Protocollo SAFE USO DEL SUBSTRATO mmrs-bpb (Lee and Lee, 2008) PER L ISOLAMENTO E LA CONTA DIFFERENZIALE DEI BATTERI LATTICI Nello studio di Lee and Lee (2008) un MRS (deman, Rogosa, Sharpe, 1960) agar contenente bromofenol blu e cisteina è stato utilizzato come substrato differenziale per alcune specie di batteri lattici. Il substrato è stato testato su 452 ceppi di fermenti lattici ed è stata messa una procedura per guidare l'identificazione di fermenti lattici. Per quanto la procedura sia in teoria applicabile anche alla discriminazione delle colonie su piastre di conta (idealmente con 10-50 colonie) essa è particolarmente adatta alle fasi iniziali dell'identificazione ed andrebbe applicata strisciando per la purificazione una colonia isolata da un substrato di conta su mmrs-bpb incubando alla temperatura usata per l'isolamento, descrivendo la colonia come indicato qui di seguito e inoculando APT modificato per la determinazione della morfologia cellulare e della produzione di CO 2 da glucosio. In caso di incertezza, una volta identificata la temperatura ottimale è opportuno ripetere il saggio, perché alcuni parametri della morfologia della colonia (in particolare la dimensione) sono influenzati dalla temperatura di incubazione per alcune specie. Reagenti e substrati Formulazione substrato mmrs-bpb: Preparare MRS broth ph 6,8 e aggiungere 12 g/l di agar. Sterilizzare a 121 C per 15 min e raffreddare a 48 C in bagnomaria. Aggiungere una soluzione sterile (per filtrazione con filtro da 0.22 µ) di bromophenol blue (BFB, concentrazione finale 0,02 g/l) e una di L-cisteina-HCl (concentrazione finale 0,5 g/l). Agitare e versare in piastra. Incubare le piastre di campionemento o purificazione a 30 C o 35 C per 48 ore in anaerobiosi (GENbox anaer, biomérieux SA, France; 2 buste AnaeroGen, Oxoid): occorre scegliere la temperatura più vicina a quella ottimale del ceppo o, se questa è ignota, usare la temperatura di incubazione delle piastre usate per la conta e dalle quali sono state prelevate le colonie per l'isolamento. In linea di massima vanno usate le seguenti temperature: Lattococchi 30 C Leuconostoc 30 C gruppo L. plantarum indifferente, preferibile 35 C gruppo L. casei indifferente, preferibile 35 C L. helveticus 35 C L. delbrueckii 35 C S. thermophilus 35 C P. acidilactici e P. pentosaceus 35 C Enterococchi 35 C Indicazioni specifiche: preparazione di MRS agar Il substrato MRS deve essere generalmente preparato da ricetta (specialmente quando devono essere usate quantità > 1 L; vedi dopo). In casi eccezionali (legati ad urgenze e quindi a tempi ridotti) può essere utilizzato MRS broth Oxoid. Quest ultimo (come indicato da confezione) ha un ph 6,2-6,3, pertanto, prima dell aggiunta di agar (12 g/l) e della sterilizzazione (121 C per 15 min) il ph deve essere corretto a 6,8 (altrimenti la colorazione del substrato dopo l aggiunta di BFB potrebbe non essere quella ideale per la corretta classificazione delle colonie). 1
Tween 80 Bacteriological peptone MRS (de Man, Rogosa e Sharpe 1960) 1 ml 10 g Estratto di carne 10 g (Lab Lemco 8 g) Estratto di Lievito 10 g Glucosio anidro 20 g (monoidrato 22 g) Potassio Monoidrogeno Fosfato Sodio Acetato Triammonio citrato Magnesio Solfato Idrato* Manganese Solfato Idrato* Agar solido Acqua Distillata 2 g 5 g 2 g 200 mg 50 mg 12 g ph 6,8 1 Litro * Il Magnesio Solfato Idrato e Manganese Solfato Idrato possono essere sostituiti da 10 ml della seguente diluizione: 2 g di Magnesio Solfato Idrato + 400 mg di Manganese Solfato Idrato in 100 ml di H 2 O distillata. Sterilizzare a 1 atm, 121 C per 15 minuti. Nota bene: controllare il grado di dratazione di magnesio e manganese solfato e ricalcolare le quantità se il grado di idratazione è diverso da quello indicato) APT modificato. (Sperber and Swan, 1976) Estratto di lievito 7,5 g Tryptone Glucosio monoidrato Sodio citrato Sodio cloruro Sodio acetato Potassio monoidrogeno fosfato Magnesio solfato eptaidrato 12,5 g 22,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g 0,8 g Manganese solfato monoidtato 0,16 g Ferro solfato eptaidrato Tween 80 0,04 g 0,2 ml Soluzione di tiamina (0,001 g in 10 ml) 1,0 ml Acqua deionizzata 1000,0 ml Correggere il ph a 6,8 e distribuire in tubi 16x100, 10 ml per tubo. Sterilizzare a 121 C per 15 min. 2
