Terreno BBL in piastra pronto per l uso per test di Neisseria gonorrhoeae GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment 8809031JAA(01) 2013-07 Italiano USO PREVISTO GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment (agar GC II con arricchimento IsoVitaleX) è usato per i test di sensibilità di Neisseria gonorrhoeae agli antibiotici mediante disco-diffusione. SOMMARIO E SPIEGAZIONE Alla luce dei crescenti problemi di resistenza dei gonococchi a penicillina e altri antibiotici, nel 1987 i Centers for Disease Control and Prevention (CDC) hanno pubblicato linee guida per la rilevazione, il trattamento e il controllo di N. gonorrhoeae antibiotico-resistente, 1 raccomandando come terreno per i test di sensibilità agli antibiotici mediante disco-diffusione l agar base GC con un supplemento definito, come per esempio l arricchimento IsoVitaleX. Anche il Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) raccomanda l uso dell agar GC con un supplemento definito (equivalente all arricchimento IsoVitaleX) per i test di sensibilità agli antibiotici di N. gonorrhoeae mediante disco-diffusione. 2,3 PRINCIPI DELLA PROCEDURA GC II Agar Base contiene peptoni di carne e caseina come fonte di sostanze nutritive, tampone fosfato per controllare il ph e amido di granoturco per neutralizzare gli acidi grassi tossici eventualmente presenti nell agar. IsoVitaleX Enrichment è un supplemento definito che fornisce il fattore V (nicotinamide-adenin dinucleotide, NAD), vitamine, aminoacidi, coenzimi, destrosio, ioni ferro e altri fattori che migliorano la crescita dei ceppi patogeni di Neisseria. REAGENTI GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment Formula approssimata* per L di acqua purificata Digerito pancreatico di caseina... 7,5 g Peptone di carne selezionato... 7,5 g Amido di granturco... 1,0 g Fosfato dipotassico... 4,0 g Fosfato monopotassico... 1,0 g Cloruro di sodio... 5,0 g Agar... 12,0 g IsoVitaleX Enrichment... 10,0 ml * Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance. IsoVitaleX Enrichment Formula approssimata* per L di acqua purificata Vitamina B 12... 0,01 g L-Glutamina... 10,0 g Adenina... 1,0 g Cloridrato di guanina... 0,03 g Acido p-aminobenzoico... 0,013 g Nicotinamide-adenin dinucleotide... 0,25 g Pirofosfato di tiamina... 0,1 g Nitrato di ferro... 0,02 g Cloridrato di tiamina... 0,003 g L-cisteina cloridrato... 25,9 g L-cistina... 1,1 g Destrosio... 100,0 g * Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance. Avvertenze e precauzioni Per uso diagnostico in vitro. Se si riscontra un umidità eccessiva, capovolgere il fondo su un coperchio e lasciare asciugare all aria per evitare la formazione di aderenze tra la parte superiore e inferiore della piastra durante l incubazione. Durante tutte le procedure, adottare tecniche asettiche e seguire le precauzioni standard contro i rischi microbiologici. Dopo l uso, le piastre preparate, i contenitori dei campioni e gli altri materiali contaminati devono essere sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento. 1
Modalità di conservazione - Al ricevimento, conservare le piastre al buio a 2 8 C. Evitare congelamento e surriscaldamento. Aprire soltanto al momento dell uso. Ridurre al minimo l esposizione alla luce. Le piastre preparate, conservate nell involucro originario a 2 8 C sino al momento dell uso, possono essere inoculate fino alla data di scadenza e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Prima dell inoculo, attendere che il terreno si porti a temperatura ambiente. Deterioramento del prodotto - Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore, essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento. RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Questo terreno non è destinato all uso diretto con campioni clinici o colture miste. Il test di sensibilità mediante disco-diffusione è destinato all uso con colture pure. Sono necessarie una colorazione di Gram e un identificazione presuntiva di N. gonorrhoeae. PROCEDURA Materiale fornito - GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment Materiali necessari ma non forniti 1. Brodo per inoculo in provetta in aliquote di 5 ml, come per esempio brodo Mueller Hinton (provetta da 20 x 112 mm) o brodo Mueller Hinton II (provetta da 16 x 102 mm) per la preparazione dell inoculo standard. 