SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI POZZALI FRATELLI - POZZALI FRATELLI Srl Casaletto Ceredano CR - STELLA BIANCA Spa Ossago Lodigiano LO - MOLINO BRESCIANO Snc Azzano Mella BS - CRAM-BIOLAB Srl Brescia ID64/2005 PROGETTO R&S Messa a punto di protocolli di biologia molecolare per la ricerca di batteri e di miceti di utilità industriale in matrici alimentari complesse tramite utilizzo della PCR REAL TIME o sequenziamento molecolare. AREA MD BIOTECNOLOGIE ALIMENTARI DURATA 27 MESI QUADRO ECONOMICO PREVISIONE INIZIALE...... 1.100.000,00 COSTO FINALE........... 1.139.332,69 INTERVENTO FINANZIARIO EROGATO...... 385.000,00 DESCRIZIONE Il progetto è stato finalizzato alla messa a punto di protocolli di biologia molecolare per la ricerca di batteri patogeni, batteri di utilità industriale, miceti e virus in matrici agronomiche ed alimentari complesse tramite la PCR real time o sequenziamento molecolare. Il progetto ha previsto inoltre l acquisizione delle conoscenze per ridefinire i processi di controllo alimentare attuate dalle imprese nell ottica sia dell applicazione della nuova tecnologia descritta che di una integrazione dei sistemi di controllo tra le varie imprese coinvolte.
Le conoscenze acquisite con il progetto di ricerca potrebbero consentire alle imprese partner di aumentare l efficacia e l efficienza dei sistemi di controllo alimentare se non fosse per gli elevati costi di implementazione di tale tecnologia. Il progetto proposto si è posto i seguenti obiettivi fondamentali: messa a punto di protocolli di biologia molecolare per la ricerca di batteri patogeni, batteri di utilità industriale, miceti e virus in matrici agronomiche ed alimentari complesse tramite la PCR real time o sequenziamento molecolare, per la ricerca di Bacillus cereus - E. coli 0157 :H7 - Salmonella spp - Campylobacter jejuni - Yersinia enterocolotica - Aeromas hydrophila - Clostridium perfrigens - Listeria monocytogenes - Staphylococcus aureus - Batteri lattici - Aspergillus - Penicilium - Fusarium - Ogm sviluppo e realizzazione di un sistema industriale di controllo qualitativo degli alimenti basato sulla tecnologia PCR real time applicabile all intero processo produttivo della filiera agro-alimentare. Per tutti i protocolli sviluppati sono state svolte delle prove di riproducibilità e specificità, testata con esito corretto contro una serie di batteri facilmente riscontrabili in matrici alimentari. Il dato più significativo è quello della sensibilità, che ha permesso di quantificare in tutti i casi fino a 102-103 copie DNA/ml. Questo lavoro ha quindi portato all ottimizzazione di nuovi protocolli di Real-Time PCR per l identificazione molecolare dei batteri alimentari considerati, apportando miglioramenti in specificità, sensibilità e rapidità dell analisi, rispetto alle metodiche tradizionali utilizzate di routine. Il lavoro si è svolto in più fasi, dall analisi bioinformatica delle sequenze oligonucleotidiche necessarie per l identificazione molecolare, all ottimizzazione delle condizioni per il protocollo di Real-Time PCR. Dato che i protocolli di identificazione molecolare sviluppati potrebbero fornire indicazioni per la produzione di kit commerciali, la quantificazione assoluta è il metodo migliore per ottenere la quantificazione del target espresso in unità di misura internazionali, il che rende più semplice il confronto di dati provenienti da analisi e laboratori diversi. LA TECNICA DI REAL-TIME PCR Le tecniche utilizzate nella fase di verifica della corretta implementazione del sistema HACCP possono essere sia di tipo microbiologico classico sia basate su principi immunologici e di biologia molecolare. Attualmente le metodiche tradizionali ufficiali impiegate per la ricerca di microrganismi patogeni negli alimenti si basano essenzialmente sull utilizzo di mezzi di coltura selettivi che favoriscono la crescita del batterio di interesse rispetto agli altri batteri presenti.
