SOD DIAGNOSTICA GENETICA

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SOMMARIO 1 PRESENTAZIONE DELLA SOD DIAGNOSTICA GENETICA... 5 2 ATTIVITA... 5 2.1 AMBULATORIO... 5 2.2 CITOGENETICA... 5 2.3 CITOGENETICA MOLECOLARE... 5 2.4 BIOLOGIA MOLECOLARE... 6 2.5 GENETICA FORENSE... 6 2.6 CENTRO DI RIFERIMENTO... 6 3 MODALITÀ DI ACCESSO ALLE PRESTAZIONI... 6 3.1 DOCUMENTI DA PRESENTARE AL MOMENTO DELLA PRENOTAZIONE... 7 3.2 UBICAZIONE DEL LABORATORIO E DELL AMBULATORIO CONSULENZE... 7 3.3 INFORMAZIONI E PRENOTAZIONI... 7 3.4 PAGAMENTO DEL TICKET... 7 3.5 CONSEGNA DEI REFERTI... 7 3.6 PRIVACY... 8 3.7 MEDIAZIONE CULTURALE... 8 4 INFORMAZIONI PER L UTENTE... 8 4.1 SITO INTERNET... 8 4.2 OPUSCOLO INFORMATIVO... 8 4.3... 8 4.4 RECLAMI E SEGNALAZIONI... 9 5 CERTIFICAZIONE... 10 6 STANDARD DI QUALITÀ... 10 6.1 CONTROLLI DI QUALITÀ... 10 7 ANALISI CITOGENETICA... 11 7.1 IN DIAGNOSI PRENATALE... 11 7.2 ANALISI CITOGENETICA/MOLECOLARE DI MATERIALE O TESSUTO ABORTIVO... 13 7.3 ANALISI CITOGENETICA POSTNATALE... 13 7.4 ANALISI CITOGENETICA PER ANOMALIE ACQUISITE... 15 7.5 ANALISI CITOGENETICA PER TESSUTO TUMORALE... 15 7.6 RICERCA DI ROTTURE CROMOSOMICHE... 16 8 ANALISI CITOGENETICA MOLECOLARE... 16 9 ANALISI GENETICA MOLECOLARE... 18 9.1 PRINCIPI... 18 9.2 QUANDO SI ESEGUE... 18 9.3 METODI... 18 9.4 MODALITÀ DI PRELIEVO E TRASPORTO PER CAMPIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE... 19 10 ELENCO DEI TEST ESEGUITI IN BIOLOGIA MOLECOLARE... 20 10.1.1 ACROMATOPSIA... 20 www.aou-careggi.toscana.it Pag. 2 di 81

10.1.2 AMAUROSI CONGENITA DI LEBER... 21 10.1.3 AMILOIDOSI FAMILIARE... 22 10.1.4 ANALISI DEL CHIMERISMO POST-TRAPIANTO... 24 10.1.5 ANALISI DI CONTAMINAZIONE MATERNA... 25 10.1.6 ANALISI DI IPERMUTAZIONE DEL GENE IGHV... 25 10.1.7 ANALISI MOLECOLARE MIELODISPLASTICA DEI GENE TP53 E ASXL1... 26 10.1.8 ANALISI MOLECOLARE DI RIARRANGIAMENTI CLONALI DEL GENE IGH E DEI GENI TCR Β E Γ... 27 10.1.9 ANALISI DI ZIGOSITÀ... 28 10.1.10 CARDIOMIOPATIA IPERTROFICA... 29 10.1.11 CARDIOMIOPATIA DILATATIVA FAMILIARE... 30 10.1.12 DISPLASIA/CARDIOMIOPATIA ARITMOGENA DEL VENTRICOLO DESTRO (ARVC),... 31 10.1.13 CARIOTIPO MOLECOLARE (CGH ARRAY)... 33 10.1.14 CECITÀ NOTTURNA CONGENITA STAZIONARIA... 34 10.1.15 CHARCOT MARIE TOOTH... 35 10.1.16 COROIDEREMIA... 36 10.1.17 HEREDITARY NEUROPATHY WITH LIABILITY TO PRESSURE PALSIES (HNPP)... 37 10.1.18 DEGENERAZIONE MACULARE SENILE... 38 10.1.19 DISOMIE UNIPARENTALI (UDP)... 39 10.1.20 DISTROFIA DEI CONI... 40 10.1.21 DISTROFIA CRISTALLINA DI BIETTI... 41 10.1.22 DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE - BECKER... 42 10.1.23 DISTROFIE RETINICHE A PATTERN/DISTROFIA VITELLIFORME DELL ADULTO... 43 10.1.24 EMOCROMATOSI EREDITARIA... 44 10.1.25 EMOFILIA A... 45 10.1.26 EMOFILIA B... 46 10.1.27 FARMACOGENETICA... 48 10.1.28 FIBROSI CISTICA... 49 10.1.29 INDAGINE MOLECOLARE PER RENE POLICISTICO DELL ADULTO (ADPKD)... 51 10.1.30 IPOCALIEMIA/IPERCALIEMIA... 52 10.1.31 MALATTIA DI BEST O DISTROFIA MACULARE VITELLIFORME... 53 10.1.32 MALATTIA DI. FABRY... 55 10.1.33 MALATTIA DI STARGARDT... 56 10.1.34 MICRODELEZIONI DEL CROMOSOMA Y... 57 10.1.35 RETINITE PIGMENTOSA AUTOSOMICA RECESSIVA, AUTOSOMICA DOMINANTE E X-LINKED... 58 10.1.36 RETINOSCHISI GIOVANILE... 59 10.1.37 RICERCA DI DELEZIONI E DUPLICAZIONI SUBTELOMERICHE MEDIANTE MLPA... 60 10.1.38 RICERCA DI MICRODELEZIONI/MICRODUPLICAZIONI IN 22Q11... 61 10.1.39 RICERCA RAPIDA DI ANEUPLOIDIE CROMOSOMICHE... 62 10.1.40 SINDROME DI ANGELMAN... 63 10.1.41 SINDROME DI BARDET-BIEDL... 63 10.1.42 SINDROME DI CRIGLER NAJJAR... 64 10.1.43 SINDROME GILBERT... 66 10.1.44 SINDROME DI PRADER-WILLI... 66 10.1.45 SINDROME DI SILVER RUSSELL... 67 10.1.46 SINDROME VON HIPPEL-LINDAU... 68 10.1.47 SINDROME DI USHER... 69 10.1.48 SINDROME DELL X-FRAGILE... 70 10.1.49 SORDITÀ EREDITARIA... 71 10.1.50 TRASLOCAZIONE IGH/BCL1 E IGH/BCL2... 72 10.1.51 VITREORETINOPATIE... 73 10.1.52 CARIOTIPO MOLECOLARE (CGH ARRAY)... 74 10.1.53 TEST PRENATALI NON INVASIVI SU DNA LIBERO CIRCOLANTE DA PLASMA MATERNO... 75 11 GENETICA FORENSE... 78 11.1.1 TEST DI PATERNITÀ... 78 11.1.2 TEST DI PARENTELA... 79 www.aou-careggi.toscana.it Pag. 3 di 81

