SCUOLA REGIONALE DI DI FORMAZIONE SPECIFICA IN IN MEDICINA GENERALE -- CORSO 2008-2011 IMMUNITA ED ED ESAMI DI DI LABORATORIO Dott.ssa Laura Laura Albertazzi Dott.ssa Maria Maria Brini Brini Reggio Emilia, 24 gennaio 2011
Il sistema immunitario Immunità innata Immunità specifica PROGRAMMA DI OGGI Immunità cellulare (i linfociti T, B, NK) Immunità umorale (gli Anticorpi) La caratterizzazione dei linfociti e delle cellule nelle infezioni e nei processi immunitari nella patologia neoplastica Gli anticorpi come indicatori di malattia e di stato immunitario come mezzi diagnostici nei test di laboratorio
IL SISTEMA IMMUNITARIO Garantisce l immunità innata risposta precoce, ma aspecifica Barriere naturali Cellule ad attività fagocitica : polinucleati, macrofagi e NK Proteine del sangue: C, mediatori dell infiammazione, citochine Garantisce l immunità acquisita risposta specifica ma più tardiva, la memoria, il self e non self Meccanismi cellulari dei linfociti T e B Modula la produzione degli anticorpi Terminata la reazione immunitaria di risposta i meccanismi immunitari attivati vengono spenti
COOPERAZIONE NEL SISTEMA IMMUNITARIO Il sistema immunitario è costituito da una rete di componenti cellulari solubili interagenti tra loro. La sua funzione è quella di distinguere le entità presenti all interno dell organismo come self o come non-self e di eliminare quelle che appartengono al non-self (es: microrganismi, neoplasie, trapianti, sostanze estranee, ecc.). Per svolgere questo compito il sistema immunitario ha evoluto due meccanismi: le difese naturali aspecifiche e l immunità vera e propria, le quali sono legate una all altra e si influenzano reciprocamente.
Da Abbas Lichtman Pober, Immunologia cellulare e molecolare
PRINCIPALI ORGANI LINFATICI PRIMARI E SECONDARI
Da Abbas Lichtman Pober, Immunologia cellulare e molecolare
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Da Abbas Lichtman Pober, Immunologia cellulare e molecolare
Le cellule coinvolte nelle risposte immunitarie specifiche sono i linfociti, cellule accessorie specializzate che partecipano alla attivazione linfocitaria e le cellule effettrici che svolgono la funzione di eliminare l Antigene I linfociti sono le uniche cellule in grado di riconoscere specificatemente l Ag e sono responsabili delle due caratteristiche che definiscono le risposte immunitarie specifiche : - la SPECIFICITÀ e - la MEMORIA Le cellule accessorie non esprimono recettori per l Ag clonalmente distribuiti,ma partecipano attivamente all avvio delle risposte immunitarie specifiche. Comprendono : Fagociti mononucleati Cellule dendritiche Cellule follicolari dendritiche
Da Abbas Lichtman Pober, Immunologia cellulare e molecolare
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I linfociti T riconoscono Ag estranei solo quando i peptidi da essi derivati siano legati a molecole MHC autologhe I linfociti CD4+ riconoscono peptidi legati a molecole MHC di classe II (peptidi derivati da proteine extracellulari internalizzati nelle vescicole endocitiche delle APC) I linfociti CD8+ riconoscono peptidi legati a molecole MHC di classe I, (peptidi derivati da molecole citosoliche in genere di derivazione endogena- cioè sintetizzate dalla stessa APC) Nel timo a partire da precursori CD4+ CD8+, si sviluppano cellule ristrette per classe II che esprimono solo CD4, e di cellule ristrette per classe I che esprimono solo CD8 I CD 4 sono linfociti T helper la cui funzione principale è la secrezione di citochine e la difesa dell ospite da microbi extracellulari I CD8 sono CTL deputati a eradicare le infezioni dovute a microbi intracellulari e ad uccidere delle cellule bersaglio infettate e le cellule tumorali I linfociti B sintetizzano e secernono anticorpi, alcuni sono riconoscibili come plasmacellule
COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA (MHC) Il riconoscimento del self dal non-self è in larga parte determinata dai prodotti del MHC, i cui geni si trovano sul cromosoma 6, appartengono alla superfamiglia dei geni delle Ig e sono soggetti a ricombinazione genica. I prodotti del MHC di classe I (HLA-A,-B, e C) sono ampiamente distribuiti nell organismo e sono presenti sulla superficie di tutte le cellule nucleate e sulle piastrine. I prodotti del MHC di classe II (HLA-D,-DR,-DP, - DQ) hanno una distribuzione più limitata sulle cellule B, sui macrofagi, sulle cellule dendritiche, sulle cellule di Langerhans e sulle cellule T attivate (ma non su quelle quiescenti).
