FETAL TRISOMY 21, 18, 13

FETAL TRISOMY 21, 18, 13 NIPT Non Invasive Prenatal Test cell free fetal DNA in maternal blood June 2014

FETAL TRISOMY 21, 18, 13 NIPT Non Invasive Prenatal Test, cell free fetal DNA in maternal blood Novembre 2014 Lamberto Camurri Antonio Novelli Schede tratte dalle lectures OSPEDALE di Circolo e Fondazione Macchi, Varese. Test Genetici: cosa fare? Diagnosi Prenatale non Invasiva. Corso ECM. Varese 9 dicembre 2013. CC VILLA SERENA Genova. Diagnostica Prenatale. Test su DNA fetale in sangue materno: tecnica, limiti, consulenza. Corso ECM. 24 Gennaio 2014. CAM LABCO. Monza. NIPT. DNA fetale nel plasma materno: dai trials alla clinica. NIPT on field: esperienza sul campo. Corso ECM. Monza 31 Marzo 2014 SIGU Riunione scientifica congiunta: NIPT, potenzialità, limiti e proiezione futura. Round Table, Roma 1 Aprile 2014. GYNEPRO Bologna. Giornate Medico Scientifiche. Identificazione non invasiva delle aneuploidie fetali nel sangue materno: metodiche a confronto. Corso ECM. Bologna 16 Maggio 2014 RDI PADOVA. Prevenzione preconcezionale, diagnostica predittiva non invasiva e tutela per il futuro. Limena (PD) 29 maggio 2014 UNIVERSITA DI PARMA UOC Ostetricia e Ginecologia. Nuove prospettive nella Diagnosi Prenatale. NIPT, Non Invasive Prenatal Test. Corso ECM. Parma 4 Giugno 2014 SCUOLA MEDICA OSPEDALIERA ROMA. XGS, NIPT, RT-PCR. Novità, orientamenti, percorsi diagnostici. Corso ECM, Roma 9-10 giugno 2014 UNIVERSITA DI PADOVA-DIMED. Corso Perfezionamento Nuove Tecnologie Medicina Molecolare 2013/2014. Padova 6 Novembre 2014 RDI Rete Diagnostica Italiana, Padova. Ospedale San Pietro Fatebenefratelli, Roma. Mendel Genetica Medica, Modena. Università Tor Vergata Genetica Medica, Roma.

Norton M, et al. ACOM meeting 2014, oral presentation

ccfdna NIPTest. L origine. Il DNA fetale presente nel plasma materno proviene dalla placenta Nel sangue materno in gravidanza sono presenti cellule fetali nucleate e DNA libero non cellulare in sospensione nel plasma. Il DNA libero non cellulare (cffdna) proviene da cellule della placenta. Il citotrofoblasto placentare si ancora alla decidua parietale. Le arterie spirali della decidua irrorano le lacune fra decidua e placenta. Il citotrofoblasto invade e tappezza le pareti delle arterie spirali e ne causa il rimodellamento. Il ricambio delle cellule del trofoblasto che tappezzano le pareti delle arterie spirali per morte cellulare o apoptosi (citochine - mediata) determina la frammentazione del DNA in degenerazione. I frammenti di DNA hanno dimensioni di circa 180 bp (paia di basi) e si sospendono nel plasma arterioso. La presenza di DNA del trofoblasto (feto) libero nel plasma (cffdna) si riscontra a partire dalla 5^ settimana di gravidanza, ma la quantità è sufficiente per i test a partire dalla 10^ settimana. Anche la degenerazione degli epiteli materni libera frammenti di DNA sospesi nel plasma a generare un miscuglio di DNA di madre e placenta-feto.

