ESAMI NUOVI-ESAMI OBSOLETI
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- Valerio Micheli
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1 INCONTRO CON I MEDICI DI MEDICINA GENERALE AREZZO ORDINE DEI MEDICI 15 MAGGIO 2010 Regione Toscana Azienda USL 8 Arezzo Sede legale e Centro Direzionale Via Curtatone, Arezzo Telefono ESAMI NUOVI-ESAMI OBSOLETI Dott. Moreno Matteucci Sieroimmunologia e Biologia Molecolare Laboratorio Analisi USL 8 Arezzo Dipartimento Patologia Clinica
2 QUANTIFERON TB GOLD
3 TBC attiva 8 milioni di nuovi casi per anno TBC latente Due miliardi di persone
4 Tubercolosi dimensioni del problema E responsabile, ogni anno, nel mondo: 5% di tutti i decessi (2 milioni) 9,6% dei decessi in soggetti tra 15 e 59 anni il maggior numero dei morti per malattia infettiva La letalità nei casi non trattati è di circa il 50% nei paesi in via di sviluppo è responsabile di oltre il 25% dei decessi evitabili. devastante impegno economico
5 Patogeno intracellulare, a trasmissione interumana La ricchezza in lipidi della parete cellulare conferisce ai micobatteri alcune particolari caratteristiche: MYCOBACTERIUM TUBERCOLOSIS ssenza di infezione (5%) Infezione (95%) TBC attiva (5%) (entro 2 anni) Lento tempo di moltiplicazione TBC latente (95%) Riattivazione (5%) nessuna riattivazione Alcool acido resistenza Reazione del S.I. tipo corpo estraneo Inefficacia dei comuni antibiotici
6 ESPOSIZIONE AL M.TUBERCOLOSIS ASSENZA DI INFEZIONE (5% INFEZIONE (95%) TBC ATTIVA (5% ENTRO 2 ANNI) TBC LATENTE (95%) RIATTIVAZIONE (5%) NESSUNA RIATTIVAZIONE
7 Produzione di interferone-γ (IFN-γ) L infezione tubercolare stimola la risposta della cellule T Le cellule-t attivate secernono citochine IFN-Ү TNF IL8 Le cellule-t effettrici producono IFN-γ entro poche ore dalla stimolazione Le cellule-t memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN-γ prima di 24h L IFN-γ non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile
8 INTRADERMOREAZIONE DI MANTOUX Introdotta nel 1890, è il più vecchio test diagnostico ancora in uso Si basa sull inoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)
9
10 VANTAGGI DELLA MANTOUX Utile per individuare la TBC latente Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva Basso costo Non richiede l intervento del laboratorio
11 LIMITI DELLA MANTOUX Falsi positivi (5-60% dei vaccinati) Tempo trascorso dalla vaccinazione Numero di vaccinazioni Età al momento della vaccinazione - Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM) - Effetto booster
12 Effetto della vaccinazione con BCG sul TST Analisi di 24 studi con N = 240,243 soggetti Quando il BCG è somministrato nell infanzia, 6% falsi-positivi nei risultati del TST a causa del BCG Quando il BCG è somministrato dopo l infanzia, 40% falsi-positivi a causa del BCG
13 LIMITI DELLA MANTOUX Falsi negativi Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi avanzata) Errori di inoculo Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione)
14 LIMITI DELLA MANTOUX Problemi di ordine pratico Doppia presentazione del paziente Mancata lettura nel 30% dei casi Soggettività della misurazione
15 CRITERI DI LETTURA DELLA MANTOUX
16 Interferon Gamma Release Assay TEORIA: i linfociti T precedentemente sensibilizzati con antigeni tubercolari producono alte concentrazioni di IFN-gamma quando riesposti allo stesso antigene.
