Focus su sicurezza d uso e nutrizionale degli alimenti Roma novembre Problematiche relative alla validazione dei metodi di analisi
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- Violetta Sarti
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1 Focus su sicurezza d uso e nutrizionale degli alimenti Roma 2-22 novembre 2005 Problematiche relative alla validazione dei metodi di analisi MARZIA DE GIACOMO OGM E XENOBIOTICI DI ORIGINE FUNGINA
2 NORMATIVA RELATIVA AI METODI DI ANALISI Il complesso quadro normativo che regola l impiego degli ogm in alimentazione umana e animale implica per la sua applicazione la disponibilità di metodi di analisi in questo ambito si collocano le attività di enti di normazione nazionali (UNI), europei (CEN) ed internazionali (ISO, CODEX) che hanno istituito commissioni tecniche e gruppi di lavoro ad hoc per realizzare norme specifiche al fine di armonizzare le procedure analitiche in questo settore.
3 VALIDAZIONE DI UN METODO La validazione è un processo che stabilisce i limiti e le caratteristiche di affidabilità e di pertinenza di un metodo per un particolare scopo. Secondo la norma ISO 7025, le metodologie analitiche per l analisi degli OGM dovrebbero essere validate prima del loro utilizzo presso i laboratori di controllo.
4 Perchè sono indispensabili metodi standadizzati e validati Ridurre le controversie commerciali e legali Osservanza della normativa Garantire libertà di scelta al consumatore Legislazione EU e procedure di autorizzazione L impresa che intende introdurre un OGM deve fornire il metodo di rivelazione Deve fornire il materiale di riferimento L autorizzazione è subordinata alla presentazione dei metodi di analisi e campionamento convalidati dal Laboratorio Comunitario di Riferimento (JRC) di Ispra ( Regulation (EC) N 829/2003 )
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6 Laboratorio Comunitario di riferimento - ENGL L allegato del Reg. 829/2003 riporta i compiti e le funzioni del Laboratorio Comunitario di Riferimento (LCR) rappresentato dal Centro Comune di Ricerca della Commissione (CCR) Per i compiti dell LCR il CCR è affiancato dal Consorzio di Laboratori Nazionali di riferimento (ENGL) ENGL è stato inaugurato ufficialmente nel 2002, ma è già in attività dal 999 come consorzio di laboratori pubblici per la risoluzione di problemi tecnici
7 Membro dello Steering Committee
8 Laboratorio Comunitario di riferimento - ENGL La coordinazione e la presidenza del network è sotto la responsabilità della Biotechnology & GMOs Unit dell IHCP (JRC) assistita da uno Steering Committee Lo Steering Committee dell ENGL in collaborazione con un working group che si occupa di validazione ha sviluppato linee guida sui criteri di accettabilità ed i requisiti di perfomance dei metodi di analisi Method acceptance Criteria : criteri che devono essere soddisfatti dal metodo prima dell inizio di qualsivoglia convalida da parte del LCR Methods Performance requirements : requisiti minimi che i risultati degli studi collaborativi devono soddisfare
9 Mandate and Activities of the Biotechnology & GMOs Unit The B&GMOs Unit is the JRC reference for scientific and technical support to the EC biotechnology regulatory framework Chair of ENGL (European Network GMO Laboratories) Mandate of CRL (Community Reference Laboratory) Research: Sampling Method development Method validation
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12 JRC/CRL validation of the GMO specific detection method developed for Bt sweet corn maize
13 La validazione è la conclusione di un lungo processo SVILUPPO DI UN NUOVO METODO: dato per scontato OTTIMIZZAZIONE DEL METODO: dato per scontato PREVALIDAZIONE DEL METODO: definire le condizioni VALIDAZIONE COMPLETA DEL METODO: Processo costoso
14 Fattori critici nell analisi in PCR dei prodotti OGM Sensibilità >>> Messa a punto ed ottimazione della PCR, qualità del DNA (grado di degradazione of DNA, presenza di inibitori, etc.) Specificità >> Progettazione dei Primer, scelta di sequenze target uniche Accuratezza e precisione >> Adeguati controlli, uso di materiali di riferimento certificati, adeguato numero di replicati, uso di procedure validate, condizioni stringenti di PCR
