I. PROGRAMMA DELLA RICERCA

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1 Progetto di ricerca: MECCANISMI EPIGENETICI DI RESISTENZA AL TRATTAMENTO FARMACOLOGICO NEI TUMORI STROMALI GASTROINTESTINALI Responsabile: Prof. Sabrina ANGELINI I. PROGRAMMA DELLA RICERCA Negli ultimi due decenni abbiamo assistito a numerosi progressi nel campo della chemioterapia oncologica riguardanti la scoperta, lo sviluppo e l'applicazione clinica di nuovi farmaci. Tuttavia, vecchi e nuovi farmaci condividono il fenomeno della resistenza, il principale problema che deve affrontare la ricerca sul cancro. Infatti, una prima risposta al trattamento è spesso seguita dalla progressione della malattia, che, accompagnata da una diminuzione delle opzioni terapeutiche, porta in definitiva al fallimento del trattamento e alla morte per malattia ricorrente o metastatica. Vi è un crescente numero di prove che riconoscono che l'insorgenza della resistenza ai farmaci è la conseguenza di diversi processi tra cui mutazioni secondarie e risposte adattative derivanti da influenze genetiche ed epigenetiche, come la deregolazione dei microrna (mirna) e la metilazione, e il controllo del microambiente tumorale. Accanto a questo, è ben noto che diversi pazienti rispondono in modo diverso agli stessi trattamenti farmacologici. La grande maggioranza degli studi riportati in letteratura ha riguardato la valutazione della farmacoresistenza in relazione al make-up genetico di ciascun individuo. La conoscenza di anomalie genetiche nel target farmacologico stesso, nei geni chiave della malattia, nei trasportatori dei farmaci o enzimi che metabolizzano i farmaci, può infatti contribuire a predire l'efficacia o la tossicità dei farmaci, e una conoscenza a priori del profilo di sensibilità/resistenza ai farmaci potrebbe guidare i clinici nella selezione del miglior approccio terapeutico. Recentemente l attenzione si è rivolta allo studio dell epigenetica, in particolare di mirna e metilazione. Queste modificazioni epigenetiche, possono agire come oncogeni che guidano le vie di segnalazione nelle cellule tumorali, promuovendo sopravvivenza e crescita tumorale, nonché resistenza ai trattamenti chemioterapici [2]. La metilazione, aggiunta di gruppi metilici ai residui di citosina, è essenziale per il normale sviluppo intervenendo nel controllo dell espressione genica. I mirna sono piccole molecole endogene di RNA non codificante, a singolo filamento, di nucleotidi. Si tratta di importanti regolatori, sia positivi che negativi, di geni e svolgono diverse funzioni. La più conosciuta, attualmente, è quella di regolazione post-trascrizionale, in cui vanno a inibire la traduzione di determinati RNA messaggeri (mrna) [1]. In particolare, profili di espressione di specifici mirna sono stati

2 associati allo sviluppo di tumori, alla loro progressione e alla risposta alla terapia [3-5]. I mirna hanno la potenzialità di diventare importanti biomacatori di diagnosi, prognosi e suscettibilità nei confronti di patologie cronico-degenerative. I tumori stromali gastrointestinali (GIST) presentano anomalie nei geni che codificano per i recettori tirosin-chinasici, KIT e PDGFRA [6-7]. Indipendentemente dal tipo di mutazione dei geni KIT/PDGFRA, frequentemente si osserva una alterazione del pathway PI3K/AKT/PTEN/mTOR. In particolare, questa alterazione comporta una iperattivazione della via, che è essenziale per la segnalazione oncogenica, ed è sostanziale per la sopravvivenz dell cellule GIST. La deregolazione del pathaway PI3K/AKT/PTEN/mTOR risulta infatti in una proliferazione incontrollata e i un'aumentata attività antiapoptotica delle cellule tumorali. Studi preclinici hanno confermato che l'inibizione della via PI3K/AKT/PTEN/mTOR rappresenta un bersaglio razionale per la terapia in pazienti GIST, per i quali attualmente in prima linea è disponibile solamente imatinib, un inibitore delle tirosin-chinasi che blocca l attività di KIT/PDGFRA [8]. Imatinib è l unico farmaco di prima linea approvato, che viene somministrato anche a quei pazienti per i quali, sulla base del profilo mutazionale KIT/PDGFRA, si può già anticipare la mancata efficacia o insorgenza di resistenza. Sfortunatamente, la maggior parte dei pazienti va incontro a resistenza e attualmente non ci sono altri trattamenti approvati per pazienti GIST resistenti a imatinib [9]. Negli ultimi anni, la ricerca si è rivolt allo sviluppo di molecole in grado di bloccare il pathway PI3K/AKT/PTEN/mTOR. I primi studi condotti impiegando inibitori di mtor hanno evidenziato un successo limitato. Pertanto, il targeting di PI3K o AKT, bersagli che si trovano a monte di mtorc1, potrebbe tradursi in un'inibizione migliore e completa dell'intero pathway. Diverse strategie sono attualmente in fase di sviluppo nella terapia dei GIST, tra i quali l'inibizione farmacologica del PI3K, in combinazione con imatinib. L inibizione contemporanea PI3K/mTOR sembra costituire una strategia promettente per superare o ritardare la resistenza, purtroppo inevitabile, al trattamento standard nei GIST. Tra gli inibitori in via di sviluppo, sono stati ottenuti promettenti risultati preliminari in vitro con BYL719, un inibitore selettivo della forma alpha-pi3k [10]. L obiettivo del progetto di ricerca è valutare il profilo di espressione di mirna e della metilazione globale in un modello di GIST in seguito al trattamento con BYL719, inibitore del pathway PI3K/AKT/PTEN/mTOR. Lo scopo è di identificare, se esiste, un profilo di espressione di mirna e metilazione associato alla risposta al trattamento con BYL719 e all insorgenza di resistenza in seguito a trattamento cronico. Il progetto si articolerà nei seguenti punti: A. Valutazione del profilo di espressione di mirna nelle cellule sensibili e resistenti al trattamento con BYL719 e identificazione di potenziali biomarcatori di resistenza al