11.1.3 TEST DI IDENTITÀ PERSONALE... 79 12 BIOBANCA GENETICA... 80 Gruppo di redazione: NOME FUNZIONE DATA FIRMA REVISIONE C. De Sanzo RSGQ 15/05/2015 APPROVAZIONE F. Torricelli Direttore 18/05/2015 www.aou-careggi.toscana.it Pag. 4 di 81

1 PRESENTAZIONE DELLA SOD DIAGNOSTICA GENETICA La SOD Complessa Diagnostica Genetica dell Azienda Ospedaliero - Universitaria Careggi fa parte del Dipartimento dei Servizi area diagnostica di laboratorio ed è diretta dalla Dott.ssa Francesca Torricelli. La Mission della SOD Diagnostica Genetica è quella di offrire prestazioni di alta specializzazione in citogenetica, nell ambito della diagnosi pre e post natale e in genetica per la prevenzione e la ricerca delle malattie genetiche pre-natale, post-natale ed acquisite. Ciò costituisce per la SOD Diagnostica Genetica un impegno costante, ed allo stesso tempo uno strumento con cui contribuire alla crescita di tutti i collaboratori della struttura, degli altri specialisti e del cittadino nonché allo sviluppo della sanità del proprio territorio. La SOD Diagnostica Genetica da sempre ha fatto proprio l obiettivo di fornire servizi di elevato livello qualitativo, collaborando con le strutture della propria Azienda, con strutture regionali, extra regionali, ed internazionali, e con le associazioni dei familiari di patologia per il raggiungimento della soddisfazione dell utente. La SOD Diagnostica Genetica svolge attività diagnostica e di consulenza clinica per patologie ereditarie e variabilità genetica; inoltre sviluppa progetti di ricerca nell ambito della genetica. Eroga prestazioni per conto del Sistema Sanitario Nazionale, come laboratorio d alta specializzazione. Per fa ciò si è dotata di strumentazione di alto livello tecnologico e all avanguardia:come i più sofisticati analizzatori di immagini per il settore di citogenetica ed un sistema robotizzato integrato per il settore della biologia molecolare. Dispone di personale altamente qualificato e costantemente aggiornato sulle novità analitiche e tecnologiche. E dotata di personale appartenente ai profili professionali di biologi, tecnici sanitari di laboratorio, amministrativi. 2 ATTIVITA 2.1 AMBULATORIO Presso l ambulatorio della SOD Diagnostica Genetica si effettuata il servizio di consulenza genetica pre test, post test e clinica nella quale i soggetti e le famiglie vengono informati sulla natura, l ereditarietà e le implicazioni delle malattie genetiche. La consulenza è anche finalizzata a fornire un aiuto all utente al fine di prendere decisioni informate d ordine medico e personale. Molteplice è l attività di consulenza: consulenza genetica diagnostica pre test consulenza genetica per forense. 2.2 CITOGENETICA Le analisi citogenetiche consentono lo studio dell assetto cromosomico delle cellule e quindi del cariotipo e l individuazione di piccole alterazioni strutturali dei cromosomi; l attività prevede l effettuazione di indagini diagnostiche volte all identificazione delle anomalie cromosomiche costituzionali (citogenetica costituzionale), acquisite (citogenetica acquisita) e allo studio delle anomalie cromosomiche indotte e delle sindromi da instabilità cromosomica (mutagenesi citogenetica). 2.3 CITOGENETICA MOLECOLARE La citogenetica molecolare prevede lo studio di regioni cromosomiche specifiche attraverso tecniche che sfruttano il legame tra una sonda molecolare, (costituita da un frammento di DNA, specifico per la regione di interesse, marcato con composti fluorescenti), e la sequenza di DNA complementare del www.aou-careggi.toscana.it Pag. 5 di 81

preparato che è stato fissato e montato su un vetrino portaoggetti. La tecnica dell Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è la tecnica di citogenetica molecolare attualmente in uso nella SOD Diagnostica Genetica e viene applicata di routine all analisi del cariotipo, ma solo nei casi selezionati in base a specifici sospetti diagnostici o per approfondire determinate anomalie citogenetiche. 2.4 BIOLOGIA MOLECOLARE Le indagini di genetica molecolare consistono nello studio del DNA le cui alterazioni possono essere correlate o responsabili di un particolare fenotipo; attraverso l analisi molecolare è quindi possibile individuare mutazioni del patrimonio genetico responsabili di malattie ereditarie e/o varianti polimorfiche. Il Laboratorio inoltre si è particolarmente impegnato per la diagnosi di alcune malattie rare per le quali è stato riconosciuto centro di riferimento nazionale e/o internazionale. 2.5 GENETICA FORENSE L attività di questo settore del Laboratorio è rivolta alle indagini di paternità, di identità e criminalistiche ed è rivolto ad utenti esterni, studi legali e Procure della Repubblica. E Costituita da professionisti del settore altamente qualificati, consulenti presso Tribunali italiani e studi legali. 2.6 CENTRO DI RIFERIMENTO La SOD Diagnostica Genetica eroga prestazioni in qualità di: Centro di riferimento della diagnosi prenatale del primo trimestre dei servizi di Genetica Medica per l Area Vasta Centro; Centro di riferimento regionale per la caratterizzazione genetica delle degenerazioni retiniche ereditarie; Centro genomico e post genomico per lo sviluppo e l'applicazione delle tecnologie ad alta innovazione in ambito biomedico; Centro di riferimento regionale Prevenzione e Diagnosi Prenatale di Difetti Congeniti; Centro di riferimento regionale per la Diagnosi Genetica di Fibrosi Cistica; Centro di riferimento regionale della Malattia di Anderson Fabry; Centro di riferimento regionale per l Amiloidosi; Centro di riferimento regionale Consulenza in situazioni di abuso e violenza sessuale; Centro di riferimento regionale Coagulopatie congenite; Centro di riferimento regionale Cardiomiopatia ipertrofica dilatativa. Centro genomico e post genomico per lo sviluppo e l'applicazione delle tecnologie ad alta innovazione in ambito biomedico. 3 MODALITÀ DI ACCESSO ALLE PRESTAZIONI Per poter effettuare un analisi presso la SOD Diagnostica Genetica è necessaria una richiesta su ricettario regionale da parte del Medico di Medicina Generale o dello specialista. La richieste deve riportare sempre il quesito diagnostico o la motivazione clinica. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 6 di 81