Preparazione delle soluzioni di bromophenol blue (BFB, concentrazione finale 0,02 g/l) e L-cisteina-HCl (concentrazione finale 0,5 g/l) Entrambe le soluzioni devono essere preparate in concentrazione 100 x (BFB 2 g/l e L-cisteina-HCl 50 g/l), sterilizzazte per filtrazione (membrane in acetato cellulosa 0,22 µm) e mantenute a 4 C fino al momento dell uso. Poichè le soluzioni sono concentrate 100x, devono essere aggiunte al substrato in rapporto 1 ml soluzione: 100 ml di substrato. Informazioni di sicurezza. Preparato o miscela R H S P Note MRS broth - - - - Non pericoloso, gli ingredienti non sono pericolosi, tranne quelli elencati sotto manganese solfato idrato 48/20/22/51 22-61 373-411 273 Xn, Nocivo Inquinante magnesio solfato - - - - Non pericoloso eptaidrato cisteina 22 302 262,280 Xn, nocivo per ingestione blue di bromfenolo - - - - Non pericoloso mmrs-bpb - - - - Non pericoloso APT modificato - - - - Non pericoloso 3
CARATTERISTICHE DELLE COLONIE DI BATTERI LATTICI SU SUBSTRATO mmrs-bpb Le caratteristiche descrittive delle colonie di batteri lattici, cresciuti su MRS-BPB-Agar, dovrebbero essere annotate utilizzando come riferimento una colonia purificata e ben isolata (derivante dall ultimo striscio di purificazione). Osservare le colonie derivanti dai primi due strisci di purificazione, infatti, potrebbe generare i seguenti errori: 1) osservazione di colonie molto ravvicinate, o addirittura patina, con colori ambigui e confusi 2) osservazione di colori non corrispondenti a quelli reali, generalmente più scuri o tendenti al giallo, a causa dei valori di ph più bassi in quella porzione di piastra. Spesso l aspetto delle colonie potrebbe essere annotato direttamente su piastra di conta/isolamento e non di purificazione, per la necessità di effettuare una numerazione differenziale delle diverse specie di batteri lattici o per selezionare una specie piuttosto che un altra. Le colonie vanno osservate sotto luce bianca fluorescente su uno sfondo bianco, guardandole da diverse angolazioni e usando una lente di ingrandimento se necessario. In questo caso, per ovviare agli errori precedentemente descritti, è opportuno scegliere diluizioni più spinte della sospensione cellulare in cui le colonie sono maggiormente separate. Di seguito sono descritte e codificate le principali caratteristiche delle colonie. a) DIMENSIONE (variabile Csize) Codice: 0 1 0 = Colonia piccola, puntiforme, diametro < 1 mm 1 = Colonia grande, diametro > 1 mm (in genere almeno 2-3 mm) b) FORMA-MARGINE-SUPERFICIE (variabile Cform) Codice: 0 1 0 = Colonia di forma irregolare, margine ondulato, superficie rugosa 1 = Colonia di forma rotonda, margine intero, superficie liscia 4
c) COLORE Le possibili gradazioni di colore sono 0 1 2 3 4 5 6 0 = Bianco (ccol1=0 ccol2=0) 1 = Giallo chiaro (ccol1=1 ccol2=0) 2 = Grigio (ccol1=1 ccol2=0) 3 = Celeste (ccol1=1 ccol2=0) 4 = Azzurro (ccol1=1 ccol2=0) 5 = Blu-violetto (ccol1=1 ccol2=1) 6 = Blu di Prussia (ccol1=1 ccol2=1) Nota bene: in caso di colore con combinazioni di colore (vedi sotto) il colore si riferisce sempre al colore che occupa la maggior parte della superficie della colonia, quindi se la colonia ha solo un punto scuro centrale il colore si riferisce al bordo, mentre se la colonia ha solo un margine più chiaro il colore si riferisce al centro) Per ottenere variabili binarie procedere come segue: variabile ccol1 = 0 se bianco 1 se colorato (attenzione: vale 1 anche se il colore copre solo una piccola parte della superficie, p.es. il centro) variabile ccol2 = 0 se codecolor<=4 