17 I TEST BASATI SULL' INTERFERONE γ I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con l antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina Ricerca dell IFN-γ dopo opportuna incubazione assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE presenza di IFN-γ = INFEZIONE presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO assenza di IFN-γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO
18 SCELTA DEGLI ANTIGENI I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis PPD (purified proteic derivative) ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) CFP-10 (culture filtrate protein 10) ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT
19 RACCOLTA SANGUE IN PROVETTE EPARINATE QUANTIFERON TB GOLD C-NEG ESAT6 CFP10 MITOGENO INCUBAZIONE PER h A 37 CENTRFUGAZIONE COLORE MISURA DELLA D.O DOSAGGIO IFN CONTRO CURVA DI TARATURA RECUPERO DEL PLASMA DOSAGGIO DELL' IFNγ (SANDWIC ELISA) LAVAGGIO AGGIUNTA SUBSTRATO AGGIUNTA STOP
20 Vantaggi dei metodi basati su IFN-γ Test in vitro Nessun effetto booster Specificità elevata Non influenzati dalla vaccinazione con BCG Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non è richiesta la collaborazione del paziente Interpretazione oggettiva
21 Test IFN-γ vs. Mantoux Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN-γ I casi con Mantoux NEG e IFN-γ POS sono generalmente associati con l esposizione I casi con Mantoux POS e IFN-γ NEG non sono generalmente associati con l esposizione
22 Correlazione IFN-γ/Mantoux IFN-γ Mantoux Sensibilità 89.0% (105/118) 65.7% (50/76; 5 mm) Specificità 98.2% (213/217) 35.4% (73/113; 10 mm)
23 VANTAGGIDELL' IGRA Nessuna correlazione con la vaccinazione Nessuna correlazione con le micobatteriosi Nessuna variazione in corso di terapia Alta riproducibilità Maggior sensibilità negli immunodepressi
24 LINEE GUIDA CDC Nelle Guidelines for the Investigation of Contacts of Persons with Infectious Tuberculosis (CDC Atlanta, 2005) si suggerisce che il QFT-G G assay POTREBBE essere usato al posto del TST in tutti i casi (Dr.( Vernon)
25 LINEE GUIDA NICE National Institute for Health and Clinical Excellence TB guidelines (Regno Unito, 2006) si consiglia uno screening iniziale con TST seguito da un test IGRA (se disponibile) per i casi TST+, oppure (se il risultato del TST non è affidabile) per la conferma del TST.
26 Screening della popolazione NESSUNA strategia è costo efficace se l incidenza della LTBI < 10%. Con incidenza della LTBI del 10-40%, il test della tubercolina, seguito da un test IGRA sui pazienti positivi alla tubercolina, è cost-effective. L uso del solo IGRA test è costo efficace SOLO SE l incidenza l della LTBI è 40%.
27 CONCLUSIONI NELLA SITUAZIONE EPIDEMIOLOGICA ITALIANA LA STRATEGIA DI UTILIZZO DEL TEST TUBERCOLINICO CUTANEO CON SUCCESSIVA CONFERMA DEI TEST CUTANEI POSITIVI USANDO I TEST SU SANGUE APPARE QUELLA IN GENERALE POTENZIALMENTE DOTATA DI UN MIGLIOR RAPPORTO COSTO-BENEFICIO.
28 CALPROTECTINA
29 CALPROTECTINA La Calprotectina è una proteina di 36 KDa presente in tutte le cellule, tessuti e liquidi di tutti i distretti del corpo umano. Le è stato attribuito il nome Calprotectina per sua la capacità di legare il calcio e lo zinco e di inibire la crescita microbica.
30 è presente in elevata concentrazione nel citoplasma dei globuli bianchi neutrofili (granulociti neutrofili) 5-15 mg/l = 5%delle proteine totali, 50-60% delle proteine solubili viene rilasciata dai granulociti neutrofili in conseguenza della loro distruzione o di una stimolazione ed è quindi un marker del loro turnover
31 Nella popolazione sana la Calprotectina Fecale(FCal) è presente nelle feci ad una concentrazione circa 10 volte più alta rispetto a quella del plasma. Nelle feci la proteina è stabile fino a sette giorni a temperatura ambiente e per mesi se il materiale viene congelato a -20
32 rappresenta una diretta misura della attività infiammatoria della parete intestinale è in grado di registrarla anche a uno stadio così lieve da non essere sufficiente a modificare la VES o la CRP i livelli nelle feci non sembrano essere influenzati da flogosi in altri distretti che possono invece provocare un innalzamento dei marcatori sistemici di infiammazione
33 Incremento significativo: tumore dello stomaco tumore o l adenoma del colon malattia di Crohn colite ulcerosa. Valori sostanzialmente normali di calprotectina sono stati invece evidenziati nelle patologie funzionali e nella celiachia
34 LA CALPROTECTINA NELLE PATOLOGIE ADDOMINALI Aumenta nelle feci del 96% di pazienti con Crohn - discrimina tra Crohn e intestino irritabile - aumenta nelle feci di pazienti con colite ulcerosa e neoplasie intestinali - elevata predittività negativa - aumento maggiore nelle fasi clinicamente attive di malattia - marcatore predittivo di riacutizzazione