Per gli utenti esterni la SOD Diagnostica Genetica eroga le prestazioni previo appuntamento telefonico mentre le strutture interne e/o esterne all Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi devono inviare i campioni sulla base di accordi precedentemente stabiliti. La presa in carico del bisogno di salute dei pazienti che accedono alla struttura con richiesta del Medico di Medicina Generale per prestazioni ambulatoriali avrà luogo con modalità diverse, secondo che venga richiesta una visita specialistica (consulenza) e o accertamenti di diagnostica di laboratorio. In caso di Day Hospital o di ricovero, sia in reparti dell AOUC che in reparti esterni all AOUC, il paziente deve presentare richiesta su modulo interno specifico della struttura richiedente. Anche nel caso in cui la struttura invii il campione biologico esso deve sempre essere accompagnato da modulo interno specifico della struttura richiedente. 3.1 DOCUMENTI DA PRESENTARE AL MOMENTO DELLA PRENOTAZIONE Al momento della prenotazione sia telefonica che presso la segreteria della struttura, l utente deve essere munito di richiesta su ricettario regionale. Al momento della visita/consulenza l utente è tenuto a presentare la tessera sanitaria e le eventuali analisi importanti al fine del quesito diagnostico. 3.2 UBICAZIONE DEL LABORATORIO E DELL AMBULATORIO CONSULENZE La SOD Diagnostica Genetica è ubicata presso il padiglione n. 15 Piastra dei Servizi ; il laboratorio si trova nel sottosuolo dell edificio mentre l ambulatorio per le consulenze genetiche ed il prelievo è ubicato al piano terreno, stanza 27, adiacente al centro prelievi. 3.3 INFORMAZIONI E PRENOTAZIONI Orario di apertura al pubblico della segreteria Per appuntamenti, informazioni e consegna referti: Lunedì e Mercoledì dalle ore 9.00 alle ore 11.00. Appuntamenti telefonici Per prenotare una consulenza pre test: Martedì e Giovedì dalle ore 9.00 alle ore 11.00. Telefono 0557949363 Gli appuntamenti vengono presi a partire dal primo giorno del mese per i due mesi successivi fino ad esaurimento dei posti disponibili. 3.4 PAGAMENTO DEL TICKET Il pagamento del ticket si effettua al momento della consulenza o della consegna del campione. Il pagamento può effettuato presso il punto giallo al piano terra della Piastra, in contanti o bancomat. Esenzioni: sono esenti i pazienti già in possesso di un certificato di esenzione totale o malattia rara e per reddito come indicato dalla vigente normativa. 3.5 CONSEGNA DEI REFERTI E possibile ritirare i referti nei giorni di Lunedì e Mercoledì dalle ore 9.00 alle ore 11.00. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 7 di 81

I referti possono essere ritirati a partire dal giorno indicato dal personale amministrativo al momento dell'accettazione amministrativa o secondo indicazioni fornite al momento della consulenza. E possibile richiedere la spedizione a domicilio del referto previo compilazione di modulo di autorizzazione al momento della consulenza o della consegna del campione. Al momento del ritiro del referto è necessario presentare la ricevuta di pagamento del ticket ed il documento di riconoscimento. É inoltre importante tenere presente che nel caso in cui si sia sprovvisti del documento di riconoscimento o della delega necessaria al ritiro gli operatori non potranno consegnare il referto. 3.6 PRIVACY Al fine di garantire la riservatezza delle persone che effettuano gli esami, la SOD Diagnostica Genetica si attiene alle seguenti indicazioni: - il referto è consegnato in modo da garantire la totale riservatezza del contenuto; - il referto viene consegnato ad una persona diversa dal diretto interessato esclusivamente in presenza di delega scritta. Al momento del ritiro del referto è sempre presente un medico o un biologo al quale rivolgersi in caso si desiderino chiarimenti. 3.7 MEDIAZIONE CULTURALE Per facilitare i percorsi di cura delle persone straniere o di diverse religioni, sono disponibili mediatori culturali, interpreti e, su richiesta, ministri del proprio culto. E possibile rivolgersi all Ufficio Spedalità Stranieri padiglione 2 Nuovo Ingresso Careggi - Direzione tel. 055.794.9888 fax 055.794.7960-055.794.9838 dal lunedì al sabato ore 7,30 13,30 4 INFORMAZIONI PER L UTENTE 4.1 SITO INTERNET L utente può avere informazioni sul laboratorio consultando il sito internet alla pagina http://www.aoucareggi.toscana.it/. Dal sito è inoltre possibile scaricare documenti come il consenso informato e l informativa relative ai test eseguiti dalla SOD Diagnostica Genetica. 4.2 OPUSCOLO INFORMATIVO La SOD Diagnostica Genetica ha realizzato in collaborazione con la Regione Toscana un opuscolo informativo dal titolo " Geni e dintorni" contenenti informazioni sulle Malattie genetiche e sulla diagnosi prenatale, scaricabile alla pagina: http://www.aou-careggi.toscana.it/. 4.3 Dal sito internet dell Azienda - Ospedaliero Universitaria Careggi http://www.aou-careggi.toscana.it/ è possibile scaricare la presente Carta dei servizi. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 8 di 81

4.4 RECLAMI E SEGNALAZIONI L utente ha la possibilità di inviare segnalazioni, reclami ed elogi, scritti o verbali relativi a questioni reclami tecnico professionali e non. Reclami Chi può presentare un reclamo: direttamente l interessato, i suoi parenti o le associazioni di volontariato e tutela (in questo caso su delega scritta del diretto interessato). A chi deve essere indirizzato il reclamo: al Direttore Generale dell'azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi. Cosa deve contenere il reclamo: le generalità del soggetto interessato (nome, cognome, indirizzo e recapito telefonico laddove si possegga) un adeguata descrizione dell evento denunciato la firma Il reclamo può essere consegnato: a mano direttamente all Ufficio Protocollo dell Azienda per posta al seguente indirizzo: Largo Brambilla, 3-50134 Firenze per fax: 055.794.7791 per e-mail: urp@aou-careggi.toscana.it In questo caso il reclamo dovrà essere formalizzato con una firma autografa presso l'ufficio Relazioni con il Pubblico. Gli utenti possono anche inviare reclami non formali al Direttore della SOD Diagnostica Genetica Dott.ssa Francesca Torricelli per e-mail: torricellif@aou-careggi.toscana.it al Laboratorio Diagnostica Genetica per e-mail: genetica@aou-careggi.toscana.it Segnalazioni ed elogi Al fine di migliorare i nostri servizi è possibile inoltrare segnalazioni di disservizio o suggerimenti organizzativi utilizzando le schede da inserire nelle apposite cassette presenti nei padiglioni, oppure telefonando o recandosi di persona all Ufficio Relazioni con il Pubblico. L utente può recarsi direttamente al laboratorio e compilare l apposito modulo messo a disposizione presso la Segreteria del Laboratorio quindi consegnarlo al personale o imbucarlo nella cassetta postale all ingresso della stessa. Chi vuole esprimere gratitudine o riconoscenza per il servizio ricevuto lo può fare in forma scritta inviando elogi e ringraziamenti all Ufficio Relazioni con il Pubblico che provvederà a inoltrarli direttamente agli operatori sanitari o alle strutture a cui sono rivolti, oppure direttamente al laboratorio compilando l apposito modulo a disposizione nella Segreteria del Laboratorio quindi consegnarlo al personale o imbucarlo nella cassetta postale all ingresso della stessa. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 9 di 81