1 se codecolor>=5 (incluso se il colore è parziale, quindi occorre guardare il colore prevalente) d) COMBINAZIONI DI COLORE CODICE: 0 1 2 0 = Colonia monocolore (ccol3=0 ccol4=0) 1 = Colonia bianca o celeste chiaro con puntino blu al centro (ccol3=1 ccol4=0) 2 = Colonia blu con alone esterno bianco o celeste chiaro (ccol3=1 ccol4=1) ccol3 0 se codecombi=0, 1 se codecombi>=1 (in pratica se il colore è uniforme, senza margini o punti centrali 0, se no 1) ccol4 0 se il colore copre <10-40% (significa che c'è solo un punto scuro centrale e il resto della colonia è più chiara) 1 se il colore copre una proporzione maggiore (solo corona circolare chiara) 5
Laboratorio di Microbiologia Industriale Esempi di morfologia di colonie su mmrsbpb. I codici binari per la dimensione (csize), form (cform), colore (ccol1, ccol2, ccol3, ccol4) sono i seguenti: 1. 111100 morfologia tipica di Pediococcus 2. 111110 morfologia tipica di Lactobacillus plantarum group 3. 111100 morfologia tipica di Pediococcus 4. 110010 morfologia tipica di Weissella cibaria 5. 110000 morfologia tipica di L. casei 6. 111111 morfologia tipica di L. fermentum 7. 111000 morfologia tipica di L. paracasei 8. 100000 morfologia tipica di L. rhamnosus 9. 101111 morfologia tipica di L. delbrueckii subsp. bulgaricus 10. 101000 morfologia tipica di L. acidophilus group 11. 011000 morfologia tipica di Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus (possono formare colonie più grandi in alcuni casi) 6
PRODUZIONE DI GAS. La determinazione della produzione di CO 2 da glucosio deve essere effettuata su una coltura ben cresciuta in APT modificato (deve essere presente torbidità abbondante o un deposito consistente). La produzione di CO 2 può essere osservata nel seguente modo a. colpire con decisione con il dito il fondo della provetta, diverse volte; se il microrganismo produce CO 2 si produrranno delle fini bollicine che saliranno in superficie formando una schiuma simile a quella della birra; in caso di dubbio agitare il tubo; se il microrganismo non produce CO 2 si osserveranno in superficie solo delle bolle di dimensioni più o meno grandi, simili alla schiuma che fa un sapone b. in caso di incertezza riscaldare un'ansa di metallo al calor rosso usando un becco Bunsen e immergerla rapidamente nel liquido; se il microrganismo produce CO 2 si svilupperà immediatamente del gas, specialmente attorno all'ansa, e le bollicine saliranno in superficie formando schiuma; in caso contrario si sentirà solo uno sfrigolio. OSSERVAZIONE MICROSCOPICA DELLA MORFOLOGIA CELLULARE DELLE DIVERSE SPECIE DI BATTERI LATTICI Morfologia dei batteri lattici I batteri lattici hanno cellule di forma coccica o bastoncellare, disposte singolarmente, in coppie o catene di lunghezza variabile. La dimensione (nel caso dei cocci e dei bacilli) e la lunghezza (nel caso dei bacilli) delle cellule, nonchè il numero di unità (cellule) per catene dipende strettamente dalla specie e, a volte, dalle condizioni di crescita. Tuttavia, la morfologia dei batteri lattici può essere generalmente classificata come descritto in seguito. Preparazione del vetrino e osservazione microscopica - preparato a goccia schiacciata: ottenuto ponendo direttamente su un vetrino ben pulito una goccia della brodocoltura cellulare, oppure stemperando con un ansa sterile una colonia (da una piastra di purificazione) in una goccia di soluzione fisiologia sterile - microscopio Axioskop Zeiss (Carl Zeiss, Germany): per osservazione con obiettivi a secco (fasce rosse, gialle e blu) non usare MAI olio; per osservazione con obiettivi ad immersione (fascia bianca) mettere una goccia di olio da immersione sul vetrino copri oggetto e osservare con obiettivo 100x a immersione. Affinchè l osservazione microscopica risulti semplice anche per operatori poco esperti è opportuno utilizzare schematicamente le seguenti impostazioni: 1) accendere microscopio (pulsante verde in basso