35 *INDICAZIONI ALLA RICHIESTA DI DOSAGGIO DELLA CALPROTECTINA FECALE *per monitorare l attività infiammatoria intestinale *come indicatore di ricorrenza della patologia *nel follow-up terapeutico *per escludere MICI in soggetti con diarrea cronica o dolore addominale cronico sconosciuto
36 MATERIALE PER LA RACCOLTA DEL CAMPIONE
37 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI < 40 μg/g NEGATIVO μg/g DUBBIO ripetere la determinazione con un nuovo campione > 60 μg/g POSITIVO > 300 μg/g POSITIVO Oltre il limite di linearità
38 PARVOVIRUS B19
39 PARVOVIRUS B19 PARVOVIRUS B19 E' ANCHE CONOSCIUTO COME: ERITROVIRUS B19 PARVOVIRUS UMANO E' L'AGENTE EZIOLOGICO DELLA QUINTA MALATTIA O ERITEMA INFETTIVO
40 CARATTERISTICHE DEL VIRUS DNA virus a filamento singolo lineare (famiglia Parvoviridae, genere Erythrovirus) Codifica tre proteine VP1, VP2 (Proteine del capside) NS1 (non-strutturale, usato dal virus per replicare se stesso) Le Proteine del Capside sono composte per il 5% dalla VP1 e per il 95% dalla VP2 (tutti i saggi sierologici sono basati sulla rilevazione di una o di entrambe le proteine) Non ha involucro - il virus sopravvive al calore e ai trattamenti usati per gli emoderivati
41 MECCANISMO DI INFEZIONE DELLE CELLULE ERITROIDI Il bersaglio del virus sono le cellule nucleate che appartengono alla serie eritroide, precursori degli eritrociti. Si ha lisi cellulare, diminuzione di globuli rossi,della emoglobina e quindi grave anemia Le cellule eritroidi dispongono dello specifico recettore (l'antigene eritrocitario P o globoside P) ed inoltre sono cellule in proliferazione, caratteristica determinante per la possibile replicazione virale, che necessita di fattori presenti solo nella fase S di replicazione cellulare L antigene P si trova anche sulle Cellule Endoteliali, Megacariociti Cellule della Placenta Cellule cardiache ed epatiche del feto L uomo è l unico ospite conosciuto
42 VIE DI TRASMISSIONE Contatto mano-bocca Sangue ed emoderivati Trapianto di midollo e altri organi Dalla madre al feto (trasmissione verticale ) Per via aerea Periodo di incubazione: 4 20 giorni Il periodo di maggiore trasmissione del virus si ha nei primi 7-14 giorni (prima della comparsa dei sintomi)
43 RISPOSTA ANTICORPALE
44 CATEGORIE A RISCHIO BAMBINI (4-11 anni d età) Eritema Infettivo(EI) / Quinta malattia Le epidemie in genere si segnalano ogni 3-4 anni Il 50-70% degli adulti sono siero-positivi IMMUNOCOMPROMESSI TRAPIANTATI TRASFUSI
45 PARVOVIRUS E GRAVIDANZA Il feto è sensibile all infezione verso la 6 settimana di gestazione. I Diminuzione di periodo di vita dei globuli rossi. Alto rischio di sviluppare idrope nel secondo trimestre quando la massa dei globuli rossi fetali aumenta da 3 a 4 volte.
46 FISIOPATOLOGIA DELL'INFEZIONE FETALE Infezione materna con viremia Virus trasmesso attraverso la placenta Il virus si fissa all antigene P delle cellule eritroidi, del fegato e del cuore fetali Il virus si replica con conseguente morte delle cellule Anemia fetale dovuta alla diminuzione dei globuli rossi e emoglobina Anemia porta ad una diminuzione di ossigeno nei tessuti (ipossia) Compensazione con un aumento del lavoro da parte del cuore collasso & idrope fetale NB: l infezione della milza, fegato e cuore fetale può essere la causa che contribuisce al collasso degli organi
47 INFEZIONE PRIMARIA IN GRAVIDANZA Rischio di trasmissione intrauterina 25-33% Eis-Hubinger 1998-Yaegashi 1998-Koch 1998 Rischio danno fetale 5-10 % Harger, Koch and Adler Kerr Koch 1993
48 STATISTICHE RECENTI 4 milioni di nascite in Europa /anno Il 30% delle donne non sono immunizzate quindi di donne sono a rischio di infezione Stima di aborti è di circa 3000/anno
49 PAZIENTI DA CONTROLLARE Sospetta esposizione (NOTA: il 25-50% delle donne sono asintomatiche) Presenza di un rash Poliartralgia non spiegabile Idrope fetale non immune Controlli pre gravidanza per gruppi professionali ad alto rischio
50 PARVOVIRUS E SINTOMATOLOGIA ARTRITICA Rare in bambini. Più comuni nelle donne: 60% donne, 30% uomini soffrono di dolori artritici Principalmente colpite le articolazioni delle mani, piedi e ginocchia Di solito persiste 1-3 settimane raramente qualche mese E'comune una reinfezione anni più tardi a causa della replicazione del DNA virale a livello della membrana sinoviale
51 PARVOVIRUS E TRAPIANTI L infezione da Parvovirus B19 può essere cronica nei trapiantati di organo o di midollo osseo a causa delle terapie immunosoppressive usate. Può contribuire ad alcuni casi di rigetto.