2. Standard McFarland 0,5 solfato di bario per la correzione dell inoculo (preparato dispensando 0,5 ml di 0,048 M BaCl 2 [1,175% peso/vol BaCl 2 2 H 2 O] a 99,5 ml di 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1% vol/vol]). 3. Dispositivo fotometrico per comparare la torbidità dello standard di solfato di bario con la sospensione dell inoculo. 4. Coltura di controllo Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226. 5. Dischi di carta impregnati di quantità specifiche di agenti antimicrobici, come per esempio dischi per test di sensibilità BBL Sensi-Disc. 6. Dispositivo di dispensazione dei dischi, come per esempio il dispensatore auto-applicatore da 12 posti Sensi-Disc. 7. Dispositivo per la misurazione o interpretazione dei diametri delle zone, come per esempio il set di interpretazione delle zone Sensi-Disc. 8. Un reagente o dispositivo per eseguire un test rapido delle β-lattamasi, come per esempio i dischi BBL Cefinase. 9. Un incubatore in grado di produrre un atmosfera contenente CO 2 al 5 7% o un altro dispositivo che produca aerobiosi arricchita di CO 2. 10. Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie. Procedura del test Quando si testa N. gonorrhoeae, usare la procedura di sospensione diretta delle colonie. Adottare tecniche asettiche. La superficie agar deve essere omogenea e non eccessivamente umida. 1. Preparare una colorazione di Gram ed eseguire un test dell ossidasi prima di iniziare i test di sensibilità per confermare la purezza delle colture e l identificazione tentativa di N. gonorrhoeae. 2. Usare alcune colonie ben isolate prelevate direttamente da una piastra agar cioccolato della sera precedente come fonte di inoculo. 3. Per valutare l utilità clinica della penicillina, usare un test rapido delle β-lattamasi (disco Cefinase). Questo test rapido offre al clinico informazioni preziose sulla sensibilità agli antibiotici in maniera più rapida rispetto al test mediante disco-diffusione. 4. Usando colonie prelevate direttamente da una piastra agar cioccolato della sera precedente, preparare una sospensione del microrganismo da testare in brodo Mueller Hinton, brodo Mueller Hinton II o soluzione fisiologica allo 0,9% e diluire con altro brodo o soluzione fisiologica per ottenere una torbidità equivalente a quello dello standard McFarland 0,5 (vedere la sezione Materiali necessari ma non forniti). Questa sospensione conterrà circa 1 2 x 10 8 UFC/mL. Prestare attenzione durante la preparazione di questa sospensione perché concentrazioni di inoculo superiori possono determinare risultati falsamente resistenti, mentre un inoculo troppo leggero può dare luogo a risultati falsamente sensibili. A intervalli regolari, eseguire diluizioni e conte da piastra delle sospensioni di inoculo per confermare che la metodica di correzione adottata produca un inoculo contenente circa 1 2 x 10 8 UFC/mL. 5. Entro 15 min dalla correzione della torbidità dell inoculo, immergere un tampone sterile nell inoculo correttamente diluito ed eliminare il liquido in eccesso facendo ruotare il tampone e premendolo varie volte sulla parte superiore della parete interna della provetta. 6. Inoculare tre volte l intera superficie di una piastra agar, girando ogni volta la piastra di 60 per ottenere un inoculo uniforme. 7. Riporre il coperchio e tenere la piastra a temperatura ambiente per 3 5 min, ma non più di 15 min, per permettere l assorbimento di eventuale umidità superficiale, prima di applicare i dischi impregnati di antibiotico. 2