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Maturazione linfocitaria Processo che porta i linfociti progenitori ad esprimere recettori per l antigene altamente diversificati, in grado di riconoscere e rispondere ad una vastissima gamma di molecole estranee e non rispondere agli antigeni self. Le fasi precoci della maturazione delle cellule T e B sono caratterizzare da una elevata attività mitotica con marcata espressione numerica della progenie dei relativi precursori in modo da ottenere un numero di cellule abbastanza ampio da permettere la creazione di un repertorio altamente diversificato di linfociti antigene-specifici
Ogni clone di linfociti T e B produce un recettore per l antigene assolutamente unico La generazione del gran numero di recettori antigenici diversi espressi sulla membrana dei linfociti T e B avviene tramite un processo di ricombinazione somatica dei geni mediante il quale un piccolo numero di sequenze di DNA presenti nella linea germinativa, inizialmente separate tra loro, vengono variamente ricongiunte in una serie pressochè infinita di combinazioni, grazie all eliminazione, da parte di speciali enzimi, dei segmenti tra loro interposti (ricombinazione VDJ ) Tale ricombinazione non dipende e non è influenzata dalla presenza dell antigene e quindi i recettori antigenici vengono espressi prima dell incontro con l antigene Nel corso di maturazione linfocitaria viene espresso prima un recettore immaturo, che poi matura nel linfocia maturo; se il processo di ricombinazione somatica dei geni dei recettori antigenici non riesce a generare un gene funzionante per le Ig o TCR le cellule muoiono per apoptosi
Dopo che i linfociti immaturi hanno espresso il recettore per l Ag, le cellule utili vengono salvaguardate mentre quelle inutili o potenzialmente dannose, perché in grado di riconoscere antigeni autologhi, vengono eliminate (selezione positiva o negativa ) Selezione positiva : salvaguardia i linfociti dotati di specificità utili Selezione negativa: elimina i linfociti in via di maturazione reattivi verso costituenti antigenici autologhi presenti negli organi linfoidi primari
Il riconoscimento specifico dell Ag è determinante per l attivazione linfocitaria. E affidato a due glicoproteine, strutturalmente simili, ed espresse dai linfociti: gli Ab espressi sulla membrana per i Linfociti B BCR il Recettore per l Ag per i Linfociti T TCR
Linfociti Gamma-Delta TCR γ/δ è un recettore associato alle catene del CD3 espresso in una sottopopolazione di cellule T scarsamente rappresentata. Questi linfociti in genere non esprimono né CD4 né CD8, mostrano molte delle attività dei linfociti CD3 α/ß ( secrezione di citochine e lisi cellule bersaglio). Espressi nel 5% circa dei linfociti T ma variabili a seconda dei tessuti Non riconoscono peptidi in associazione con molecole MHC e quindi non sono soggetti alla restrizione MHC I linfociti con TCR α/ß e quelli con TCR γ/δ appartengono a due diverse e separate linee differenziative, derivate da un unico precursore midollare e anch essi maturano a livello timico. Le cellule che esprimono un recettore non esprimono l altro Il numero dei linfociti γ/δ è molto limitato ( anche se in teoria dovrebbe essere maggiore) perchè nella cellula matura viene usata sono un numero molto limitato dei segmenti genici V,D e J disponibili per locus ( da qui l ipotesi che tali cellule funzionino come primo argine di difesa per un numero molto limitato di microbi a larga diffusione comunemente incontrati lungo le barriere epiteliali) Neoplasie a linfociti γ/δ