La cattura del DNA fetale GENOME 3.2 BILLION bp Il genoma umano è costituito da 3,2 miliardi di paia di basi. Il cromosoma 21 da 50 milioni di paia di basi, 1,5% del totale. La ricerca del DNA fetale può avvenire sequenziando i frammenti di tutto il genoma o selezionando solo i frammenti dei cromosomi che interessano. Un campione di sangue materno dopo la 10^ settimana di gravidanza contiene circa 65000 frammenti di DNA del cromosoma 21, ciascuno di 180 paia di basi. La linea di sequenziamento è l unità operativa del test. Ogni linea di sequenziamento (sequencing lane) può leggere 100 Gbasi (100 milioni di blocchi/ reads) di basi DNA. In una linea di sequenziamento devono stare un numero di campioni sufficiente da confrontarli fra loro e prevedere la probabilità che ciascuno di essi sia disomico o trisomico. Le tecniche di sequenziamento di ultima generazione (Next Generation Sequencing, XGS) consentono di quantificare e analizzare i frammenti di DNA circolante. Due tecniche: MPSS sequenzia in modo massiccio tutto il genoma senza distinguere i comosomi di interesse. DANSR sequenzia i frammenti di DNA selezionati per i cromosomi di interesse.

La cattura del DNA fetale: sequenziare il genoma Per individuare una trisomia 21 sequenziando tutto il genoma occorre un numero di blocchi di lettura di sequenze grande abbastanza da rivelare un aumento del 30% dei blocchi relativi al Cromosoma 21. Ogni linea di sequenziamento (sequencing lane) può leggere 100 Gbasi (100 milioni di blocchi/ reads) di basi DNA. In una linea di sequenziamento devono stare un numero di campioni sufficiente da confrontarli fra loro e prevedere la probabilità che ciascuno di essi sia disomico o trisomico. 25 million reads MPSS, massive parallel shotgun sequencing (Verinata Verifi, Sequenom MaterniT21, BGI Nifty) Analizza in modo indiscriminato tutti i cromosomi. Per identificare una trisomia 21 servono 25 Gb (25 milioni di blocchi) di letture di sequenza in una linea che ne legge 100 milioni. Se vengono analizzati blocchi più piccoli, 10 milioni o 17 milioni per esempio, la dose di frammenti del campione trisomico non si distingue da quello disomico. MPSS esegue non più di 4 o 5 test in contemporanea per linea. L analisi massiccia di tutti i cromosomi evidenzia le differenze di densità di basi GC che ostacolano il risultato. Il campione con trisomia 21 può non essere identificato. E necessario introdurre un Fattore di Normalizzazione (CNV) che consente di rendere confrontabili i blocchi di lettura delle sequenze. CNV

La cattura del DNA fetale: sequenziare solo i cromosomi 21, 18, 13 Per identificare una trisomia 21 (o 13 o 18) è possibile selezionare i frammenti di DNA dei cromosomi, eliminando il resto del genoma. Ogni linea di sequenziamento (sequencing lane) può leggere 100 Gbasi (100 milioni di blocchi/ reads) di basi DNA. In una linea di sequenziamento devono stare un numero di campioni sufficiente da confrontarli Fra loro e prevedere la probabilità che ciascuno di essi sia disomico o trisomico. DANSR (Ariosa Harmony) Esegue il sequenziamento (high multiplexed) selettivo dei frammenti di DNA (DANSR) solo dei cromosomi 21, 18, 13. La selezione dei frammenti avviene ibridando sonde fluorescenti a: 576 marcatori STR non polimorfi dei cromosomi (21, 18, 13) per la ricerca delle trisomie 192 marcatori STR polimorfi di cromosomi fra 1 e 12 per definire la frazione fetale di ciascun campione. Solo i frammenti agganciati alle sonde fluorescenti verranno sequenziati per il dosaggio e la elaborazione. 1 million reads Per identificare una trisomia 21 serve 1 milione di blocchi di sequenza. Se vengono analizzati blocchi più piccoli, la dose di frammenti del campione trisomico non si distingue da quello disomico. DANSR esegue 96 test per linea di sequenziamento. Sparks AB et al. AJOG 2012, 319e2