8. Applicare i dischi con l ausilio di un dispensatore di dischi di antibiotici, adottando tecniche asettiche. Le zone di inibizione prodotte dalla maggior parte degli antibiotici in caso di test di N. gonorrhoeae sono più ampie di quelle generate durante i test di altri microrganismi, la qual cosa limita in alcuni casi il numero di dischi a non più di 9 per piastra da 150 mm. Una volta posizionati i dischi sull agar, comprimerli con un ago o pinze sterili in modo da realizzare un contatto completato con la superficie del terreno. Questa operazione non è necessaria se i dischi vengono depositati usando un dispensatore autoapplicatore da 12 posti Sensi-Disc (gli applicatori non scendono dai fori senza cartucce). 9. Entro 15 min dall applicazione dei dischi, capovolgere le piastre e incubare per 20 24 h a 35 C in ambiente aerobico arricchito di anidride carbonica al 5 7%. Controllo di qualità a cura dell utente - 1. Verificare che le piastre non presentino segni di deterioramento come descritto in Deterioramento del prodotto. 2. Includere la coltura di controllo Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 ogni volta che si esegue un test di sensibilità. La tabella 1 riporta i limiti di controllo per le zone di inibizione, indicanti la corretta esecuzione di tutta la procedura. TABELLA 1. Limiti per il controllo di qualità per N. gonorrhoeae* N. gonorrhoeae Antibiotico Contenuto disco ATCC 49226 Cefepime 30 µg 37-46 Cefixime 5 µg 37-45 Cefotaxime 30 µg 38-48 Cefotetan 30 µg 30-36 Cefoxitina 30 µg 33-41 Cefpodoxime 10 µg 35-43 Ceftazidime 30 µg 35-43 Ceftizoxime 30 µg 42-51 Ceftriaxone 30 µg 39-51 Cefuroxime 30 µg 33-41 Ciprofloxacina 5 µg 48-58 Enoxacina 10 µg 43-51 Gatifloxacina 5 µg 45-56 Lomefloxacina 10 µg 45-54 Ofloxacina 5 µg 43-51 Penicillina 10 unità 26-34 Spectinomicina 100 µg 23-29 Trovafloxacina 10 µg 42-55 * Dal documento CLSI M100, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Tests; norma approvata. Dietro autorizzazione. Le procedure prescritte per il controllo di qualità devono essere effettuate in conformità alle norme vigenti o ai requisiti di accreditazione e alla prassi di controllo di qualità in uso nel laboratorio. Per una guida alla prassi di controllo di qualità appropriata, si consiglia di consultare le norme CLIA e la documentazione CLSI in merito. RISULTATI 1. Esaminare le piastre dopo 20 24 h di incubazione. Si deve ottenere un piano di crescita confluente. La sola crescita di colonie isolate indica che l inoculo è troppo leggero; in tal caso, il test deve essere ripetuto. 2. Con l ausilio di calibri, un regolo o una sagoma appositamente predisposti, misurare il diametro delle zone di inibizione completa (valutata a occhio nudo), incluso il diametro del disco, approssimando al millimetro. Tenere il dispositivo di misurazione sul retro della piastra di Petri, a sua volta posta su un fondo nero non riflettente e illuminata dall alto. Assumere come endpoint l area che non evidenzia alcuna crescita visibile ad occhio nudo. Ignorare la crescita debole di colonie minute rilevabili con difficoltà all estremità della zona di inibizione evidente. 3. Per l interpretazione dei risultati ottenuti con isolati clinici di N. gonorrhoeae, consultare la tabella dei criteri di interpretazione dei diametri di zona (Tabella 2). A seconda dei diametri di zona ottenuti, i risultati possono essere referti come resistenti, intermedi o sensibili. I microrganismi con test positivo per la produzione di β-lattamasi devono essere considerati penicillino-resistenti indipendentemente dai diametri di zona ottenuti. 3
TABELLA 2. Criteri di interpretazione dei diametri di zona per N. gonorrhoeae* Diametro di zona, approssimato al mm Antibiotico Contenuto disco Resistente Intermedio c Sensibile Cefepime a 30 µg 31 Cefixime a 5 µg 31 Cefotaxime a 30 µg 31 Cefotetan 30 µg 19 20-25 26 Cefoxitina 30 µg 23 24-27 28 Cefpodoxime a 10 µg 29 Ceftazidime a 30 µg 31 Ceftizoxime a 30 µg 38 Ceftriaxone a 30 µg 35 Cefuroxime 30 µg 25 26-30 31 Ciprofloxacina 5 µg 27 28-40 41 Enoxacina 10 µg 31 32-35 36 Gatifloxacina 5 µg 33 34-37 38 Lomefloxacina 10 µg 26 27-37 38 Ofloxacina 5 µg 24 25-30 31 Penicillina b 10 unità 26 27-46 47 Spectinomicina 100 µg 14 15-17 18 Trovafloxacina a 10 µg 34 * Dal documento CLSI M100, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Tests; norma approvata. Dietro autorizzazione. a Per questi antibiotici, l assenza corrente di ceppi resistenti preclude la possibilità di definire categorie di risultati diversi da Sensibile. I ceppi che danno risultati indicativi