5 CERTIFICAZIONE L orientamento alla qualità coinvolge, in un processo di miglioramento, l intera attività della SOD Diagnostica Genetica allo scopo di migliorarne l efficienza e l efficacia in relazione alla soddisfazione dell utente/paziente e delle parti interessate al processo. A tale scopo la SOD Diagnostica Genetica ha sviluppato il proprio sistema di gestione orientato alla Qualità secondo il modello UNI EN ISO 9001:2008 Sistemi di gestione per la qualità Requisiti, e secondo il Disciplinare della Società Italiana di Genetica Umana. La SOD Diagnostica Genetica si è certificata nell ottobre 2008 secondo la norma ISO 9001 per Attività di diagnostica e consulenza clinica per patologie ereditarie per lo studio della variabilità genetica, sviluppo di progetti di ricerca nell ambito genetico. Nel 2009 il Laboratorio ha ricevuto la visita ispettiva per l accreditamento SIGU (Società Italiana di Genetica Umana), da parte di Bureau Veritas come ente di parte terza, specifica per i Laboratori di Genetica Medica. Negli anni successivi il laboratorio ha ottenuto il rinnovo della certificazione ISO 9001 (numero certificato IT 235692F). Dal 2012 il Laboratorio, settore Genetica Forense, ha ottenuto l accreditamento dall Ente di certificazione Accredia della prova Analisi di genetica forense attraverso lo studio di polimorfismi genetici con standard UNI CEI EN ISO/IEC 17025 (numero accreditamento n. 1268) per il test di paternità, test di parentela e test di identità personale, 6 STANDARD DI QUALITÀ La SOD Diagnostica Genetica opera in riferimento agli standard qualitativi del disciplinare della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU) finalizzati ad operare per un miglioramento continuo della qualità delle prestazioni offerte dalle Strutture di Genetica Medica a garanzia dei cittadini ed anche a tutela di tutti i professionisti del settore ed in riferimento alle linee guida e alle raccomandazione delle Società Scientifiche. Per il controllo dell adeguatezza a tali standard la SOD Diagnostica Genetica esegue il monitoraggio di indicatori di qualità. Tra i vari indicatori la SOD Diagnostica Genetica procede al monitoraggio dei tempi di risposta, il numero dei reclami, la soddisfazione degli utenti attraverso questionari specifici. 6.1 CONTROLLI DI QUALITÀ La qualità del risultato dell analisi è assicurata attraverso controlli sistematici. La SOD Diagnostica Genetica partecipa annualmente a Controlli Esterni di Qualità (VEQ), per analisi di Citogenetica e Molecolare, effettuati rispettivamente dagli Enti organizzatori internazionali come il Cytogenetics European Quality Assessment (CEQA) e l European Molecular Genetics Quality Network (EMQN). In particolare per il settore Molecolare il laboratorio partecipa alla VEQ dell EMQN relativamente ai test per Sindrome dell X Fragile, Fibrosi Cistica, Emocromatosi Ereditaria, Distrofia Muscolare di Duchenne e Becker, Sindrome di Prader-Willi e Angelman, Sordità Ereditaria, Charcot Marie Tooth, Microdelezioni del Cromosoma Y, e controlli di qualità per la tecnica del sequenziamento, alla base di numerosi test diagnostici. Per il settore Genetica Forense si effettua il Controllo Qualità Europeo promosso dal GEDNAP e il Controllo Qualità Italiano promosso dal GEFI. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 10 di 81

Per il settore Citogenetica il controllo esterno di qualità è eseguita per il liquido amniotico, il villo coriale, sangue periferico, indagini ematologiche (Mature B- and T-cell neoplasms, Myeloid Disorders and Acute Leukaemias), Array-CGH in epoca postnatale. Il controllo prevede l invio da parte del Cytogenetics European Quality Assessment di immagini di metafasi al laboratorio che deve eseguire l analisi del caso e rinviare il relativo referto. 7 ANALISI CITOGENETICA 7.1 IN DIAGNOSI PRENATALE La diagnosi prenatale si esegue su liquido amniotico, villo coriale e sangue fetale. E eseguita in gravidanza (nel primo, secondo o terzo trimestre) e permette lo studio del cariotipo fetale attraverso un indagine citogenetica su villo coriale, liquido amniotico, sangue fetale. Tale prestazione in caso di gravidanza a rischio per anomalie genetiche ed anomalie cromosomiche, è esente da ticket, come da protocollo regionale. Indicazione all analisi: Madri con età superiore ai 35 anni di età Genitori con precedente figlio affetto da anomalia cromosomica o da malattia genetica diagnosticabile. Genitori portatori di riarrangiamento strutturale o da malattia genetica Patologia fetale eco evidenziata Test di screening Modalità dell esame: L'esame prevede l'esecuzione della coltura cellulare e l analisi del cariotipo con tecniche di colorazione differenziale su tessuti fetali quali villo coriale, liquido amniotico, sangue fetale. Il prelievo del materiale fetale necessario per tale diagnosi comporta un aumento del rischio di aborto che deve essere accuratamente valutato in sede di consulenza genetica. In caso d'analisi su villo coriale si effettua una valutazione immediata della presenza di materiale fetale e l'esito di tale valutazione è tempestivamente comunicato via fax al personale della struttura di provenienza. In caso d'analisi su sangue fetale, per confermare la presenza di cellule fetali, l'analisi è preceduta da un confronto di valori emocromocitometrici fra il sangue della madre ed il sangue fetale eseguito presso il laboratorio di Chimica Clinica dell' AOUC. Dove si effettua l analisi: ll prelievo di liquido amniotico è eseguito presso tutti i centri di Diagnosi Prenatale della ASL, della Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi di Firenze e dell Azienda Ospedaliera Meyer. Il prelievo di villo coriale e sangue fetale si esegue presso l'ambulatorio di Diagnosi Prenatale dell' Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggi e Azienda Ospedaliera Meyer e della Diagnosi Prenatale della ASL Firenze. Standard liquido amniotico Standard villo coriale coltura a breve termine 21 giorni 7 giorni www.aou-careggi.toscana.it Pag. 11 di 81