L uso mirato di opportuni mezzi di coltura, seguito da analisi di identificazione biochimica o sierologica, permette, quindi, di rilevare la presenza di una determinata specie patogena nella matrice alimentare analizzata. Questi metodi tradizionali sono relativamente sensibili, poco costosi, forniscono informazioni sia qualitative sia quantitative sul numero e sulla natura del microrganismo presente in un campione alimentare, ma necessitano di 3-7 giorni per dare un esito e, talvolta, di prove di conferma. Dato che in ambito industriale il tempo è un fattore fondamentale, è divenuto necessario l uso di analisi sempre più rapide: negli ultimi anni sono stati introdotti dei sistemi che richiedono circa 24-48 ore per arrivare al risultato. L avanzamento in molti campi, inclusi la biologia molecolare, l ingegneria e la microelettronica, ha guidato lo sviluppo di nuove metodiche basate sugli acidi nucleici (soprattutto DNA) per l individuazione e l identificazione di microrganismi patogeni negli alimenti. Tra tutte le tecniche basate sul DNA, l amplificazione in vitro (PCR) è quella più largamente utilizzata: l elevata specificità e l ottimizzazione dei tempi consentono, infatti, di ottenere un risultato attendibile in poche ore, rispetto ai giorni impiegati nelle metodiche tradizionali. Nelle matrici alimentari vi sono sostanze che possono interferire con la reazione di PCR, inibendola, ma per ovviare a questi inconvenienti è possibile utilizzare delle metodiche che permettono di separare i batteri dalla matrice alimentare. L introduzione della Real-Time PCR evoluzione della PCR tradizionale, ha migliorato e semplificato in modo significativo l identificazione e la quantificazione degli acidi nucleici e si è dimostrata essere uno strumento prezioso soprattutto nel campo della diagnostica molecolare. Questa tecnica ha migliorato le analisi con una serie di vantaggi: è possibile analizzare un numero notevole di campioni per sessione, è molto veloce, possiede alti livelli di sensibilità e specificità e permette di vedere i risultati in tempo reale (da cui Real-Time). La sua abilità di operare su materiale derivante da una gamma di campioni molto vasta ha favorito l ampia diffusione di questa tecnica in diversi campi d applicazione. È molto diffusa, ad esempio, nell analisi degli organismi geneticamente modificati e in diversi campi della microbiologia umana e veterinaria. La Real-Time PCR è invece meno utilizzata in ambito alimentare a livelli industriali, anche se presenta tutti i requisiti (sensibilità, precisione, rapidità) per essere adatta a monitorare la sicurezza alimentare durante le varie fasi della filiera di produzione. Il sistema di Real-Time PCR è composto da un termociclatore, da un sistema ottico (Sequence Detection System o SDS) e da un software per l elaborazione dei dati. Questa tecnica, come detto, combina il principio della PCR con un sistema di rilevazione del dato in tempo reale attraverso l emissione di fluorescenza. I dati che si ottengono alla fine di ogni ciclo di amplificazione possono essere utilizzati per la quantificazione relativa o assoluta del frammento di DNA o di RNA templato. I metodi più comunemente usati negli esperimenti di Real-Time PCR per generare un segnale di fluorescenza si basano sull impiego di molecole fluorescenti che intercalano il DNA a doppio filamento oppure di sonde fluorescenti che ibridano con sequenze specifiche di DNA, permettendo una simultanea rilevazione e identificazione dell amplicone target durante la reazione di PCR. L utilizzo di sonde, quindi, permette di ottenere una maggiore specificità. Il funzionamento delle sonde si basa sulla Förster Resonance Energy Transfer (FRET), che rileva l accoppiamento di una molecola fluorescente e di un accettore sullo stesso o su differenti oligonucleotidi. Quando il fluoroforo e l accettore si trovano in stretta prossimità, l energia di eccitazione che colpisce il fluoroforo può essere assorbita o dissipata dalla
