle proteine importate. Esiste inoltre la proteina Bip (Binding Immunoglobulin Protein), che assiste il corretto ripiegamento delle immunoglobuline destinate alla secrezione. Più in generale assistono il ripiegamento delle glicoproteine prodotte nel reticolo endoplasmatico. 11
Nucleoplasmina L assemblaggio del nucleosoma nelle cellule eucariote è un processo estremamente complesso. È stato dimostrato che una proteina denominata nucleoplasmina (una proteina acida che è stata isolata dal nucleo dell oocita di Xenopus laevis), insieme alla topoisomerasi I, controlla l assemblaggio dei nucleosomi. Tale proteina si lega infatti agli istoni, ma non al DNA, né ai nucleosomi. La nucleoplasmina partecipa quindi a tale processo agendo da chaperon molecolare. hsp-90 e virus oncogeni Il virus del Sarcoma di Rous è responsabile della comparsa di proprietà tumorali (vedi più avanti: proto-oncogeni). Tale virus codifica un enzima denominato pp6012c, che è una tirosin cinasi. Tale enzima si associa nel citoplasma con due proteine, la p50 e una hsp-90. Quando è legato ad esse si trova inattivo come enzima. Il pp60src individua i suoi substrati nella membrana cellulare (vinculina e talina) ed è attivo quando si staccano le altre due proteine. È stato inoltre dimostrato che l hsp-90 è normalmente legata ai recettori per gli ormoni seroidei. Altre Chaperonine: [da TIBS 19 543 (1994)] CCT o TCP-1 È una chaperonina abbondante nel citosol di eucarioti. È coinvolta nel ripiegamento della tubulina (CCT = Cytosol Chaperonin of Tubulin) e di altre proteine. Presenta un omologia del 45% con l omologa chaperonina trovata negli Archebatteri, per cui la CCT ha una funzione conservata nell arco dell evoluzione. Ha un peso molecolare di circa 60000 Da, ma è alquanto diversa dalla gro-el, anch essa di P.M. 60000. CCT sembra essere la più importante chaperonina esclusiva del citosol. Ne sono note ben 7 differenti tipi (α, β, γ, δ, ε, ζ, η). 12
da Le Scienze luglio 1993 Sec-B [da TIBS 20, (2) 65 (1995)] È stata scoperta la chaperonina che assiste la secrezione di proteine da parte dei batteri: si tratta della Sec-B, di MW = 17300. È esclusiva dei procarioti. È dedicata al ripiegamento di proteine destinate ad essere secrete all esterno. Interagisce con Sec-A, di membrana, che è una ATPasi, per esportare effettivamente le proteine. Sec-B non presenta attività ATPasica. 13
Induzione delle proteine BIP Alcune chaperonine (o proteine da stress) sono costitutive, cioè sono sempre presenti nella cellula. Altre sono inducibili in risposta a stress. È stato studiato in dettaglio (vedi articoli di D. J. Sweet, Current Biology 3-622-1993) il processo di induzione delle BIP (Immunoglobulin Binding Protein) che, come abbiamo visto (pag.11) accompagnano il ripiegamento delle proteine prodotte nel lume del reticolo endoplasmatico. Le immunoglobuline secrete dalle plasmacellule sono controllate da tali BIP, ma la loro azione è estensibile alla generalità delle proteine secrete dalle cellule e generalmente prodotte all interno del reticolo endoplasmatico (ER). Più oltre (vedi pag.28) ci occuperemo dell importantissimo processo di glicosilazione delle proteine che avviene nell ER. La sintesi di BIP è incrementata in tutte quelle situazioni che portano all accumulo di proteine nell ER. Questo può avvenire quando il livello di glicosilazione (che pure esso contribuisce ad un corretto ripiegamento) diminuisce: esiste infatti una sostanza, la tunicamicina, che è uno specifico inibitore della glicosilazione. Se si trattano cellule in coltura con tunicamicina, si osserva un incrementata sintesi di BIP. Il gene che codifica le BIP, nel lievito, è denominato KARK2. E stato descritto nei dettagli il promotore di tale gene: Struttura del promotore del gene KARK2 HSE = heat shock element. A tale sequenza nucleotidica si lega una proteina fosforilabile, denominata Heat Shock transcription Factor (HSF). Vedremo il processo che porta alla fosforilazione di tale HSF che, nella forma fosforilata, si lega a tale zona (HSE) del promotore inducendo, in ultima analisi, la trascrizione del gene BIP con produzione del relativo RNA messaggero. Tutto questo si tradurrà in sintesi proteica della BIP nel lume del reticolo endoplasmatico. UPR = unfolded-protein response element, la cui presenza è importante nel promotore per assicurare la risposta alla presenza di proteine in stato unfolded. Esistono poi i consueti TATA box. Ricordiamoci quindi che esiste un HSF che si lega, quando è fosforilato, al promotore BIP, e quindi tale HSF fa da cinghia di trasmissione tra ER e gene da trascrivere. Chi fosforila l HSF? Sono stati descritti in dettaglio dei recettori proteici che risiedono nella membrana del reticolo endoplasmatico. Sono proteine transmembrana, con proprietà del tutto simili ad altri recettori della membrana plasmatici: possiedono una parte N terminale che protrude nel lume dell ER; un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico con attività proteina cinesica. Si tratta dell Ire 1 p (Inositol Reticolum Endoplasmic, perché identificato in precedenza come recettore per la crescita in assenza di Inositolo). Il recettore del reticolo endoplasmatico è una proteina di peso molecolare putativo 136000. Struttura del recettore del reticolo endoplasmatico Ire 1 p All N-terminale contiene una sequenza segnale, tipica delle proteine dell ER. Nella parte luminale contiene 4 siti di glicosilazione (sono precisamente identificabili: trattasi delle sequenze Asn-X-Ser, dove l asparagina è glicosilata all N, vedi pag.28). Contiene il solito dominio transmembrana, facilmente identificabile perché costituito da amminoacidi idrofobici. Nella parte C-terminale esiste il dominio di tipo cinasico. Più avanti classificheremo ben 8 subdomini nelle proteine cinasi, in base alla sequenza amminoacidica. Il dominio dell Ire 1 p è simile alla cdc-2, che determina l ingresso in mitosi di una cellula (vedi pag.127), e sembra essere più una Ser/Thr cinasi che una Tyr cinasi. 14
