Lauriola M., DIMES, Unibo Contributo Fondazione Carisbo 2018

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1 Il blocco del recettore IL1R1 migliora la risposta agli anticorpi monoclonali anti EGFR Valerio Gelfo 1,2, Gabriele D Uva 4, Yosef Yarden 3, Andrea Ardizzoni 1 and Mattia Lauriola, 1,2 1 Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale, Unità di Istologia, Embriologia e Biologa Applicata, Università di Bologna. 2 Center for Applied Biomedical Research (CRBA) S. Orsola-Malpighi University Hospital, University of Bologna, Bologna, Italy 3 Department of Biological Regulation, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel 4 Vascular Biology and Angiogenesis Lab, Fondazione MultiMedica Onlus, IRCCS MultiMedica - Scientific and Technological Pole Progetto di ricerca: Il carcinoma del colon-retto è il terzo tumore per incidenza nel mondo. È altamente dipendente dall attivazione dell EGFR e più in generale dei recettori della famiglia ERBB, responsabili del controllo di una rete di segnalazione, che regola meccanismi chiave quali la proliferazione, la sopravvivenza, l apoptosi e l invasività. EGFR è il bersaglio dell anticorpo monoclonale cetuximab, la principale terapia somministrata ai pazienti con cancro del colon-retto (CRC) metastatico RAS wild type, prevalentemente in combinazione con la chemioterapia. Il limite primario di tale terapia è rappresentato dall acquisizione di resistenza dopo pochi mesi dalla prima esposizione al farmaco. Lo scopo della nostra ricerca è di indagare a livello cellulare e molecolare quali sono i meccanismi implicati nell insorgenza della resistenza al cetuximab. Fin ora lo studio si è svolto selezionando un clone di cellule di cancro del colon; Caco-2 resistente al cetuximab (CXR) ed eseguendo su tale clone e sulle parentali saggi di proliferazione e trasformazione in adesione (2D) e di crescita in sospensione (3D), sottoponendo le cellule a trattamenti multipli Fig1 A, B.

2 Figura 1 Saggio di trasformazione e saggio di proliferazione sulle Caco-2 P, CXR e GBR A. Il grafico rappresenta l andamento della proliferazione delle P, CXR e GBR dopo 72 ore di trattamento con cetuximab a differenti concentrazioni (0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml, 1 µg/ml, 5 µg/ml) in terreno all 1% di FBS. Per ogni concentrazione è rappresentata la media del valore di proliferazione ± l SEM. FM: full medium; CX: ; GB: gefitinib. B. Nell immagine a sinistra si osserva la copertura del pozzetto da parte delle cellule parentali (P), -resistenti (CXR) e gefitinib-resistenti (GBR) nelle condizioni di terreno all 1% di FBS, cetuximab 1µg/ml e Gefitinib 1uM. Il grafico a destra rappresenta la quantificazione effettuata con Image J della piastra precedente. I risultati ottenuti mostrano l acquisizione da parte delle CXR della resistenza anche all inibitore dell attività tirosino-chinasica gefitinib, suggerendo che la resistenza al cetuximab non derivi da mutazioni nel dominio di legame dell anticorpo con il recettore. Inoltre, le CXR appaiono maggiormente trasformate e più inclini alla transizione epiteliomesenchima e al mantenimento di condizioni di staminalità, responsabili principalmente della capacità di crescita in 3D, come mostrato nella Fig. 2.

3 Figura 2 Saggio di crescita in sospensione sulle Caco-2 P E CXR A. Immagine fotografica al microscopio (ingrandimento 4x) degli sferoidi formati dalle P e dalle CXR in assenza di farmaco e in presenza di cetuximab 1µg/ml e gefitinib 1µM. B. Il grafico rappresenta l andamento del volume dei singoli sferoidi di P e CXR e la media del volume degli sferoidi per singolo trattamento ± l SEM. La significatività statistica è stata calcolata con l analisi 1-way anova. C. Il grafico rappresenta l andamento della media del numero degli sferoidi nelle P