La quantità del DNA fetale: il test deve indicare la frazione fetale del campione La frazione fetale minima di ciascun cromosoma per poter identificare una trisomia è il 4%. Con questa percentuale il rapporto di letture di sequenze fra un feto normale e uno trisomico è 1,02, che è il rapporto minimo per identificare la trisomia. MPSS (Verinata Verifi, Sequenom MaterniT21, BGI Nifty) Questo metodo analizza in modo indiscriminato tutti i cromosomi, e al momento non riporta i loci polimorfi dei singoli campioni necessari per definire la quantità di frazione fetale. L esito/test report non riporta la frazione fetale. DANSR (Ariosa Harmony) Esegue il sequenziamento multiplo (high multiplexed) dei frammenti di DNA (DANSR). Per definire la frazione fetale vengono usati 192 loci polimorfi (SNP di cromosomi 1-12) per la distinzione feto madre. Tale reazione avviene contemporaneamente al sequenziamento per i cromosomi 21, 18, 13. L esito/test report riporta la frazione fetale del campione. Fetal Frac)on Expected ra)o for Trisomy 4% 1.02 10% 1.05 20% 1.10 40% 1.20

Calcolo del rischio di trisomie 21, 18, 13 Il test calcola il rapporto di verosimiglianza fra le probabilità che i campioni contenuti in una linea di sequenza siano disomici o trisomici. MPSS (Verinata Verifi, Sequenom MaterniT21, BGI Nifty) Algoritmo per definire il valore soglia di rischio trisomia basato su: One sample set Il calcolo su singolo campione è reso necessario dal ridotto numero di test per linea di sequenza. 1) ipotesi binaria positivo-negativo con t-student (z-score) e Likelyhood Odds Ratio (rapporto di verosimiglianza). 2) fattore di normalizzazione di sequenza CNV. 3) Variazioni di corsa fra le varie linee di sequenziamento corrette con un algoritmo z-score. 4) Definizione di un valore soglia per la trisomia (valore di z-score fra 3 e 4) L algoritmo non considera la frazione fetale. Quindi con frazione fetale bassa i valori di score +/- sono molto vicini, aumentando la possibilità di falso positivo e negativo. DANSR FORTE (Ariosa Harmony) Algoritmo per definire il valore soglia di rischio trisomia basato su: Multiple sample set Il calcolo su campioni multipli è reso possibile dalle piccole dimensioni del blocchi di lettura di sequanza (1 milione di reads) che consente l analisi in una linea di sequenza di 96 campioni che vengono paragonati fra lori. 1) Ipotesi percentuale con Odds ratio (rapporto di verosimiglianza) fra modelli disomico/trisomico, (curve normali di distribuzione) 2) Calcolo della frazione fetale 3) Montecarlo Simulation che inserisce anche età materna e epoca gestazionale nel calcolo dell algoritmo FORTE. L algoritmo considera la frazione fetale. Quindi i valori dello score con frazione fetale bassa sono normalizzati consentendo una valutazione del rischio indipendente dalla quantità di DNA fetale. Sparks AB et al. AJOG 2012, 319e2

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: companies Gli agreements internazionali sono configurati sui tests delle companies indicate e sulla produzione scientifica collegata ai trials clinici che hanno dimostrato i dati di sensibilità e specificità dei NIPT.

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdnacffdna: studi di validazione e discrepanze placentari. Il paragone CVS trophoblast vs. cffdna negli studi di validazione 2011-2013 Mosaicismo confinato a CVS trophoblast : falsi negativi e falsi positivi NIPT performance metaanalisi in studi validazione (PubMed 2011-2013) La sensibilità (detection) di un test è: N FN/N TP (falsi negativi/veri positivi) La specificità di un test è: N FP/N TN (falsi positivi/veri negativi)

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: studi di validazioneand e discrepanze placentari. Mosaicismo confinato a CVS trophoblast : falsi negativi e falsi positivi False negative trophoblast False positive trophoblast-all False positive trophoblast CPM>30% Trisomy 21 0.2 (52000) 8 vs 1073 T21 1.1 (52000) 57 vs 1073 T21 0.8 (52000) 39 vs 1073 T21 Trisomy 18 0,1 (52000) 6 vs 376 T18 1.1 (52000) 54 vs 376 T18 0.6 (52000) 32 vs 376 T18 Trisomy 13 sporadic 1 vs 135 T13 2.5 (52000) 127 vs 135 T13 1.7 (52000) 84 vs 135 T13 Total false negative rate 0.08 Grati FR et al. Genetics in Medicine advance online publication 13 February 2014. doi:10.1038/gim.2014.3, modified