Standard villo coriale, coltura a lungo termine Standard sangue fetale 21 giorni 7 giorni. Giorni e orari di accettazione dei campioni: Dal lunedì al giovedì dalle 8.00 alle 14.00. Per invio di campioni urgenti sono necessari accordi telefonici con il Laboratorio. Documentazione da allegare al campione: Richiesta su ricettario regionale o modelli aziendali Tessera sanitaria consulenza genetica consenso informato scheda dati paziente (anagrafici ed anamnestici) Modalità di raccolta e trasporto del materiale biologico: A. Campioni di liquido amniotico 1. Quantità di campione necessario per l esame: 18-20 ml distribuiti in 2 provette da 9-10 ml ciascuna; 2. Tipo di contenitore: provetta conica sterile con tappo a vite; 3. Modalità di identificazione del campione: cognome e nome utente, data di nascita; firma dell utente 4. Conservazione del campione: temperatura ambiente; 5. Tempi di consegna al laboratorio: nel più breve tempo e comunque entro 24 ore dal prelievo; 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: temperatura ambiente; i campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. Nota: in caso di prelievo che presenta contaminazione ematica è necessario aggiungere 1 goccia di eparina. B. Campioni di villo coriale 1. Quantità di campione necessario per l esame: 15-25 mg 2. Tipo di contenitore: siringa o provetta (a fondo piatto sterile con tappo a vite) forniti dal laboratorio contenenti il terreno per la raccolta. 3. Modalità di identificazione del campione: cognome e nome utente, data di nascita; firma dell utente 4. Conservazione del campione: temperatura ambiente 5. Tempi di consegna al laboratorio: nel più breve tempo, e comunque entro 24 ore 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: temperatura ambiente; i campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. 7. in caso di gravidanza gemellare è necessario inviare anche un campione di sangue materno: 2 provette tappo viola con anticoagulante C. Campione di sangue fetale 1. Quantità di campione di sangue fetale necessario per l esame: 1-2 ml; www.aou-careggi.toscana.it Pag. 12 di 81

2. Quantità di campione di sangue periferico della madre: 5 ml; 3. Tipo di contenitore: siringa con eparina; 4. Modalità di identificazione dei campioni: cognome e nome della madre su entrambe le siringhe ma distinte in sangue fetale e sangue materno, data di nascita della madre; 5. Conservazione del campione: temperatura ambiente 6. Tempi di consegna al laboratorio: entro 3 ore dal prelievo 7. Condizioni e modalità di trasporto del campione: temperatura ambiente; i campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. 7.2 ANALISI CITOGENETICA/MOLECOLARE DI MATERIALE O TESSUTO ABORTIVO L analisi citogenetica prevede lo studio del cariotipo fetale su villo coriale da aborto spontaneo e/o tessuti fetali. L analisi molecolare prevede la ricerca delle aneuploidie cromosomiche più frequenti. Giorni e orari di accettazione dei campioni: Dal lunedì al venerdì dalle 8.00 alle 14.00, sabato dalle ore 9 alle ore 12. Per invio di campioni urgenti sono necessari accordi telefonici con il Laboratorio. Documentazione necessaria, da allegare al campione: Richiesta su ricettario regionale o modelli aziendali Fotocopia tessera sanitaria Consenso informato Scheda dati paziente (anagrafici ed anamnestici) Modalità di raccolta e trasporto del materiale biologico: 1. Quantità di campione necessario per l esame: >15-20 mg. 2. Tipo di contenitore: provettone sterile contenete terreno di coltura fornito dal laboratorio o contenitore sterile con soluzione fisiologica sterile; 3. Modalità di identificazione del campione: cognome e nome utente e data di nascita; 4. Conservazione del campione: temperatura ambiente 5. Tempi di consegna al laboratorio: nel più breve tempo, e comunque entro 24 ore 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: temperatura ambiente, ausiliari esterni, servizio trasporto campioni se proveniente da altra struttura. I campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. 7. Data la possibilità di evidenziare contaminazione di DNA materno su DNA fetale, è necessario che il campione di materiale abortivo sia accompagnato da un campione materno di sangue periferico in EDTA. 30 giorni. 7.3 ANALISI CITOGENETICA POSTNATALE L indagine citogenetica è eseguita in diagnosi post natale e permette lo studio del cariotipo costituzionale. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 13 di 81

L'esame prevede: 1. come parte integrante la consulenza genetica nella quale vengono raccolte informazioni sulla famiglia e il consenso informato all esame; 2. un prelievo di sangue periferico; non è necessario essere digiuni ma si può assumere una leggera colazione. Documentazione necessaria, da allegare al campione: richiesta su ricettario regionale o modelli aziendali tessera sanitaria consulenza genetica consenso informato scheda dati paziente (anagrafici ed anamnestici) Dove si effettua: Il prelievo di sangue è eseguito presso il nostro laboratorio previo appuntamento telefonico. Giorni e orari di accettazione dei campioni esterni: Per invio di campioni esterni sono necessari accordi telefonici con il Laboratorio. Per esigenze tecniche sono accettati il lunedì e il venerdì dalle 8.00 alle 14.00. 21 giorni. N.B. Il tempo di risposta può prolungarsi nel caso in cui si renda necessario l allestimento di tecniche particolari qualora si evidenzi la necessità di effettuare indagini più approfondite. Si esegue in: Soggetti con sospetta sindrome cromosomica o malattia genetica Genitori e familiari di soggetti con anomalie cromosomiche Soggetti con ritardo mentale o ritardo d'accrescimento morte neonatale Coppie con figlio con sospetta sindrome cromosomica, deceduto senza diagnosi Coppie con poliabortività Soggetti infertili Controllo dei genitori in diagnosi prenatale con anomalia cromosomica del feto Modalità di raccolta e trasporto del materiale biologico: 1. Quantità di campione necessario per l esame: >= 3 ml di sangue periferico 2. Tipo di contenitore: provetta eparinata tappo verde; 3. Modalità di identificazione del campione: cognome e nome utente, data di nascita. 4. Conservazione del campione: temperatura ambiente 5. Tempi di consegna al laboratorio: entro 3 ore dal prelievo 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: Temperatura ambiente; i campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata www.aou-careggi.toscana.it Pag. 14 di 81

7.4 ANALISI CITOGENETICA PER ANOMALIE ACQUISITE L analisi citogenetica si esegue per diagnosi di patologie ematologiche all'esordio della malattia e in caso di terapia per valutare la persistenza di eventuali alterazioni. L indagine prevede sia lo studio citogenetico che lo studio di citogenetica molecolare con tecnica FISH con sonde specifiche. E previsto inoltre lo studio del chimerismo post trapianto. specifiche. L'esame prevede: l analisi del cariotipo e l'esame mediante Ibridazione In Situ Fluorescente (FISH) con sonde Giorni e orari di accettazione dei campioni: dal lunedì al giovedì dalle 8.00 alle 14.00. Per invio di campioni urgenti sono necessari accordi telefonici con il Laboratorio. Documentazione necessaria, da allegare al campione: Richiesta su ricettario regionale o modelli aziendali Codice sanitario consenso informato scheda dati paziente (anagrafici ed anamnestici) Standard 21 giorni con Tecnica FISH Standard 21 giorni per cariotipo Urgenza 7 giorni Modalità di raccolta e trasporto del materiale biologico: 1. Quantità di campione necessario per l esecuzione: 5 ml di sangue midollare eparinato 2. Tipo di contenitore: provetta contenitori senza additivo (provetta tappo rosso) 3. Modalità di identificazione del campione: cognome e nome utente e data di nascita 4. Conservazione del campione: temperatura ambiente 5. Tempi di consegna al laboratorio: in giornata entro le 14 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: temperatura ambiente; i campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. 7.5 ANALISI CITOGENETICA PER TESSUTO TUMORALE L 'analisi citogenetica si esegue per lo studio del cariotipo di tessuti o tumori solidi. Giorni e orari di accettazione dei campioni: Dal lunedì al giovedì dalle 8.00 alle 14.00. Per invio di campioni urgenti sono necessari accordi telefonici con il Laboratorio. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 15 di 81

