PROTEINE RICOMBINANTI

TRASFORMAZIONE IN LIEVITO

VETTORI SHUTTLE

Colture cellulari = propagazioni di cellule fuori dall organismo vantaggi: 1) l ambiente extracellulare puo essere manipolato 2) uso di un tipo cellulare ben definito 3) grandi quantita di cellule 4) studio di varie funzioni cellulari Due tipi di colture cellulari: 1) colture primarie 2) linee cellulari

Colture primarie cellule derivate direttamente da un tessuto Tecnica messa a punto nel 1907: 1 g Espianto di midollo spinale + Fluido linfatico Cellule con assoni che si sviluppano in coltura! Numero di divisioni limitato senescenza replicativa

Neuroni in vitro con prolungamenti

Linee cellulari Possono derivare da varie fonti: cellule trasformate in vitro (p.e. espressione di oncogene) espianti tumorali (posti in coltura crescono indefinatamente)

differentiating muscle cell line = C2C12

Vettore di espressione per cellule animali in coltura

Piccolo introne

G418 - GENETICIN Blocca la traduzione in tutti gli organismi

LIPOFEZIONE Si utilizzano liposomi caricati con i vettori di espressione

BACULOVIRUS Virus che infetta le larve di insetto Il promotore virale della poliedrina è molto potente! Virioni appena formati

DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA A RNA (RNAi) SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ALLA RICERCA DI EVENTUALI VARIAZIONI FENOTIPICHE!

sirna Possibilità di modulare negativamente l espressione di specifici geni Somministrazione sperimentale di sirna FORTE RIDUZIONE DELL ESPRESSIONE DELLA PROTEINA

PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) p.e. tpa, insulina ecc. VACCINI RICOMBINANTI ANTICORPI

SIERI BOVINI O EQUINI Immunoglobuline da sieri di animali immunizzati con uno specifico antigene Siero antitetanico: animali trattati con la tossina del batterio Clostridium tetani

Cellule tumorali (linfoma) immortale IBRIDOMA immortale

Mouse Chimeric Humanized

Catena Leggera Catena Pesante

ANTICORPI IN TERAPIA Blocco di interazioni ligando-recettore (p.e. estrogeni) Blocco di funzioni proteiche (p.e. oncogeni) Stimolo di segnalazione intracellulare (p.e. apoptosi) (sia anticorpi interi che frammenti) Reclutamento di componenti del sistema immunitario a seguito del binding (stimolo immunità cellulare) (anticorpi interi)

MODELLI ANIMALI OVERESPRESSIONE DI UNA PROTEINA NORMALE O ESPRESSIONE DI UNA VERSIONE MUTATA (p.e. proto-oncogene attivato) Trasfezione di cellule in coltura Animali transgenici ABOLIZIONE DELL ESPRESSIONE DI UNA PROTEINA (p.e. malattie genetiche, oncosoppressori) RNAi in colture cellulari o in C.elegans Topi knock out MODELLI PER RICERCHE DI BASE MODELLI PER MALATTIE UMANE

ANIMALI TRANSGENICI POSSIBILI APPLICAZIONI PRODUTTIVE espressione di proteine ricombinanti nel latte di mammiferi (capre, bovini) Vettore con promotore tessuto-specifico per la ghiandola mammaria (CASEINA)

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/homolrecomb.html BLASTOCISTI TRASFEZIONE

Creazione del costrutto per la ricombinazione omologa Cellule ES Staminali embrionali: anipolazione in vitro (trasfezione) Inserimento nella blastocisti Topi chimerici 1 incrocio per genotipo -/+ 2 incrocio per genotipo -/-

RICOMBINAZIONE OMOLOGA Distruzione (interruzione) del gene bersaglio TRASCRIZIONE Inattiva attiva

Resistenza al G418

INCROCIO TRA CHIMERICO E BIANCO I TOPI NERI SONO ETEROZIGOTI KO ED ETEROZIGOTI B/N ( B recessivo ) 25% -/- B/N +/- 50% +/- 25% +/+ B/N +/-

INCROCIO TRA CHIMERICO E BIANCO I TOPI NERI SONO ETEROZIGOTI KO ED ETEROZIGOTI B/N ( B recessivo ) H = -

TECNICHE BIOCHIMICHE Western blot con IgG specifiche ANALISI DEL FENOTIPO ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA con IgG specifiche

PROMOTORE DI VIRUS VEGETALE PIANTE TRANSGENICHE

CLONAGGIO DI ANIMALI Non è una tecnologia del DNA ricombinante

RIASSUMENDO