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: falsi negativi

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: falsi positivi

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: performances in popolazione generale La sensibilità (detection) di un test è: N FN/N TP (falsi negativi/veri positivi) La specificità di un test è: N FP/N TN (falsi positivi/veri negativi)

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: performances Aneuploidie cromosomi X e Y Sex aneuploidy Birth prevalence (with mosaics) X0* 1 in 1,893 girls X0 female somatic rate XXX XXY XYY 1 in 947 girls 1 in 576 boys 1 in 851 boys *Test performance Monosomy X 1-4 Detection rates 66-95% with wide confidence intervals False positive rates up to 1% Performance for mosaics unknown CVS False negative trophoblast False positive trophoblast-all False positive Trophoblast CPM>30% Monosomy X 0.2 total 11 vs 148 MX. 5.5 total 278 vs 148 MX 4.0 total 198 vs 148 MX 1. Nielsen et al. Human Genetics 1991, 87: 81-83. 2. Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Sixth Edition. Robert L. Nussbaum, Roderick McInnes, Willard Huntington. Saunders, 2001.

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: performances Gravidanze gemellari/multiple Twins/multiple 2 max Valore di rischio distribuito regular No sex, no identificazione feto affetto I test NIPT sono eseguibili in gravidanze con due feti, sia da fecondazione naturale che assistita, anche con ovodonazione. IVF No sex, no identificazione feto affetto Oocytes etero No sex, no identificazione feto affetto 192 cases* Detection Retro, 10/11; Prosp, 3/3 Trisomies Specificity 100% no false positive DNA fetal fraction m 7,4% (12% single) *Gil M et al 2013 Fetal Diagn Ther 10.1159 La casistica è ridotta quindi la performance del test non è validata. Il rischio di falso negativo dipende da due fattori: La frazione fetale nelle gravidanze twin è in media più bassa che in quelle singole, il che si lega anche alla possibilità che vi sia un feto predominante come sviluppo e come contributo di DNA fetale al test.

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: nuovo paradigma, le microdelezioni I test NIPT su cffdna sono in grado di cercare la presenza di microdelezioni. Le companies hanno sperimentato la identificazione delle microdelezioni causanti le più comuni sindromi da microdelezione. Al momento i test non sono supportati da trials di validazione in vivo su pazienti gravide, la specificità è bassa con falsi positivi dovuti a imprecisioni di sequenziamento. Nessuna Società Scientifica o College ha attivato criteri di agreement. Natera Panorama: 22q deletion syndrome (DiGeorge syndrome), 1p (1p36 deletion syndrome), 15q (Prader-Willi/Angelman syndromes), 5p (Cri-du-chat syndrome) Maternity21 plus. (PPV 60-90%) 22q deletion syndrome (DiGeorge syndrome), 5p (Cri-du-chat syndrome), 15q (Prader-Willi/Angelman syndromes) 1p (1p36 deletion syndrome) BGI Nifty: 2p33.1 deletion syndrome, 5p (Cri-du-chat syndrome, 1p (1p36 deletion syndrome) Verinata Verifi: 22q deletion syndrome (DiGeorge syndrome), 5p (Cri-du-chat syndrome) 15q (Prader- Willi/Angelman syndromes) 1p (1p36 deletion syndrome), 4p (Wolf Hirschhorn syndrome)

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: 1-2 nd Trimester Screen Flow NIPT U/S with NT LOW RISK ANATOMY U/S low risk NIPT increased NT abnormal US HIGH RISK high risk NIPT increased NT abnormal US maternal choice 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 CVS AMNIO

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: 1-2nd Trimester Screen Flow 10 high risk NIPT increased NT abnormal US 11 12 13 14 high risk NIPT abnormal US 15 16 17 18 CVS Deletion/duplication 500,000 DNA bases 19 20 AMNIO abnormal US Deletion/duplication 15,000,000 DNA bases

Identificazione delle Trisomie Fetali con cffdna: Opzioni finali So Mom....break the News. but informed.