di categoria Non sensibile devono essere sottoposti a ulteriori analisi in un laboratorio di riferimento. b I gonococchi con diametri di zona di 19 mm attorno ai dischi di penicillina da 10 unità sono verosimilmente ceppi produttori di β-lattamasi. Tuttavia, il test delle β-lattamasi rimane preferibile rispetto ad altre metodiche di sensibilità ai fini di un identificazione rapida e accurata di tale resistenza a penicillina plasmide-mediata. c Un risultato intermedio con un agente antibiotico indica un problema tecnico da risolvere ripetendo il test oppure la mancanza di esperienza clinica nel trattamento di microrganismi con tali zone. Quest ultimo sembra essere il caso di cefotetan, cefoxitina e spectinomicina (vedere M2). I ceppi che producono zone intermedie rispetto ad altri agenti, hanno un tasso inferiore di guarigione clinica documentata (85 95%) rispetto a un tasso di >95% per i ceppi sensibili. LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA La capacità di rilevare resistenza a cefixime, cefotaxime, cefotetan, cefoxitina, cefpodoxime, ceftazidime, ceftizoxime, ceftriaxone, cefuroxime, ciprofloxacina, enoxacina, lomefloxacina e ofloxacina di Neisseria gonorrhoeae è sconosciuta perché al momento dei test non erano disponibili ceppi resistenti. Con alcune combinazioni di microrganismi-antibiotici, la zona di inibizione può presentare un bordo non chiaramente demarcato e dare luogo a interpretazioni errate. Data la performance incongruente di cefmetazolo e maggiore di 10 errori secondari con tetraciclina, l uso di questi due antibiotici in questo terreno è controindicato. Una concentrazione di inoculo inappropriata può produrre risultati inesatti. Un inoculo troppo intenso può determinare zone di inibizione eccessivamente limitate, mentre un inoculo troppo leggero può generare zone di dimensioni eccessive e difficili da misurare. Una conservazione inappropriata dei dischi di antibiotici può provocare una perdita di potenza e risultati falsamente resistenti. La sensibilità in vitro di un microrganismo a un antibiotico specifico non indica necessariamente l efficacia di tale agente in vivo. Per una guida all interpretazione dei risultati, consultare la documentazione appropriata. 4,5 4
PERFORMANCE Prima della spedizione, vengono testate le performance di tutti i lotti di GC II Agar with IsoVitaleX. Campioni rappresentativi del lotto vengono testati con una sospensione cellulare di Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069, inoculando con una sospensione di soluzione fisiologica diluita in modo da contenere 1 x 10 3 1 x 10 4 UFC/piastra. I campioni sono testati anche con Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 seminando con un tampone la superficie del terreno usando una sospensione equivalente a uno standard McFarland 0,5. Vengono aggiunti dischi contenenti quantità specifiche di antibiotici. Tutte le piastre vengono incubate a 35 37 C per un giorno in aerobiosi arricchita di CO 2. Con N. gonorrhoeae ATCC 43069, si osserva crescita moderata intensa. Zone di inibizione corrette si osservano intorno ai dischi con N. gonorrhoeae ATCC 49226 DISPONIBILITÀ N. di cat. Descrizione 221240 BBL GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment, confezione da 100 piastre di misura 8 (150 x 15 mm) BIBLIOGRAFIA 1. Centers for Disease Control. 1987. Antibiotic-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae: policy guidelines for detection, management, and control. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 36(Suppl.):1S-18S. 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, Pa. Consult latest version. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk Diffusion Supplemental Tables: M100. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, Pa. Consult latest version. 4. Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr. 1991. Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5. Jorgensen, J.H. and J.D. Turnidge. 2003. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods, p. 1108-1127. In Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5
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