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Si tratta di vettori che consentono il clonaggio e l espressione di due diversi geni bersaglio Contengono due unità di espressione, ciascuna regolata da un promotore T7lac distinto 2
OVERNIGHT EXPRESS AUTOINDUCTION SYSTEMS Tali sistemi consentono un incremento della massa cellulare e della resa di proteina di interesse, rispetto ai sistemi convenzionali di E.coli ricombinante indotto con IPTG Si tratta di un metodo di crescita e di induzione che si basa su componenti del mezzo di coltura, i quali sono metabolizzati in maniera differenziale, promuovendo la crescita delle cellule batteriche ad alta densità e l induzione automatica dell espressione delle proteine ricombinanti sotto il controllo di promotori lac L overnight express system 1 contiene 3 soluzioni: 1) una fonte di carbonio ottimizzata per favorire la crescita cellulare, l induzione con lattosio e la successiva ripresa della crescita; 2) una soluzione tampone concentrata in grado di mantenere valori di ph neutri e fornire nitrogeno addizionale, necessario per sostenere l incremento della sintesi proteica; 3) una soluzione che fornisce il magnesio necessario per il raggiungimento di elevate densità cellulari Tali componenti possono essere aggiunti a mezzi di coltura tradizionali privi di glucosio 3
VANTAGGI DELL OVERNIGHT EXPRESS AUTOINDUCTION SYSTEM CONSENTE LA CRESCITA CELLULARE E L INDUZIONE DELL ESPRESSIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI SENZA LA NECESSITA DI MONITORARE LA DENSITA CELLULARE O AGGIUNGERE L INDUTTORE 4
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L utilizzo di diversi terreni di coltura spesso determina differenze notevoli nei livelli di espressione Per definire i parametri generali dell espressione è di solito adoperato il terreno LB Si può poi procedere ad effettuare delle prove utilizzando altri terreni 7
Le colture batteriche tendono a perdere la resistenza all antibiotico ampicillina, dal momento che gli elevati livelli di enzima β-lattamasi secreto e la riduzione del ph del mezzo di coltura associata alla fermentazione determinano la degradazione dell antibiotico Si può sostituire il mezzo di coltura con un mezzo di coltura fresco contenente ampicillina o si può utilizzare l antibiotico correlato carbenicillina, il quale è meno sensibile a bassi valori di ph Nella maggior parte dei vettori pet il gene codificante la β-lattamasi è localizzato a valle del promotore T7, nello stesso orientamento l enzima si accumula nelle colture di cellule batteriche indotte L orientamento del gene codificante la β-lattamasi è stato invertito nei vettori pet- 43 e pet-44 la trascrizione guidata dall RNA polimerasi T7 non determina l aumento dei livelli dell enzima β-lattamasi 8
L ossigeno si discioglie solo in misura limitata nei mezzi acquosi Con l aumento della densità cellulare si verifica una riduzione della percentuale di ossigeno disciolto nel mezzo di coltura Immettere nel mezzo di coltura grandi quantità di ossigeno o applicare un agitazione vigorosa non sempre risolve il problema l ossigeno si discioglie molto lentamente CONSEGUENZE In condizioni di scarsità di ossigeno, la crescita esponenziale rallenta e la coltura entra presto in fase stazionaria Una conseguenza è la produzione, da parte delle cellule ospiti, di proteasi RIMEDI Ottimizzare l areazione e l agitazione Aggiungere al mezzo sostanze chimiche che aumentino la solubilità dell ossigeno 9
L aggiunta di IPTG ad una concentrazione di 0,4 mm è raccomandata nel caso dei sistemi pet Per i promotori lac o T7lac è consigliata una concentrazione di IPTG pari ad 1 mm La concentrazione ottimale di IPTG è determinata in maniera empirica variare la concentrazione di IPTG tra 0.01 e 5 mm In alcuni casi è importante indurre la trascrizione lentamente (basse concentrazioni di IPTG) per non caricare eccessivamente il macchinario biosintetico del batterio Un parametro di fondamentale importanza è la temperatura alla quale sono fatti crescere i batteri prima e durante l induzione 10
La crescita degli ospiti batterici a 37 C determina l accumulo di alcune proteine ricombinanti nei corpi di inclusione L incubazione a 30 C favorisce la produzione di proteine ricombinanti solubili ed attive La crescita e l induzione a 25 C o 30 C possono risultare ottimali se si desidera la secrezione della proteina ricombinante nello spazio periplasmico, sfruttando la presenza del peptide segnale In alcuni casi un induzione prolungata (over-night) a basse temperature (15 C - 20 C) ha consentito di ottenere maggiori rese di proteine ricombinanti solubili 11
Nei recipienti di coltura piccoli (da 1 a 5 litri), l induzione si realizza facilmente variando la temperatura o aggiungendo un induttore chimico Nei bioreattori di dimensione industriale la variazione di temperatura richiede tempo (da 30 a 60 minuti) ed energia In maniera simile l aggiunta di un induttore chimico (IPTG) può rendere il processo molto costoso, inoltre l aggiunta alle vasche di coltura/fermentatori richiede tempo e crea disomogeneità Si può adoperare un sistema a due plasmidi il repressore ci è posto sotto il controllo del promotore trp in un plasmide a basso numero di copie mentre il gene di interesse è posto sotto il controllo del promotore p L In assenza di triptofano il promotore trp si attiva ed è sintetizzata la proteina repressore che inattiva il promotore p L In presenza di triptofano è disattivato il promotore trp con l arresto della sintesi della proteina repressore ci il promotore p L acquista piena attività 12
Le cellule possono essere coltivate in un terreno non costoso contenente piccolissime quantità di triptofano libero. L induzione è poi realizzata aggiungendo al mezzo il triptone che contiene abbastanza triptofano libero da indurre la trascrizione in maniera efficiente. 13
Ridurre il sovraccarico metabolico Eludere il problema del mantenimento del plasmide (tramite antibiotici o altri metaboliti costosi) in scala industriale Maneggiare microrganismi ricombinanti in cui il DNA clonato non venga né trasferito né perduto COME? Indirizzare la sequenza di DNA verso un sito di integrazione non essenziale del cromosoma batterico (ricombinanzione) Controllare il gene inserito con un promotore regolabile 14
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Ligation Independent Cloning: Efficient Directional Cloning of PCR Products Robert E. Novy, Keith W. Yaeger and Kristin M. Kolb Novagen, Inc. 18