Documentazione necessaria, da allegare al campione: Richiesta su ricettario regionale o modelli aziendali tessera sanitaria consulenza genetica consenso informato scheda dati paziente (anagrafici ed anamnestici) Modalità di raccolta e trasporto del materiale biologico: 1. Quantità di campione necessario per l esame: >= 20 mg di tessuto 2. Tipo di contenitore: provetta sterile da 50 ml contenente terreno fornito dal laboratorio; in assenza provettone o contenitore sterile con soluzione fisiologica sterile 3. Modalità d'identificazione del campione: cognome e nome utente, data di nascita, tipo di materiale, data prelievo, provenienza 4. Conservazione del campione: a temperatura ambiente. I campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. 5. Tempi di consegna al laboratorio: entro 24 ore 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: temperatura ambiente; i campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. Standard 21 giorni Urgenza. 7 giorni 7.6 RICERCA DI ROTTURE CROMOSOMICHE L'esame prevede l'esecuzione della coltura cellulare e l analisi al microscopio delle rotture cromosomiche (AC). Questo esame è eseguito in caso d'esposizione terapeutica o professionale del soggetto ad agenti chimici, fisici o sospetti mutageni. Standard 21 giorni Urgenza. 7 giorni 8 ANALISI CITOGENETICA MOLECOLARE La citogenetica molecolare prevede lo studio di regioni cromosomiche individuabili al microscopio attraverso tecniche che sfruttano il legame tra una sonda molecolare, costituita da un frammento di DNA specifico per la regione di interesse marcato con composti fluorescenti), e la sequenza di DNA complementare del preparato che è stato fissato e montato su un vetrino portaoggetti. L' Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una tecnica che consente la localizzazione di una specifica sequenza di DNA su preparati fissati di cromosomi, nuclei interfasici e sezioni di tessuto, ottenuti da qualsiasi tipo di materiale biologico (sangue, biopsie, liquido amniotico, gameti), sia esso fresco, crioconservato o paraffinato. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 16 di 81

Giorni e orari di accettazione dei campioni Dal lunedì al giovedì dalle 8.00 alle 14.00. Per invio di campioni urgenti sono necessari accordi telefonici con il Laboratorio. Documentazione necessaria, da allegare al campione Richiesta su ricettario regionale o modelli aziendali per le strutture tessera sanitaria consulenza genetica consenso informato scheda dati paziente (anagrafici ed anamnestici) per tutti i tipi di tessuti 21 giorni; urgenza 4 giorni Modalità di raccolta e trasporto del materiale biologico Pellet o vetrini per citogenetica 1. Quantità di campione necessario per l esame: 2 o più vetrini, 2 ml di pellet 2. Tipo di contenitore: contenitore porta vetrini, provetta a fondo conico 3. Modalità di identificazione del campione: cognome e nome utente, data di nascita, tipo di materiale, data di fissazione del campione, provenienza. 4. Conservazione del campione: pellet a 20, vetrini a temperatura ambiente. I campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. 5. Tempi di consegna al laboratorio: secondo accordi. 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: Temperatura ambiente, tramite corriere se proviene da strutture esterne, ausiliari esterni AOUC, autisti Aziende Sanitarie Campione di liquido seminale 1. Quantità di campione necessario per l esame: raccolta di liquido seminale rispettando 3 giorni di astinenza da rapporti sessuali prima della raccolta. 2. Tipo di contenitore: Contenitore sterile. 3. Modalità di identificazione del campione: cognome e nome utente, e data di nascita 4. Conservazione del campione: temperatura ambiente. 5. Tempi di consegna al laboratorio: entro 30 minuti dalla raccolta ; in genere la raccolta è effettuata in laboratorio. 6. Condizioni e modalità di trasporto del campione: a temperatura ambiente, consegna al laboratorio entro mezz ora. I campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. Principali applicazioni diagnostiche della FISH Nella SOD Diagnostica Genetica l ibridazione in situ fluorescente è utilizzata per: 1. diagnosi delle sindromi da microdelezione o da microduplicazione 2. caratterizzazione di marker cromosomici 3. caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici, sia bilanciati che sbilanciati 4. studio delle delezioni subtelomeriche www.aou-careggi.toscana.it Pag. 17 di 81

5. determinazione della percentuale di mosaicismi cromosomici 6. valutazione di anomalie numeriche su amniociti non coltivati (FISH interfasica prenatale) 7. valutazione della frequenza di anomalie cromosomiche nei gameti 8. validazione di diagnosi effettuate con altre metodiche I principali tipi di sonda impiegate alfoidi: specifiche per le regioni centromeriche painting: Specifiche per un intero cromosoma subcromosomiche: specifiche per un intero braccio cromosomico o per regioni più o meno estese di esso locus-specifiche: specifiche per regioni cromosomiche di piccole dimensioni La tecnica è impiegata per la diagnosi di: Sindrome del Cri du chat Sindrome di Di George e Velocardiofaciali Sindrome di Miller Dieker Sindrome di Smith-Magenis Sindrome di Williams Sindrome di Wolf-Hirschhorn 9 ANALISI GENETICA MOLECOLARE 9.1 PRINCIPI Le indagini di genetica molecolare consistono nello studio del DNA le cui alterazioni possono essere correlate o responsabili di un particolare fenotipo; attraverso l'analisi molecolare è quindi possibile individuare mutazioni del patrimonio genetico responsabili di malattie ereditarie. Le indagini molecolari permettono non soltanto di realizzare diagnosi caratterizzando geneticamente i soggetti affetti da una particolare patologia, ma anche di individuare i portatori sani; questa ultima informazione è impiegata nell ambito della consulenza genetica per il calcolo del rischio di ricorrenza. 9.2 QUANDO SI ESEGUE L'analisi molecolare può essere effettuata in epoca pre-natale e post-natale, a partire da diversi tipi di materiale biologico: villo coriale, liquido amniotico, sangue fetale o materiale abortivo nel caso di analisi prenatale; sangue periferico, biopsie di tessuto o tracce biologiche (capelli, sperma, ossa, dente ecc) nel caso di test condotti in epoca post-natale, materiale paraffinato, biopsie tumorali. 9.3 METODI Lo studio molecolare delle malattie genetiche prevede l estrazione del DNA dal campione biologico e nella maggior parte dei casi una reazione di amplificazione del DNA estratto con tecnica di Polymerase Chain Reaction (PCR). La fase analitica successiva e rappresentata generalmente dal Sequenziamento automatico del frammento amplificato in PCR. La ricerca di mutazioni viene quindi eseguita confrontando la sequenza ottenuta per il campione in esame con la sequenza di riferimento (sequenza detta wild-type, www.aou-careggi.toscana.it Pag. 18 di 81

