DNA fetale su sangue materno

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1 DNA fetale su sangue materno Sabrina Frusconi SOD Diagnostica Genetica AOU Careggi Firenze

2 DNA fetale su sangue materno Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale Determinazione non invasiva dell RhD fetale Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

3 DNA libero circolante nel plasma materno DNAliberocircolante:DNAmaterno +DNAfetale Origine:apoptosidelcitotrofoblasto Frammentato (143bpinmedia) Presenteapartiredalla5 a settimana digravidanza Laquantitàdi cffdna aumenta conl etàgestazionale Il DNA di origine fetale è in percentuale variabile : 5-15% del DNA circolante totale (10-20 settimana di gestazione)

4 DNA libero circolante nel plasma materno Caratteristiche cffdna Presente nel plasma materno precocemente (4-5 sett) (Lo YM et al 1998) Rapida clearance dopo il parto (Lo YM et al 1999) Rappresentativo del genoma fetale totale (Lo Y et al 2010) Vantaggi Diagnosi precoce Gravidanza-specifico Analisi di qualsiasi regione genomica fetale

5 Progetto Ricerca di DNA fetale circolante nel plasma materno: prospettive per la diagnosi non invasiva di Sindrome di Down (trisomia 21), Sindrome di Edwards (trisomia 18), Sindrome di Patau (trisomia 13) Centro Unico Diagnosi Prenatale Ospedale Palagi, Firenze Dr. E. Periti SOD Diagnostica Genetica AOUC Careggi, Firenze Dr.ssa F. Torricelli Ospedale Misericordia Dr. E. Colosi Università di Napoli Federico II Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche Dr.ssa A. Conti 2300 casi reclutatida Settembre2012 Criteri di arruolamento Età > 18 anni Gravidanza singola Storia clinica negativa per malattia oncologica pregressa o in atto Follow-up -QF-PCR/cariotipo -alla nascita

6 DNA fetale su sangue materno Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale Determinazione non invasiva dell RhD fetale Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

7 Determinazione precoce e non invasiva del sesso genetico fetale Amplificazione SRY Amplificazione DYS14 MASCHIO + + FEMMINA - - DYS14 (multicopia) DNA fetale scarso? SRY Utilizzo di marcatori indipendenti dal sesso fetale per confermare la presenza di DNA fetale (RASSF1A) 1) SRY (Yp11.3) 2) DYS14 (Yp11.2) DYS14 array GENE MULTICOPIA (n copie: 11-78), PER RIDURRE LA POSSIBILITÀ DI FALSI NEGATIVI

8 BMC Research Nores 2012, 5:476 Non-invasive prenatal diagnostic test accuracy for fetal sex using cell-free DNA a review and meta-analysis Caroline F. Wright, Yinghui Wei, Julian PT Higgins and Gurdeep S. Sagoo 3,4% falsi negativi 1,2% falsi positivi Results: Ninety studies, incorporating 9,965 pregnancies andoverall mean sensitivity was 96.6% and mean specificity was 98.9%. These results vary very little with trimester or week of testing, indicating that the performance of the test is reliably high. ACCURATO DOPO LA 7a SETTIMANA DI GRAVIDANZA In assenza di un controllo interno specifico per il DNA fetale (indicatore della presenza del DNA fetale) non si può avere la certezza assoluta dell accuratezza del risultato qualora tutti i marcatori in esame risultino negativi nell amplificazione. RICERCA DI CONTROLLI INTERNI PER IL DNA FETALE v Distinzione del DNA fetale da quello materno sfruttando il diverso pattern di metilazione di specifici geni GENE RASSF1A

9 La determinazione precoce non invasiva del sesso genetico fetale si è rivelata una metodica con una sensibilità del 99.8% Gravidanze a rischio per malattie genetiche X-linked Utilità clinica: evitare il ricorso alla diagnosi prenatale invasiva in caso di feto femmina Gravidanze a rischio per disordini della differenziazione sessuale Utilitàclinica: trattamenti farmacologici precoci Sebbene il test sia molto accurato, sarà comunque necessario confermare il sesso fetale mediante ecografia nelsecondotrimestre. La coppia dovrà inoltre essere informata sulla possibilità di dover ripetere il prelievoin caso dirisultato dubbioodicffdna nonsufficiente.

10 DNA fetale su sangue materno Il DNA fetale circolante Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale Determinazione non invasiva dell RhD fetale Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

11 Determinazione non invasiva del fattore RH fetale Gli antigeni del sistema Rh sono codificati da due geni RHCE che codifica per gli antigeni C, c, E, e RHD che codifica per l antigene D L antigene D è il più immunogeno in grado di provocare una reazione immunitaria agendo come antigene Rh+ Rh-

12 Primagravidanza Rh- Determinazione non invasiva del fattore RH fetale Rh+ Se una donna RhD negativo è immunizzata con anticorpi anti-d la determinazione prenatale del fattore RhD fetale può stabilire se il feto sia a rischio di MEN Anticorpi anti-rhd Parto Aborto Gravidanza ectopica Indagini invasive di diagnosi prenatale Traumi addominali Madre Rh-e feto Rh+ Gravidanzesuccessive Passaggio di sangue fetale nel circolo materno Anemia fetale Idrope Morte intrauterina Formazione di anticorpi (IgM) anti-rhd Alloimmunizzazione materno-fetale Anemia Ittero Danno neurologico Passaggio transplacentare di anticorpi (IgG) anti-rh(d) da madre a feto Distruzione dei globuli rossi fetali Malattia emolitica fetale e neonatale