sulla destra) 2) regolare la sorgente luminosa attraverso il reostato (manopola in basso sulla destra, vicino all interruttore di accensione): è opportuno avere una luce bianca, quindi il reostato deve essere almeno in posizione 6; se l'immagine è troppo luminosa è possibile usare i filtri neutri o colorati (pulsanti in basso a destra sulla base del microscopio) 3) eseguire una messa a fuoco preliminare (basta farlo una volta sola, se il tavolino traslatore non viene più spostato in alto o in basso) con i seguenti passaggi: posizionare il revolver sull'obiettivo Achroplan 10x (giallo) e il condensatore sulla posizione H; mettere un vetrino con un preparato a fresco SENZA OLIO sul tavolino e portare sotto l'obiettivo il bordo del vetrino coprioggetto; mettere a fuoco il bordo del vetrino; passare all'obiettivo Achroplan 40x (fascia blu, scritta nera) e correggere la messa a fuoco. 7
4) posizionare il revolver sull obiettivo Achroplan 100x Oil Ph3 (quello con le scritte in verde) 5) controllare che il condensatore (che si trova sotto il tavolino portaoggetti) sia correttamente regolato (centratura, altezza, apertura del diaframma; se non si è capaci di farlo, non smanettare a caso ma studiare il manuale o chiedere a qualcuno con maggiore esperienza) e posizionato su 3 6) regolare l apertura del diaframma di campo (posto alla base del microscopio) prima chiudendolo del tutto e poi riaprendolo fino a che l'iride esce dal campo: l'iride del diaframma di campo deve essere chiaramente a fuoco. Altrimenti rivolgersi ad un operatore esperto 7) regolare la messa a fuoco prima con la vite macrometrica e poi finemente con quella micrometrica (poste entrambi al lato del microscopio) 8) traslare il tavolino portaoggetti lungo il piano xy con le apposite manopole. 9) Avendo utilizzato l obiettivo a contrasto di fase (Ph), quando la messa a fuoco sarà corretta, le cellule appariranno come corpi blu-violetto rifrangenti immersi in un campo giallo chiaro (immagini rappresentate schematicamente nelle Figure 1-8) (il colore dipende dai filtri utilizzati) 10) Al termine dell osservazione pulire l obiettivo utilizzato con carta ottica; portare la manopola del reostato a zero e poi spegnere il microscopio. SE SI PULISCE IMMEDIATAMENTE NON E' NECESSARIO USARE SOLVENTI Di seguito sono rappresentate schematicamente le principali morfologie dei batteri lattici ed è mostrato schematicamente il microscopio. 8
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BATTERI LATTICI DI FORMA COCCICA Morfologia n.1 Morfologia n.2 10
Morfologia n.3 Morfologia n.4 11
BATTERI LATTICI DI FORMA BASTONCELLARE Morfologia n.5 Morfologia n.6 12
Morfologia n.7 MORFOLOGIE PARTICOLARI Morfologia n.8 13
Morfologia n.9 Codifica della morfologia Bc: 0 se cocci, 1 se bastoncini ST_C: 0 se isolati o in coppie/tetradi (le coppie e tetradi devono essere assolutamente prevalenti sulle catenelle) 1 se in catene (prevalentemente da 3 elementi in su) In particolare per la morfologia delle catenelle occorre chiarire che 1 significa catene prevalenti (bisogna vedere catene 2 elementi per il 20% o più) 0 significa isolati, coppie o tetradi (solo coppie, senza tetradi=1). In generale tutti gli streptococchi in rapida crescita possono avere cellule lievemente ellittiche. 14
Per l'attribuzione preliminare della specie o gruppo è possibile usare il seguente algoritmo. Riferimenti bibliografici. de Man, J.C., Rogosa, M. and Sharpe, M.E. (1960) A medium for the cultivation of lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology 23, 130-135. Lee, H. M., Lee, Y. (2008) A differential medium for lactic acid-producing bacteria in a mixed culture. Letters in Applied Microbiology 46: 676 681. doi:10.1111/j.1472-765x.2008.02371.x. Sperber, W.H. and Swan, J. (1976) Hot-loop test for the determination of carbon dioxide production from glucose by lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology 31, 990-991. 15