molecola accettore. Se il fluoroforo e l accettore sono vicini, si verifica il fenomeno di attenuazione o di emissione di fluorescenza. MATERIALI In questo lavoro, sono state usate sonde Taq Man, composte da un oligonucleotide disegnato in modo da essere complementare a una regione interna del prodotto di PCR e presenta un fluoroforo all estremità 5 e una molecola quencher legata all estremità 3. Quando la sonda è in questa configurazione, la molecola quencher assorbe la fluorescenza emessa dal fluoroforo. Nel corso di ogni ciclo di PCR, durante la fase di estensione del filamento di DNA complementare alla sequenza bersaglio, l enzima Taq-polimerasi degrada la sonda dall estremità 5, permettendo la sintesi del nuovo filamento e determinando l emissione di fluorescenza, grazie all allontanamento del fluoroforo dall accettore. L incremento di tale fluorescenza ad ogni ciclo di amplificazione è proporzionale alla quantità di sonda degradata e, quindi, alla quantità di temprato formato. principio di funzionamento delle sonde taq Man Di seguito vengono descritti brevemente i microrganismi studiati e i geni di riferimento. Bacillus cereus Bacillus cereus è un organismo ubiquitario nel suolo e, in generale, nell ambiente, e viene spesso rinvenuto a bassa concentrazione anche in cibi crudi, secchi e lavorati. Per la sua identificazione è stato utilizzato il gene ph3l. Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli O157:H7 è un ceppo enteroemorragico in grado di produrre esotossine molto pericolose che causano lesioni alle cellule intestinali e, nelle forme più gravi, insufficienze renali e sintomi neurologici. Si è scelto di utilizzare tre frammenti di DNA target: eae, flic e rfbe. L amplificazione di questi tre target
permette l identificazione specifica del ceppo capostipite dei batteri enterotossigenici, ovvero Escherichia coli O157:H7. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus è isolato principalmente dalle mucose del tratto nasale, dai capelli e dalla pelle degli animali a sangue caldo, tra cui l uomo, ma si trova anche in acqua, polvere, feci e sulle superfici dei vegetali. Per la sua identificazione molecolare è stato considerato il gene nuc e il gene meca, che determina la meticillino resistenza negli stafilococchi (a livello clinico la percentuale dei batteri resistenti a questo antibiotico è molto elevata e diviene, quindi, sempre più necessario rilevare la sua presenza). Yersinia enterocolitica Tra tutte le specie di Yersinia, Yersinia enterocolitica è l unico patogeno alimentare presente in alimenti come latte e derivati, carne di maiale, frutta e verdura; questo batterio è inoltre presente come commensale o patogeno in varie specie animali. Il gene scelto per l identificazione è Yst, che codifica per un esotossina specifica per il batterio. In questo lavoro, la quantificazione mediante Real- Time PCR è stata effettuata con il metodo assoluto: questo necessita l utilizzo di una curva standard di calibrazione, costruita con campioni standard come DNA plasmidico o altre forme di DNA a concentrazione nota. L uso di DNA plasmidico è vantaggioso, in quanto meno soggetto a degradazione e più stabile, data la sua conformazione circolare. Come esempio, nei seguenti grafici, è visibile la scala plasmidica ottenuta dalle diluizioni del plasmide contenente la sequenza target di Yersinia enterocolitica. Le curve ottenute dalla fluorescenza emessa permettono di analizzare da 1011 a 104 copie di DNA/ml. La relativa retta di taratura standard ha una pendenza di -3,2 (valori ottimali compresi tra -3 e - 3,5) e il coefficiente di correlazione R2 è pari a 0,997 (il valore deve essere il più vicino possibile a 1,0). scala plasmidica ottenuta dalle diluizioni del plasmide contenente la sequenza target di Yersinia enterocolitica Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, Alicyclobacillus Sono stati inoltre sviluppati altri tre protocolli partendo direttamente da matrice alimentare, per la ricerca di Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (MAP) e Alicyclobacillus spp. Listeria monocytogenes è ubiquitaria, è stata trovata nel suolo, nella vegetazione, nell acqua ed è frequentemente veicolata dall uomo e dagli animali. La sua identificazione molecolare è stata effettuata basando il riconoscimento specifico di primer e sonda sul gene inla, che codifica per un fattore di virulenza specifico di questa specie. MAP è il batterio responsabile della paratubercolosi nei ruminanti (morbo di Johne) e presunta causa del morbo di Crohn nell uomo. Per l identificazione, il target utilizzato è il traspostone IS900, considerato il più specifico per il suo riconoscimento. Infine, Alicyclobacillus è un batterio non patogeno