cioè normale). Nel caso in cui le mutazioni che determinano una precisa patologia siano note ed in numero limitato, si può procedere alla sola ricerca di tali mutazioni invece di analizzare l intero gene. L analisi mediante sequenziatore automatico è anche utilizzato per l analisi di frammenti. Una delle applicazioni di questo tipo di analisi realizzata nel Laboratorio di Diagnostica Genetica è la Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) in diagnosi prenatale impiegata per individuare alterazioni numeriche relative ai soli cromosomi 13, 18, 21 e ai cromosomi sessuali X e Y. Un particolare gruppo di patologie genetiche e rappresentato da disordini causati da "mutazioni dinamiche", cioè alterazioni del DNA che si espandono di generazione in generazione. Tali mutazioni non sono identificabili tramite tecniche di screening o Sequenziamento ma in questi casi la metodica d elezione e rappresentata dal Southern Blot. La Sindrome dell X Fragile fa parte di questo gruppo di patologie da espansione. La tecnica Multiple Ligation dependent Probe Amplification (MLPA) è utilizzata per la ricerca di riarrangiamenti, delezioni o duplicazioni, per l analisi delle regioni introniche o regolatorie per i difetti di splicing di un gene. La tipologia di analisi molecolare eseguita può essere diversa rispetto a quello sopraindicato a seconda dei dati emersi dalla consulenza genetica. In alcuni casi per il completamento dell analisi può essere necessario eseguire l esame anche sui genitori o su altri familiari della persona che ha richiesto un analisi molecolare. Gli ultimi anni hanno visto la nascita di nuove piattaforme di sequenziamento ad alta produttività (Sequenziamento Massivo in Parallelo o Next Generation Sequencing, NGS) che sono basate sull implementazione della tecnologia denominata cyclic-array sequencing. Tutte le piattaforme NGS consentono di analizzare simultaneamente milioni di piccole sequenze di DNA e danno la possibilità di sequenziare un numero elevato di geni contemporaneamente, ad un costo notevolmente ridotto rispetto ai metodi di sequenziamento utilizzati fino ad oggi. 9.4 MODALITÀ DI PRELIEVO E TRASPORTO PER CAMPIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE Giorni e orari di accettazione dei campioni: Dal lunedì al venerdì dalle 8 alle 14. Campioni di sangue periferico 1. Quantità di campione necessario per l esame: >= 5/10 ml di sangue periferico, in due provette separate; 2. Tipo di contenitore: provetta contenente EDTA (per emocromo con tappo viola) 3. Modalità di identificazione del campione: cognome, nome e data di nascita dell utente 4. Conservazione del campione: temperatura ambiente; per tempi superiori alle 24 ore a 20. 5. Tempi di consegna al laboratorio: entro le 24 ore dal prelievo. Documentazione da allegare al campione: richiesta regionale o di altre aziende convenzionata con l Azienda Ospedaliero-Universitaria www.aou-careggi.toscana.it Pag. 19 di 81

Careggi fotocopia della Tessera sanitaria scheda dati utente (anagrafici ed anamnestici) consenso informato eventuale consulenza genetica Modalità di raccolta e trasporto del materiale biologico: Condizioni e modalità di trasporto del campione: temperatura ambiente; per tempi superiori alle 24 ore a 20 ; i campioni devono essere trasportati in contenitori adatti a conservarne la temperatura di trasporto indicata. I tempi sono diversi a seconda dei test. Consultare le pagine successive. I tempi sono espressi in giorni lavorativi e sono comprensivi del sabato, domenica e giorni festivi. 10 ELENCO DEI TEST ESEGUITI IN BIOLOGIA MOLECOLARE 10.1.1 Acromatopsia L'acromatopsia (ACHM) è un difetto retinico raro, caratterizzato da cecità ai colori, nistagmo, fotofobia e grave riduzione dell'acuità visiva a seguito della mancata o anomala funzione dei coni. La prevalenza è stimata in 1/30.000-1/50.000 a livello mondiale. Da un recente studio risulta che negli USA circa una persona ogni 33.000 è affetta da acromatopsia congenita, per un totale di circa 100.000 persone. Non sono noti studi analoghi in Italia. Comunque, se l'incidenza fosse la stessa, nel nostro Paese ci sarebbero circa 2.000 persone affette. L'acromatopsia congenita è particolarmente diffusa nell'isola di Pohnpei, nell'oceano Pacifico, dove interessa l'8% della popolazione, e nell'atollo di Pingelap si attesta al 5% della popolazione. L'ACHM è caratterizzata da riduzione dell'acuità visiva, nistagmo pendolare, aumento della sensibilità alla luce (fotofobia), piccolo scotoma centrale e perdita completa o parziale della discriminazione dei colori. La maggior parte dei casi presenta ACHM completa, con la completa assenza della funzione dei tre tipi di coni. Raramente è stata descritta una ACHM incompleta, con sintomi simili, ma meno gravi. L'ACHM è stata associata alle mutazioni di cinque geni (GNAT2 [1p13], PDE6C [10q24], PDE6H [12p13], CNGA3[2q11.2]), e CNGB3 [8q21.3]), che codificano per componenti chiave della cascata della fototrasduzione dei coni (proteina G GNAT2, fosfodiesterasi PDE6C/PDE6H, canali dei nucleotidi ciclici attivati CNGA3/CNGB3). Le mutazioni più comuni sono quelle in CNGB3, seguite da quelle in CNGA3, mentre le altre mutazioni sono rare. La diagnosi di ACHM si basa sull'esame clinico oftalmologico, sull'esame psicofisico (visione cromatica) e sull'esame elettrofisiologico (ERG), che dimostrano la perdita delle risposte fotopiche, mentre quelle scotopiche sono normali. La tomografia a coerenza ottica mostra la progressiva separazione e/o il distacco della giunzione tra il segmento interno/esterno dei fotorecettori e l'attenuazione dell'epitelio pigmentato della retina (RPE) all'interno della regione maculare. L'ACHM è trasmessa come carattere autosomico recessivo. Ricerca delle varianti di sequenza a carico dei geni associati alla patologia mediante Next Generation Sequencing (NGS). www.aou-careggi.toscana.it Pag. 20 di 81