52 A CHI FARE IL TEST'? Screening sulle donne in gravidanza Reumatologia Trasfusioni/Trapianti Immunocompromessi (HIV+, leucemia)
53 I TEST IN BIOLOGIA MOLECOLARE I TEST IN BIOLOGIA MOLECOLARE SONO TEST BASATI SULLA AMPLIFICAZIONE DI SPECIFICI SEGMENTI DEL GENOMA DI MICROORGANISMI (VIRUS O BATTERI) OPPURE UMANO E' UNO DEI CAMPI IN GRANDE ESPANSIONE NEI TEST DI LABORATORIO
54 I TEST ESEGUITI NEL NOSTRO LABORATORIO HCV RNA QUANTITATIVO GENOTIPIZZAZIONE HCV HBV DNA QUANTITATIVO HIV RNA QUANTITATIVO MBT QUALITATIVO TUTTI I TEST UTILIZZANO LA TECNOLOGIA REAL-TIME
55 APPROPRIATEZZA DELLA RICHIESTA I TEST IN BIOLOLOGIA MOLECOLARE DEVONO ESSERE RICHIESTI CON APPROPRIATEZZA ALTRIMENTI SONO INUTILI(O ADDIRITTURA DANNOSI) SUL PIANO DIAGNOSTICO/ TERAPEUTICO RAPPRESENTANO UN COSTO NOTEVOLE E INGIUSTIFICATO
56 QUANDO RICHIEDERE LA RICERCA DI HCV-RNA PAZIENTI CON ANTICORPI POSITIVI PAZIENTI IMMUNOSOPPRESSI O IMMUNOCOMPROMESSI CON ALT ELEVATE E ANTI HCV NEGATIVI (POSS. FALSI NEGATIVI) NEONATI DA MADRE HCV POSITIVA E/O HIV POSITIVA (3, 6 e18 MESI DALLA NASCITA) A TERMINE GRAVIDANZA NELLA MADRE ANTI-HCV POSITIVA
57 QUANDO RICHIEDERE LA RICERCA DI HCV-RNA FOLLOW-UP DEI PAZIENTI IN TERAPIA ANTIVIRALE 1 DOSAGGIO PRIMA DELL' INIZIO DELLA TERAPIA DUE DOSAGGI A DISTANZA DI UN MESE E TRE MESI PER VALUTARE LA RISPOSTA SE RESPONDER CONTROLLO A SEI MESI E UN ANNO
58 QUANDO RICHIEDERE LA GENOTIPIZZAZIONE PRIMA DELLA AMMISSIONE ALLA TERAPIA
59 HBV-DNA SOGGETTI CON HbsAg POSITIVO DA OLTRE 6 MESI SE HbeAg + o DELTA + INDIPENDENTEMENTE DAI VALORI DI ALT E HBV-DNA VALUTAZIONE CLINICA DI AMMISSIONE ALLA TERAPIA CON LAMIVUDINA O ADEFOVIR SE HBV-DNA >2000 UI/ml e/o ALT ELEVATA SE HbeAg e DELTA - SE HBV-DNA <2000 UI/ml e ALT NORMALE RIPETERE ALT e HBV-DNA DOPO 3 e 6 MESI FOLLOW-UP ALT E HBV-DNA OGNI 3-6 MESI se ALT ELEVATE o HBVDNA > UI/ml (anche 1 volta) Se ALT sempre normali e HBV DNA < Continua follow-up dal medico curante con ALT ogni 12 mesi
60 QUANDO RICHIEDERE HIV RNA DURANTE IL FOLLOW-UP DELLA TERAPIA IL TEST NON DEVE ESSERE ESSERE UTILIZZATO COME TEST DI SCREENING
61 GRAZIE PER L'ATTENZIONE
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