per l uomo, ma la sua presenza nei cibi, soprattutto nei succhi di frutta, causa alterazioni olfattive sgradevoli per il consumatore, date dalla produzione di guaiacolo e alofenoli. Nelle matrici alimentari vi sono sostanze che possono interferire con la reazione di PCR, inibendola. Tra queste sostanze si possono citare i chelanti degli ioni bivalenti, che inibiscono l attività della polimerasi, le nucleasi che possono degradare i nucleotidi o diretti inibitori della polimerasi. Per ovviare a questi inconvenienti è possibile utilizzare due metodiche: la prima prevede di separare i batteri dalla matrice, la seconda di estrarre direttamente dalla matrice stessa il DNA microbico (procedura generalmente più utilizzata). Per Listeria monocytogenes sono state considerate alcune matrici rappresentative (latte, formaggio a pasta molle e farina di mais), analizzate dopo inoculo di diverse diluizioni del batterio. Nel seguente grafico sono visibili le curve ottenute dopo Real-time PCR effettuata su DNA di Listeria monocytogenes estratto dopo inoculo in formaggio. Si può osservare l andamento regolare delle curve. Le diluizioni analizzate sono 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 e 10-8. Real-time PCR effettuata su DNA di Listeria monocytogenes estratto dopo inoculo in formaggio Grazie all analisi quantitativa ottenuta dalla Real-Time PCR, è stato possibile confrontare il limite di sensibilità di questa tecnica con quello delle tecniche microbiologiche classiche. La matrice che ha creato più problematiche, soprattutto nella fase di estrazione del DNA, è stata il latte: a causa del suo stato liquido,
infatti, non è sempre possibile eliminare efficacemente tutte le sostanze contaminanti presenti, che possono influire sull efficienza dell estrazione. Nonostante questo, le varie prove effettuate a partire dalle diverse matrici hanno portato alla quantificazione dei campioni con una buona sensibilità, che arriva fino a 103 copie/ml in un intervallo di rilevazione compreso tra 108 e 103 copie/ml (valore compatibile con i limiti di detection della Real- Time PCR). La fase di prearricchimento culturale e rilevazione mediante conta delle colonie nella metodologia tradizionale richiede sei giorni, mentre con il protocollo di Real-Time PCR ne servono solamente due per ottenere risultati. La procedura messa a punto, quindi, oltre ad aumentare la specificità, ha permesso di diminuire il tempo necessario all esecuzione dell analisi. Il latte è stata la matrice di partenza anche per l identificazione di MAP, che è il batterio responsabile della paratubercolosi nei ruminanti (morbo di Johne) e presunta causa del morbo di Crohn nell uomo. La matrice è stata inoculata direttamente con il DNA di MAP ad una concentrazione nota, evitando in questo modo la fase di crescita microbiologica particolarmente laboriosa e lenta di questo microrganismo (8-16 settimane). L ultima matrice analizzata è stata succo di frutta per l identificazione di Alicyclobacillus, che è un contaminante emergente di questa tipologia di alimenti, in quanto causa di alterazioni olfattive. Sono stati effettuati degli inoculi artificiali del batterio in succhi di mela, partendo da una colonia cresciuta su piastra, per testare l efficienza di estrazione e rilevazione del DNA da matrice. I dati ottenuti dalle conte su piastra sono stati poi confrontati con l analisi quantitativa mediante Real-Time PCR, effettuata sul DNA estratto. Si può osservare come nei campioni 1, 2, 4, 5 e 6 la quantificazione su piastra e quella effettuata mediante Real-time PCR abbia fornito valori concordanti. Nel campione 3 con Real-Time PCR sono state rilevate 102 cellule/ml, dove la conta in piastra non aveva mostrato crescita, a dimostrazione della maggiore sensibilità della metodica molecolare. Il campione 7 è stato utilizzato come controllo negativo (succo di frutta sterile) e, infatti, dopo incubazione non ha mostrato la presenza del batterio né su piastra né mediante rilevazione molecolare. dati ottenuti dalla quantificazione di Alicyclobacillus L introduzione della Real-Time PCR, evoluzione della PCR tradizionale, ha migliorato e semplificato in modo significativo l identificazione e la quantificazione degli acidi nucleici e si è dimostrata essere infatti uno strumento prezioso soprattutto nel campo della diagnostica molecolare.