15 Requisiti della pre-validazione Descrizione del metodo Basi scientifiche (ELISA,r.t.PCR) Definizione dello scopo (quantifica,rilevazione) Disponibilità di un protocollo ottimizzato Protocollo tecnico dettagliato Definizione delle applicazioni pratiche Applicabilità (matrice, tipo di campione) Caratteristiche operative (apparecchiature,costi,tempistica) Requisiti tecnici dell operatore Introdurre un controllo adeguato Materiale di riferimento(certificato o preparato) Adeguato controllo(positivo,negativo),controllo reagenti Evidenziare le limitazioni del metodo Applicabilità,costi,apparecchiature,rischi Certezza che la performance dei parametri sia idonea ad una validazione interlaboratorio
16 Performance dei parametri Parametri Definizioni specificità linearità range dinamico accuratezza Proprietà del metodo di rispondere esclusivamente dell analita di interesse (95%) Proporzionalità del segnale alla quantità di materiali di riferimento Intervallo di concentrazioni lungo il quale il metodo risponde in modo lineare con un adeguato livello di accuratezza e precisione (0%-200%; 0.9% %) Grado di accordo tra il risultato di una misurazione ed il valore di riferimento del misurando accettato (+/- 25%)
17 Parametri Definizioni Valori di cut-off precisione Intra-lab. Ripetibilità RSD r Inter-lab. Riproducibilità RSD R RSD r = RSD R /.6 RSD R < 25% Limite di rivelabilità (LOD) la minima quantità o concentrazione dell analita nel campione, che può essere rivelata, ma non necessariamente quantificata, con un accettabile livello di precisione ed accuratezza LOD < /20th of the value of specification with an RSD r </=33% 0.9% GMO LODmin = 0.045% Limite di quantificazione (LOQ) Robustezza la minima quantità o concentrazione dell analita nel campione, che può essere quantificata, con un accettabile livello di precisione ed accuratezza Misura della stabilità del metodo a piccole e deliberate deviazioni dalle condizioni sperimentali LOQ < /0 th of the value of specification with an RSD r </=25% 0.9% GMO LOQmin = 0.09% Difficile da determinare
18 2.5 Validazione e performance del metodo Metodo Measured GM% (4 replicates) 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0,5,0 0,5 0,0 0,0 0,5,0,5 2,0 2,5 GM% 2.0 Estimated GM% GM% Metodo 2
19 Laboratori partecipanti Istituto Superiore di Sanità IZS Piemonte Liguria e Valle d Aosta IZS Lazio e Toscana IZS delle Venezie IZS Lombardia ed Emilia Romagna IZS Abruzzo e Molise IZS Umbria e Marche IZS Mezzogiorno IZS Sardegna IZS Sicilia Campioni scelti e forniti dall IZS PLVA 4 farine di soia fioccato di soia 4 farine proteiche Stessi campioni e standards estratti con AB I PRISM 600
20 Studio Collaborativo per la Determinazione di Soia RR in Farine e Prodotti da Forno Metodo Quantitativo Campioni Forniti dall IZS PLVA 7 laboratori partecipanti 5 campioni incogniti da estrarre con il metodo del CTAB (2 protocolli) Gli stessi 5 campioni estratti con ABI PRISM 600 Modalità Simplex: gene endogeno lectina e gene target RR amplificati in reazioni separate Prodotti da forno Farina grano tenero + farina soia Pane + farina soia CRM IRMM
21 Z-scores per la soluzione D (3,0 % OGM) 3,00 2,00 3,00 2,00,00 Z-scores per la soluzione B (,20 % OGM) z-scores,00 0,00 -,00-2,00 z-scores 0,00-3, Laboratori -,00-2,00-3, Laboratori
22 Parametri di validazione estrazione in laboratorio Campioni prodotti forno farine grano tenero, soia farine grano tenero, soia pane farina di soia CRM-IRRM Anno Numero di lab partecipanti Numero di campioni per lab. Numero di lab esclusi 0 Numero di lab mantenuti Valore vero Media (%) SD R RSD R (%) R (R=2,8*S R )
23 Parametri di validazione ABI PRISM 600 Campioni prodotti forno farine grano tenero, soia farine grano tenero, soia pane farina di soia CRM-IRRM Anno Numero di lab partecipanti Numero di campioni /lab Numero di lab esclusi Numero di lab mantenuti Valore vero Media (%) SD R RSD R (%) R (R=2,8*S R )
24 From A. Holst Jensen, K.G. Berdal,J. AOAC 2004
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26 6th Framework Programme Priority 5 Food Quality and Safety CO-EXTRA GM and non-gm supply chains: their CO-Existence and TRAceability WP 4 ISS T4. validazione modulare T4.2 linee guida per La validazione di nuove metodi T4.3 studi collaborativi di validazione T4.4 analisi e sviluppo di piani di campionamento T4.6 integrazione e diffusione dei dati Database dei Database dei costrutti metodi validati GM autorizzati T4.5 compatibilità dei piani di controllo-incertezza di misura
27 Focus su sicurezza d uso e nutrizionale degli alimenti Roma 2-22 novembre 2005
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