La struttura del recettore Ire 1 p è omologa ai noti recettori per EGF e per PDGF che sono recettori della membrana plasmatica.con la descrizione di questi elementi (HSE su promotore del gene fattore di trascrizione fosforilabile HSF recettore Ire 1 p) è stato formulato un modello per la trasmissione del segnale per indurre la sintesi di BIP nel reticolo endoplasmatico: Il recettore ha il dominio luminale (che guarda cioè il lume del reticolo endoplasmatico) che normalmente lega le BIP e, in tale situazione, non può dimerizzare. Se le BIP sono impegnate nel folding di proteine, tali BIP abbandoneranno i recettori Ire 1 p, che dimerizzano. In tale stato di aggregazione viene attivata l attività proteina cinasica della parte citosolica e il fattore proteico HSF è fosforilato. L HSF fosforilato si lega alla sequenza nucleotidica HSE sul promotore per il gene che codifica BIP. Questo rappresenta un esempio interessante di trasmissione di segnale intracellulare (dall ER al nucleo). Ruolo della calnexina nel reticolo endoplasmatico Il corretto ripiegamento (folding) delle glicoproteine del reticolo endoplasmatico non dipende soltanto dalle BIP. È stata descritta un importante proteina la calnexina che attraversa la membrana del reticolo endoplasmatico e che lega calcio, pur non appartenendo alla superfamiglia delle calmoduline. La calnexina si lega al polipeptide nascente: per esempio è stato dimostrato che, durante l assemblaggio dell importante complesso maggiore di istocompatibilità di classe I (MHC I), la catena pesante dell MHC resta legata alla calnexina.la calnexina, in particolare, sembra riconoscere la parte glucidica delle proteine. Vedremo (vedi pag.28) che sulle proteine neosintetizzate è trasferito un oligosaccaride legato ad asparagina formato 14 residui glucidici (in maggioranza mannosio = 9 residui) che subisce rielaborazione, restando legato all asparagina un nocciolo di 5 residui. Tale nocciolo glucidico è riconosciuto dalla calnexina. La tunicamicina, che inibisce la sintesi dell oligosaccaride, impedisce il legame delle proteine alla calnexina. La calnexina da sola non è sufficiente per un corretto ripiegamento. Sono necessarie anche le BIP e l attività enzimatica proteina disolfuro isomerasi (PDI, vedi pag.5). La seguente illustrazione è tratta da una recente pubblicazione (C. Hammond & A. Helenius, Current Biology, 3, 884, 1993): 15
Sequenza riconosciuta dalle BIP L. M. Gierasch (Current Biology, 4, 173,1994) ha descritto il processo di riconoscimento da parte delle BIP. Le sequenze proteiche riconosciute, e quindi legate, dalle BIP sono rilasciate in seguito ad esposizione con ATP. In pratica, se si fa percolare su di una colonna cromatografia legante BIP una miscela di peptici, si avrà il legame con molti peptici effettivamente legati alle BIP. Dall analisi dei peptici rilasciati per trattamento con ATP, si è giunti alla conclusione che la BIP riconosce la seguente sequenza di 7 amminoacidi: Hy Trp/X Hy X Hy X Hy dove: Hy indica un amminoacido idrofobico, frequentemente Trp, Leu o Phe X indica un qualsiasi amminoacido In pratica ogni due amminoacidi, uno è idrofobico. È possibile constatare che gli amminoacidi idrofobici sono il bersaglio dell azione della BIP. Questo è, in linea teorica, corretto perché la denaturazione delle proteine è accompagnata dall esposizione all esterno della macromolecola degli amminoacidi idrofobici, che normalmente sono relegati nel nucleo idrofobico interno alla macromolecola proteica. Quindi la chaperonina vede, o meglio, si lega a tali amminoacidi e opera verso la rinaturazione. Inserto: NiceProt View of SWISS-PROT: Q9LKR3 (Bip 1) Inserto: NiceProt View of SWISS-PROT: Q00613 (HSF 1) La gabbia di Anfinsen R. J. Ellis (Current Biology, 4, 633, 1994) ha ipotizzato un modello per un corretto ripiegamento di proteine ad opera delle chaperonine 60 (Gro EL in E. coli) e 10 (Gro ES in E. coli) che prevede la formazione di un doppio anello (7 + 7 subunità) di chaperonina 60 che legherà 14 molecole di ATP. È stato dimostrato che, in seguito all idrolisi dell ATP, la chaperonina subisce un netto cambio conformazionale. La chaperonina 10 forma invece un solo anello di 7 subunità. 16
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Modifiche post-sintetiche delle proteine La proteina viene prodotta sui ribosomi. Dopo può subire modifiche post-sintetiche, quali: fosforilazioni e defosforilazioni (es. Ser 14 della glicogeno fosforilasi) metilazioni e demetilazioni acetilazioni e deacetilazioni glicosilazioni miristoilazioni ancore a membrana per proteine extracellulari varie (es. biotinilazioni) proteolisi 18