IMMUNITA UMORALE ANTICORPI E IMMUNOGLOBULINE Metodi di studio di routine : Elettroforesi Immunoelettroforesi e immunofissazione Tecniche immunometriche di dosaggio
Mc Pherson Pincus, Henry s Diagnosi clinica e metodi di laboratorio
Mc Pherson Pincus, Henry s Diagnosi clinica e metodi di laboratorio
Mc Pherson Pincus, Henry s Diagnosi clinica e metodi di laboratorio
Mc Pherson Pincus, Henry s Diagnosi clinica e metodi di laboratorio
Iper-gamma policlonali Patologie da immunoodeficienza Infezioni congenite (sifilide,toxo,rubeo,citomegalovirus) Mononucleosi infettiva Tripanosomiasi Parassitismo intestinale Numerose elmintiasi Larva migrans viscerale Infezioni croniche in generale Mal.granulomatosa cronica dei bambini Patologie epatiche Patologie autoimmuni Miscellanea(s.di Down,amiloidosi,dipendenza narcotici ecc)
Da Abbas Lichtman Pober, Immunologia cellulare e molecolare
RICONOSCIMENTO CELLULE CELLULE INFIAMMATORIE- REATTIVE CELLULE NEOPLASTICHE
TECNOLOGIA UTILIZZO DI ANTICORPI MONOCLONALI CITOFLUORIMETRIA ANTICORPO: Proteina (Ig) sintetizzata da un linfocita B che riconosce un sito specifico sull antigene. ANTICORPO POLICLONALE: Ig che riconosce e si lega a determinanti antigenici differenti di uno stesso antigene. ANTICORPO MONOCLONALE: Ig diretta contro un epitopo specifico (determinante antigenico) di un antigene.
Le applicazioni dell uso degli MoAb : Identificazione di marcatori fenotipici distintivi di un articolare tipo cellulare (classificazione CD) Immunodiagnosi : utilizzo di test immunologici per svelare Ag o Ab in circolo Terapia e diagnosi dei tumori: identificazione e/o immunoterapia Analisi delle funzioni delle molecole solubili o espresse sulla membrana cellulare
Anticorpi Monoclonali in Citofluorimetria Un marcatore è un segno di identità che consente di distinguere una specifica cellula nell ambito di una popolazione. Sono molecole che possono essere espresse a livello di nucleo, citoplasma o, più spesso, nella membrana citoplasmatica Utilizzati per: indicare l appartenenza di una cellula ad una data popolazione; definire il livello maturativo e lo stato di attivazione della cellula. Elencati utilizzando la nomenclatura CD La nomenclatura CD (cluster of differentiation) fu proposta e stabilita nella prima International Workshop and Conference of Human Leucocyte Differentiation Antigens (HLDA) che ebbe sede a Parigi nel 1982. Lo scopo di questo congresso fu classificare i molti anticorpi monoclonali, generati dai diversi laboratori di tutto il mondo, che identificavano la medesima molecola Queste molecole o markers sono designate con la sigla CD seguita da un numero.per indicare se una cellula esprime o manca di un determinato marker a seguito del numero possono essere posti i simboli + o Ogni fase del processo di differenziazione delle cellule ematiche è caratterizzato dall espressione sequenziale di antigeni di membrana e/o citoplasmatici Lo studio del pattern di espressione dei marcatori CD (immunofenotipo) è rilevabile tramite tecniche citofluorimetriche