Questa tecnica ha migliorato le analisi con una serie di vantaggi: è possibile analizzare un numero notevole di campioni per sessione, è molto veloce, possiede alti livelli di sensibilità e specificità e permette di vedere i risultati in tempo reale (da cui Real-Time). La sua abilità di operare su materiale derivante da una gamma di campioni molto vasta ha favorito l ampia diffusione di questa tecnica in diversi campi d applicazione. E molto diffusa, ad esempio, nell analisi degli organismi geneticamente modificati e in diversi campi della microbiologia umana e veterinaria. La Real-Time PCR è invece meno frequentemente utilizzata in ambito alimentare a livelli industriali, anche se presenta tutti i requisiti (sensibilità, precisione, rapidità) per essere adatta a monitorare la sicurezza alimentare durante le varie fasi della filiera di produzione. In considerazione delle attività svolte con il presente progetto sono state conseguite le conoscenze per instaurare a livello produttivo un sistema di controllo qualitativo degli alimenti basato sulla tecnologia PCR real time applicabile all intero processo produttivo della filiera agro-alimentare cui i partner industriali del progetto appartengono. Networking al livello distrettuale, regionale La struttura di controllo comune fra i vari partner impresa del progetto è basata sulla filosofia della condivisione delle esperienze di controllo qualitativo degli alimenti. Al fini di massimizzarne i vantaggi derivanti è evidente la necessità di estendere questo modello a più imprese possibile facenti parte del meta-distretto. A tale fine la realizzazione di tale sistema di controllo integrato ha richiesto un intensa attività di networking a livello distrettuale. Tale attività proseguirà anche successivamente la conclusione del progetto mediante le attività di disseminazione successivamente descritte. Integrazione dei soggetti proponenti in un contesto internazionale Il raggiungimento degli obiettivi del progetto ha permesso di ampliare potenzialmente il livello di internazionalizzazione delle imprese coinvolte nell applicazione del modello di controllo integrato (quindi non solo di quelle facenti parte del progetto). Competitività del sistema distrettuale/regionale L applicazione di un sistema di controllo integrato basato su una tecnologia innovativa ha consentito e consentirà alle imprese del sistema distrettuale che aderiscono a tale sistema di aumentare, da un lato, la qualità dei prodotti offerti e, dall altro lato, di diminuire i costi e i tempi collegati alle attività di controllo. Trasferimento tecnologico Il trasferimento tecnologico è un elemento caratterizzante il progetto. Inizialmente si avrà un intensa attività di formazione al fine di diffondere il più possibile le conoscenze acquisite durante la messa a punto dei protocolli ai dipendenti di Pozzali Fratelli, Stella Bianca e Molino Bresciano. La realizzazione del sistema di controllo integrato richiede necessariamente la condivisione e la trasferibilità delle conoscenze acquisite da ciascun partner del progetto. Tale trasferimento non si limiterà però ai soli partner coinvolti. La logica del modello di controllo integrato ha infatti senso solo se si potrà applicare anche alle altre imprese facenti parte del meta-distretto perché solo allargando il più possibile la base degli alimenti controllati si potranno realizzare delle economie di scala.
Formazione del capitale umano Lo sviluppo delle attività previste avrà come ripercussione una formazione del team di ricerca coinvolto non solo su aspetti di controllo riguardanti gli specifici ambiti aziendali di appartenenza ma anche su aspetti che riguardano il processo produttive delle altre imprese facenti parte del progetto. Sono inoltri previsti corsi di formazione al fine di diffondere anche al personale che, pur non essendo stato coinvolto direttamente nelle attività di progetto, dovrà comunque applicare a livello produttivo le conoscenze che dal progetto scaturiranno. Il progetto avrà una notevole ricaduta in termini occupazionali delle imprese facenti parte del distretto. Date le stime di incremento di fatturato e di miglioramento del margine di contribuzione indicate nel punto precedente si può ipotizzare un incremento del personale pari a 10 dipendenti nell arco del triennio successivo alla conclusione del progetto. In particolare si prevede un incremento occupazionale di 1 unità per Crambiolab, di 5 unità per Stella Bianca, di 3 unità per Pozzali Fratelli e di 2 unità per Molino Bresciano. Qualità della vita Lo sviluppo di sistemi di controllo degli alimenti più efficaci di quelli attualmente esistenti avrà ripercussioni positive sulla salute dei consumatori. Diffusione dei risultati Consci dell importanza ricoperta dalla diffusione dei risultati nel metadistretto biotecnologie alimentari e degli effetti che da essa deriveranno, si è deciso di realizzare un massiccio programma di divulgazione e sensibilizzazione a mezzo stampa, conferenze, Internet. Sono stati infatti pubblicati articoli su organi di stampa, programmate conferenze di presentazione con esperti del settore e responsabili del programma. In occasione di importanti Fiere del Settore saranno realizzate presenze significative per contribuire alla maggiore diffusione dei contenuti e dei risultati. Strumenti utilizzati: - produzione di materiale cartaceo di presentazione dell iniziativa per il seminario di presentazione del progetto; - costruzione di un sito internet dedicato; - realizzazione di CD contenente i risultati del progetto distribuito in circa 200 copie. Si sottolinea, inoltre, la volontà di creare un sistema permanente di trasferimento delle conoscenze e delle innovazioni tecnologiche, al fine di porre le basi per un azione di ampio respiro e durevole nel tempo, che possa utilmente essere replicata dal contesto regionale a quello nazionale ed internazionale.