3 trattamento B. Valutazione del profilo di metilazione globale nelle cellule sensibili e resistenti al trattamento con BYL719 e identificazione di potenziali biomarcatori di resistenza al trattamento A. Integrazione dei risultati di espressione di mirna e di metilazione al fine di generare un profilo epigenetico di resistenza al trattamento con BYL719 BIBLIOGRAFIA [1] Breving K, Esquela-Kerscher A. The complexities of microrna regulation: mirandering around the rules. Int J Biochem Cell Biol.42, (2010). [2] Nana-Sinkam SP, Croce CM. Clinical applications for micrornas in cancer. Clin. Pharmacol. Ther. 93(1), (2013). [3] Croce CM Causes and consequences of microrna dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, (2009). [4] Iorio MV, Croce CM. MicroRNA involvement in human cancer. Carcinogenesis 33(6): (2012). [5] Iorio MV, Croce CM. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnstics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol. Med. 4(3), (2012). [6] Nilsson B, Bumming P, Meis-Kindblom JM, et al. Gastrointestinal stromal tumors: the incidence, prevalence, clinical course, and prognostication in the preimatinib mesylate era a population- based study in western Sweden. Cancer 103(4), (2005). [7] Benesch M, Leuschner I, Wardelmann E et al. Gastrointestinal stromal tumours in children and young adults: a clinicopathologic series with long-term follow-up from the database of the Cooperative Weichteilsarkom Studiengruppe (CWS). Eur. J. Cancer 47(11), (2011). [8] Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. N. Engl. J. Med. 347(7), (2002). [9] Demetri GD, van Oosterom AT, Garrett CR, et al. Efficacy and safety of sunitinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumour after failure of imatinib: a randomised controlled trial. Lancet 368(9544), (2006) [10] Furet P, Pfefferle AD, Owens P, et al. Discovery of NVP-BYL719 a potential and selective phosphatidylinositol-3 kinase alpha inhibitor selected for clinical evaluation. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23(13), (2013).

4 II. PIANO DI FORMAZIONE L assegno di ricerca rientra nel progetto PRIN numero 2015Y3C5KP_002, intitolato Targeting the cancer resistome to restore tumour sensitivity through novel, existing and failed drugs. Inizialmente, il titolare dell assegno dovrà acquisire le metodiche necessarie (i) ad estrarre e quantificare DNA, RNA totale e proteine - da linee cellulari e da tessuto (ii) alla valutazione dei mirna e del profilo globale di metilazione e (iii) alla identificazione dei geni target coinvolti. Il profiling dei mirna e di metilazione verrà eseguito su un modello cellulare di GIST reso resistente, mediante trattamento a concentrazioni crescenti (subcolture), al trattamento con BYL719. In particolare, in ogni subcoltura cellulare saranno analizzati i profili di espressione dei mirna e di metilazione con l obiettivo di identificare mirna deregolati e alterati livelli di metilazione, quali responsabili di resistenza al trattamento. Una volta terminato il profiling, si procederà alla conferma con singolo assay dei mirna alterati o al sequenziamento dei geni metilati. I mirna che si confermeranno deregolati verranno ulteriormente valutati mediante inibizione o ripristino dell'attività dello specifico mirna alterato, e sarà possibile verificare se la risposta farmacologica viene ripristinata. Il piano di formazione proposto vuole fornire competenze specifiche da acquisire presso i Laboratori di Farmacogenetica e Farmacogenomica, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie del nostro Ateneo, ad un laureato con il titolo di Dottore di ricerca in: Scienze Biomediche e Biotecnologiche / Oncologia, Ematologia e Patologia / Oncologia e Patologia Sperimentale/Scienze Farmacologiche e Tossicologiche, dello Sviluppo e del Movimento Umano / Scienze Chirurgiche. In particolare, il piano di formazione descritto, si fonda essenzialmente sull apprendimento delle conoscenze e delle metodiche sperimentali necessarie per: Valutare il profilo di espressione dei mirna in modelli cellulari di GIST resistenti al trattamento con BYL719; Valutare il profilo di metilazione in modelli cellulari di GIST resistenti al trattamento con BYL719; Caratterizzare il ruolo di mirna e metilazione nel meccanismo di resistenza al trattamento con BYL719. Integrare i dati di espressione di mirna e di metilazione globale definendo una signature di resistenza al trattamento con BYL719. Sulla base delle conoscenze acquisite, il destinatario dell assegno dovrà poi impegnarsi a

5 sviluppare ricerche volte a definire i meccanismi di resistenza al trattamento farmacologico in modelli GIST. In particolare, i risultati concorreranno ad acquisire informazioni fondamentali per definire i meccanismi di resistenza al trattamento con inibitori del pathway PI3K/AKT/PTEN/mTOR.