CITOFLUORIMETRIA La citometria a flusso è una tecnica che consente, attraverso un opportuna marcatura, una rapida misurazione di molteplici proprietà biofisiche e biomolecolari degli elementi cellulari, mentre questi sono trasportati all interno di un sottile flusso continuo di liquido attraversato da un raggio laser. Questo permette di riconoscere e differenziare le popolazioni cellulari attraverso la dimostrazione di caratteristici corredi antigenici che ne connotano la derivazione, il livello differenziativo e l atteggiamento funzionale Caratteristica di questa tecnica è l impiego di anticorpi monoclonali, coniugati con fluorocromi, che reagiscono specificatamente solo nei confronti di un determinante antigenico di membrana o citoplasmatico o nucleare
La citofluorimetria riveste un ruolo fondamentale nell ambito dell oncoematologia, è adattabile allo studio di leucociti, globuli rossi e piastrine, in quanto il sangue è una sospensione naturale di cellule monodisperse e c è un numero sempre più crescente di aspetti clinicamente rilevanti dalla fisiopatologia di queste cellule, che possono essere misurate con questa tecnica Utilizzando anticorpi monoclonali coniugati a composti fluorescenti è possibile identificare le singole cellule analizzate con il citofluorimetro in base ai marcatori antigenici di superficie riconosciuti dall anticorpo In una popolazione cellulare mista, i differenti fluorocromi possono essere usati contemporaneamente per identificare diverse popolazioni e sottopopolazioni cellulari. Il principio di questo test sfrutta infatti la capacità di un anticorpo monoclonale di legarsi alla superficie delle cellule che esprimono un preciso determinante antigenico
CITOFLUORIMETRIA RAPIDITA DI ESECUZIONE E PROFONDITA DELLE INFORMAZIONI DIAGNOSI MONITORAGGIO MALATTIA RESIDUA RECIDIVE
VALORI DI RIFERIMENTO DELL IMUNOFENOTIPO relativi ai CD di routine (popolazione adulta) CD MEDIA % RANGE % 2 3 4 8 19 20 16 56 75 73 44 30 12 12 9 13 60-90 60-85 29-59 19-48 3-22 4-25 4-24 6-34 RAPPORTO CD4/CD8 0.8/2.8
VALUTAZIONE POPOLAZIONI CELLULARI PERIFERICHE CD4-CD8-CD3-CD19 VALUTAZIONE POPOLAZIONI CELLULARI MIDOLLARI PATOLOGIE INFETTIVE (VIRALI) LNH-B LINFOMI T RICERCA, IDENTIFICAZIONE e QUANTIFICAZIONE dei BLASTI MIELOIDI LINFOIDI
MARCATORI PER LEUCEMIE ACUTE NON-LINEAGE LINEA MIELOIDE LINEA LINFOIDE MARCATORI PER LEUCEMIE CRONICHE / LINFOMI LINFOMI B LINFOMI T
Referti Routine CD3 CD3/4 CD3/8 CD56 CD 19 Immunosomma: T+B+NK ( 95/105 %) Valori % ed assoluti Rapporto CD4/CD8
Normale
Inversione CD4/CD8
Virosi
Gamma-Delta
TCR
HIV
LLC
HCL
ANTIGENI E ANTICORPI Il sistema AB0 come esempio di reazione Ag-Ab Differenze di molecole espresse sulla membrana eritrocitaria : Stessa proteina chiamata sostanza H Diversi enzimi che aggiungono uno zucchero diverso: su emazie gruppo A residuo alfa-n-acetil-galattosamina su emazie gruppo B residuo alfa-d-galattoso
LE TECNICHE IMMUNOMETRICHE Affinità tra molecole Enzima-substrato Ormone-recettore Antigene-anticorpo Reazione Ag-Ab Ampia utilizzazione in laboratorio Identificazione Ag o Ab Identificazione vari tipi di segnale Possibilità varie tecniche (fase solida) Ottimizzazione metodiche ->sensibilità = 0,1 pg/ml di Ag nel sangue 1959 Yalow descrive una metodica RIA (marcatore radioisotopico)
Mc Pherson Pincus, Henry s Diagnosi clinica e metodi di laboratorio
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Metodo immnuo-cromatografico Mc Pherson Pincus, Henry s Diagnosi clinica e metodi di laboratorio
RIMeL / IJLaM 2007;3(suppl)
CORRELAZIONE LOG-LINEARE
SET- POINT DI REGOLAZIONE
RIMeL / IJLaM 2009
I MARKERS ONCOLOGICI
MoAb utilizzati in terapia e diagnosi Mc Pherson Pincus, Henry s Diagnosi clinica e metodi di laboratorio