Tecnica di Next Generation Sequencing Sequenziamento in automatico per la conferma delle varianti di sequenza evidenziate mediante Next Generation Sequencing DNA estratto da linfociti di sangue periferico (raccolto in 2 provette da 6 ml di sangue intero in provetta Vacutainer con EDTA). Indicazione all analisi: Sui soggetti affetti con diagnosi clinica effettuata tramite esami strumentali indicativi per tale patologia: indagini elettrofisiologiche (elettroretinogramma ed elettroculogramma), fluorangiografia retinica, ecc. In presenza di sospetto clinico e per familiarità 90-365 giorni dal prelievo 10.1.2 Amaurosi congenita di Leber L'amaurosi congenita di Leber (LCA) è una distrofia retinica e/o displasia a esordio prenatale: si ritiene che circa il 10-20% dei bambini ciechi soffra di LCA, dato che la rende una delle cause più frequenti di cecità nell'infanzia. Si pensa che sia responsabile del 5% delle malattie retiniche ereditarie. I bambini affetti hanno difficoltà a mantenere lo sguardo fisso e a stare attenti, a causa della bassa o assente sensibilità della retina agli stimoli visivi. L'elettroretinogramma dimostra una funzione retinica molto ridotta o assente. L'esame del fondo dell'occhio, nei primi mesi di vita, è spesso normale, ma in seguito si manifesta atrofia corio-retinica con migrazione intraretinica di pigmento. In alcuni pazienti è presente una lesione rilevata della macula. I pazienti presentano nistagmo e si strofinano frequentemente gli occhi. La LCA è trasmessa come carattere autosomico recessivo nella maggior parte dei pazienti; solo in rari casi è stata riportata un'eredità autosomica dominante. Ad oggi, dal punto di vista genetico, per l amaurosi congenita di Leber sono state identificate mutazioni in più di undici geni con differenti funzioni, tra cui i più frequenti sono GUCY2D, RDH12, RPE65, codificanti per proteine che svolgono un ruolo fondamentale nel processo di rigenerazione dei pigmenti visivi. Ricerca delle varianti di sequenza a carico dei geni associati alla patologia mediante Next Generation Sequencing (NGS). L analisi molecolare si basa sui seguenti metodi: Tecnica di Next Generation Sequencing Sequenziamento in automatico per la conferma delle varianti di sequenza evidenziate mediante Next Generation Sequencing www.aou-careggi.toscana.it Pag. 21 di 81

Su richiesta specifica del medico inviante è possibile eseguire il Sequenziamento in automatico degli esoni e delle regioni introniche fiancheggianti dei geni: RPE65 (retinal pigment epithelium-specific protein 65kDa) RDH12 (retinol dehydrogenase 12 all-trans/9-cis/11-cis) GUCY2D (guanylate cyclase 2D) CRB1 (crumbs homolog 1) AIPL1 (arylhydrocarbon receptor interacting protein-like 1) DNA estratto da linfociti di sangue periferico (raccolto in 2 provette da 6 ml di sangue intero in provetta Vacutainer con EDTA). Indicazione all analisi: Sui soggetti affetti con diagnosi clinica effettuata tramite esami strumentali indicativi per tale patologia: indagini elettrofisiologiche (elettroretinogramma ed elettrooculogramma), fluorangiografia retinica, ecc. In presenza di sospetto clinico e per familiarità Gene RPE65: 120 giorni Gene RDH12: 60 giorni Gene GUCY2D 120 giorni Gene CRB1: 120 giorni Gene AIPL1: 60 giorni Pannello di geni mediante NGS 90-540 giorni 10.1.3 Amiloidosi Familiare Le amiloidosi sistemiche (che interessano l intero organismo) rappresentano un gruppo di malattie, caratterizzate dalla presenza di depositi proteici insolubili nei tessuti. Gli organi maggiormente interessati sono i reni, il cuore, l'apparato gastrointestinale, il fegato, la cute, i nervi periferici e gli occhi, Le amiloidosi sono malattie rare: in Italia si stimano circa 800 nuovi casi di amiloidosi ogni anno. Le amiloidosi sistemiche ereditarie sono malattie a trasmissione autosomica dominante e a esordio in età adulta, causate da alterazioni di diverse molecole: transtiretina, apolipoproteina A-I, apolipoproteina A-II, lisozima, catena a del fibrinogeno, cistatina, LECT2 e gelsolina. L amiloidosi ereditaria da transtiretina è la forma più frequente. in ambito post-natale, nel sospetto di una amiloidosi da transtiretina, il primo livello dell indagine genetica prevede il sequenziamento degli esoni codificanti del gene TTR,al fine di individuare varianti patogenetiche. Nei familiari è ricercata esclusivamente la variante patogenetica riscontrata nel soggetto affetto della famiglia mediante sequenziamento Sanger In assenza di varianti patogenetiche nel gene TTR l indagine può proseguire con il secondo livello del test mediante Sequenziamento di ulteriori geni responsabili di amiloidosi. www.aou-careggi.toscana.it Pag. 22 di 81

Test di I livello: effettuato mediante sequenziamento Sanger per la ricerca di varianti patogenetiche nel gene TTR. Il sequenziamento Sanger può essere eseguito anche per la ricerca della variante patogenetica familiare o per la conferma di varianti riscontrate mediante NGS (Next Generation Sequencing). Test di II livello: mediante Sanger o tecnica di Next Generation Sequencing.(NGS) è possibile eseguire il sequenziamento dei geni TTR, APOA1, FGA, LYZ, CST3, APOA2, GSN, LECT2. associati ad Amiloidosi. L analisi si effettua su L indagine postnatale viene eseguita su DNA estratto da linfociti (prelievo di sangue periferico in 2 provette Vacutainer da 6 ml con EDTA). L indagine prenatale viene eseguita su DNA estratto da prelievo di villo coriale o di liquido amniotico. Indicazione all analisi Sui soggetti affetti con diagnosi clinica effettuata tramite esami strumentali indicativi di tale patologia (biopsia del grasso periombelicale, ecografia cardiaca in associazione al dosaggio ematico dell NT-proBNP e della troponina I, scintigrafia con Tc bisfosfonato capace di individuare precocemente una localizzazione cardiaca ed Elettromiografia dei quattro arti associata ad una visita neurologica) In presenza di sospetto clinico Familiarità In caso di familiarità il test non si esegue nei minori asintomatici Test di I livello diagnosi postnatale: 30 giorni diagnosi prenatale: 10 giorni Test di I livello in urgenza: 20 giorni Test di II livello diagnosi postnatale mediante NGS (sequenziamento dei geni TTR, APOA1,FGA, LYZ, CST3, APOA2, GSN, LECT2): 90-365 giorni Test di II livello diagnosi postnatale mediante Sanger: Gene TTR: 30 giorni Gene APOA1: 30 giorni Gene FGA: 30 giorni Gene LYZ: 30 giorni Gene CST3: 30 giorni Gene APOA2: 30 giorni Gene GSN: 30 giorni Gene LECT2: 30 giorni Test di II livello diagnosi prenatale: 10 giorni Test di II livello in urgenza: 20 giorni www.aou-careggi.toscana.it Pag. 23 di 81