13 Determinazione non invasiva del fattore RH fetale nelle donne Rh negativo Immunoprofilassianti-Dpost-partum Riduzionedell incidenzadialloimmunizazioneanti-ddal16%al1-2% nelledonnerh negative Immunoprofilassi anti-d prenatale a tutte le donne Rh negative non sensibilizzate (III trimestredi gravidanza)+immunoprofilassipost-partum Riduzionedell incidenzadialloimmunizzazioneanti-dallo % nelledonnerh negative 40% delle donne Rh negative ricevono un immunoprofilassi non necessaria Rischio di trasmissione di infezioni virali (agenti virali noti o sconosciuti) Rischio di reazioni allergiche o di tipo anafilattico Spreco di dosi preziose di farmaco Costi aggiuntivi

14 Determinazione non invasiva del fattore RH fetale SRY amplificato SRY nessun segnale di amplificazione RHD amplificato FETO RH+ FETO RH+ RHD nessun segnale di amplificazione FETO RH - FETO RH - DNA fetale scarso?

15 Determinazione non invasiva dell Rh fetale Utilità clinica Limitareil ricorsoall immunoprofilassi Ridurrel utilizzo di immunoglobuline anti-d Somministrare immunoglobuline anti-d dopo eventi sensibilizzanti solo se il fetorisulta RhD + Possibilità di offrire un immunoprofilassi prenatale solo nel caso in cui il feto risultirhd + Selezionare le gravidanze che necessitano di uno stretto monitoraggio

16 DNA fetale su sangue materno Introduzione Determinazione non invasiva del sesso genetico fetale Determinazione non invasiva dell RhD fetale Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali

17 Ricerca di DNA fetale circolante nel plasma materno: prospettive per la diagnosi non invasiva di Sindrome di Down (trisomia 21), Sindrome di Edwards (trisomia 18), Sindrome di Patau (trisomia 13) Centro Unico Diagnosi Prenatale Ospedale Palagi, Firenze Dr. E. Periti Progetto SOD Diagnostica Genetica AOUC Careggi, Firenze Dr.ssa F. Torricelli Ospedale Misericordia Dr. E. Colosi Università di Napoli Federico II Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche Dr.ssa A. Conti 2300 casi reclutatida Settembre2012 La Regione Toscana ha recentemente finanziato il progetto Ottimizzazione e validazione di un test di screening per la diagnosi prenatale non invasiva delle aneuploidie cromosomiche Delibera n. 932 del 11/11/2013

18 NGS e test prenatali non invasivi Aspetti tecnici CVS o LA DNA fetale libero circolante E quindi necessaria una metodica in grado di evidenziare variazioni molto piccole di DNA

19 NGS e test prenatali non invasivi Le nuove tecnologie di sequenziamento consentono di ottenere grandi quantità di dati di sequenza in un singolo esperimento Questo approccio consente di identificare le aneuploidie più frequenti sequenziando, mappando e contando le molecole di DNA per evidenziare «variazioni nel numero di copie» di uno specifico cromosoma, a partire da DNA totale circolante nel plasma materno

20 NGS e test prenatali non invasivi cff DNA Isolamento da plasma del DNA totale circolante Maternal DNA

21 Counting: Per ogni cromosoma vengono contate le reads che mappano sul quel cromosoma (count) Normalizzazione: I valori di count ottenuti per ciascun cromosoma vengono normalizzati per contenuto in GC e dimensioni della libreria ( n di reads ottenute per ciascun campione) Analisi statistica: calcolo dello Z-score NGS e test prenatali non invasivi Allineamento : le molecole di DNA sequenziate (reads) vengono allineate al genoma di riferimento Z-score (chr21) = # medio di reads chr21 # medio di reads ref dataset chr21 SD ref dataset chr21 Z-score tra -3 and +3 : euploide Z score >3 : trisomia Z score <-3: monosomia Zscore = 3 Paneuploidia= 0.999

22 NIPT: PPV e NPV Il valore predittivo positivo dipende dalla Sensibilità e dalla Specificità del test: in particolare, esso aumenta con l'aumentare di questidueparametri. Éperò importante sottolineare che il valore predittivo positivo dipende anche da un fattore indipendente dal test: la prevalenza della malattia nella popolazione sottoposta a screening. PPV= NPV = (Sensibilità x prevalenza) ((Sensibilità x prevalenza)+(1-specificità)x(1-prevalenza)) Specificità x (1-prevalenza) ((1-sensibilità) x prevalenza + specificitàx(1-prevalenza))

23 PPV e NPV

24 Conclusioni Determinazione non invasiva del rischio di aneuploidie fetali E un test di screening e non un test diagnostico e non può sostituire il test combinato Non valuta la presenza/assenza di una condizione genetica, ma fornisce una valutazione del RISCHIO per le aneuploidie oggetto dell indagine E sempre necessario confermare un risultato positivo/alto rischio con DP invasiva Deve essere offerta in un contesto di una consulenza pree post-test OBIETTIVO COMUNE RIDURRE IL RICORSO ALLE TECNICHE INVASIVE SELEZIONANDO PIU ACCURATAMENTE LE DONNEA RISCHIO

25 RECLUTAMENTO PAZIENTI E FOLLOW UP Centro Unico Diagnosi Prenatale Ospedale Palagi Dr E. Periti Ospedale Misericordia Grosseto Dr E. Colosi Università di Napoli Federico II Dipartimento di Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche Dr.ssa A. Conti SOD DIAGNOSTICA GENETICA Dr.ssa F. Torricelli WET LAB Sabrina Frusconi Francesca Gerundino Claudia Giachini Francesca Marin Giuseppina Marseglia Elisabetta Pelo Chiara Pescucci Fiammetta Sbernini DRY LAB Matteo Benelli Elisa Contini