4 e nelle CXR nei tre trattamenti ± l E.S. La significatività statistica è stata calcolata con il test 2- way anova. CX: cetuximab; GB: gefitinib; CTRL: controllo in assenza di farmaco. ** p<0,01; ****p<0,0001. D, E. Immagini ad ingrandimento 4x e 10x di sezioni di sferoidi formati dalle cellule P e CXR. F. Microscopia confocale degli sferoidi Caco-2 Parentali e CXR, con colorazione con DAPI/Blue (nuclei) e Falloidina Triziata/Rosso (actina). G. Schema riferito alle diverse possibili strutture di sferoidi riscontrabili rispettivamente in cellule con corretta polarizzazione, cellule con difetti di polarizzazione del fuso mitotico, cellule con alterazioni nel meccanismo di formazione della lamina basale. Infine, il modello elaborato a partire dai risultati ottenuti in vitro è stato validato attraverso l analisi di dati clinici riferiti a xenopazienti sottoposti a terapia con cetuximab, ottenuti grazie ad una collaborazione con il Prof. Trusolino di Candiolo, Università di Torino. I dati clinici hanno evidenziato nei pazienti resistenti al cetuximab, un aumentata espressione delle citochine IL-1A, IL-1B e IL-8, la cui produzione autocrina è responsabile della sopravvivenza tumorale e della mancata risposta alle terapie anti EGFR Fig.3.

5 Figura 3: Espressione delle citochine IL1 A, IL 1 B e IL8 in xenopazienti trattati con cetuximab e aventi livelli di risposta differenti A. Il grafico rappresenta la distribuzione dei livelli di risposta negli xenopazienti trattati con cetuximab per tre settimane. Per ogni xenopaziente è riportato il volume della massa tumorale al termine della terapia espresso in percentuale rispetto al volume della massa inoculata. Le tre aree colorate si riferiscono alle differenti categorie di risposta, come riportato nella legenda. B Il grafico rappresenta l andamento dei livelli di espressione di IL 1 A, IL 1 B e IL 8 negli xenopazienti al termine del trattamento con cetuximab per tre settimane. Sono riportati i valori dei singoli xenopazienti e la media relativa all espressione di ognuna delle tre citochine. Gli xenopazienti sono stati raggruppati secondo le differenti categorie di risposta, come riportato nella legenda. OR: regressione; riduzione del volume della massa di almeno il 50% SD: malattia stabile; riduzione del volume della massa fino al 50% e aumento fino al 35% PD: progressione; aumento del volume della massa superiore al 35%

6 Secondariamente abbiamo dimostrato che anche il recettore per le citochine identificate, IL-1R1 risulta sovraespresso in pazienti esposti al trattamento con cetuximab. In particolare, pazienti che non rispondono al trattamento presentano una maggiore quantità di recettore per IL-1R1, come riportato in Fig.4. Figura 4: Espressione del recettore in pazienti trattati con cetuximab e aventi livelli di risposta differenti. Il grafico riporta i livelli di espressione del recettore per IL-1A e IL-1B in pazienti trattati con cetuximab, che hanno risposto in modo differente alla terapia. In particolare OR: rappresenta i pazienti con malattia in progressione, SD: pazienti con malattia stabile e PD: pazienti con malattia in progressione. Infine, abbiamo valutato la sopravvivenza in un dataset di quasi 1200 tumori primari di pazienti con CRC. Abbiamo visto che alti livelli di IL1R1 risultano associati ad una peggiore sopravvivenza, mentre pazienti con una bassa espressione di questo recettore presentano in generale un andamento migliore, come riportato in Fig.5.

7 Figura 5: Il recettore per IL-1 è predittivo di sopravvivenza in pazienti con CRC. La Kaplan Meyer riporta i livelli di espressione del recettore per IL-1A e IL-1B in tumori primari di pazienti con cancro del colon retto. In particolare la linea rosso rappresenta pazienti con alti livelli di IL-1R1 mentre la linea nera, pazienti con bassi livelli di questo recettore. I pazienti con alti livelli, presentano una minore sopravvivenza nel tempo. Tutti questi dati ci hanno portato ad ipotizzare il modello riportato nelle Figura 6, che illustra l ipotesi alla base di questo proposal. Nel dettaglio, secondo la nostra linea di ricerca, l inibizione di IL1R1 mediante specifici anticorpi, tra cui per esempio il canakinumab, in combinazione con il cetuximab, potrebbe rappresentare una strategia di trattamento efficace, nei tumori del colon-retto, sensibili e resistenti alla terapia con cetuximab.

8 Figura 6: Modello di studio. Rappresentazione schematica che mostra il nuovo meccanismo di resistenza al cetuximab nel cancro del colon-retto, che si basa su una produzione autocrina da parte del tessuto tumorale di un pannello di citochine infiammatorie, tra cui IL1A, Il1B e IL8. In presenza di farmaci anti EGFR, alcuni tumori presentano una plasticità si segnalazioni cellulari responsabili di un fenotipo meno differenziato e conseguente attivazione del signaling di NF-kB.

9 FASI E MODALITA di REALIZZAZIONE DEL PROGETTO Nell ambito del progetto presentato ci occuperemo di approfondire il ruolo della via IL1R1 nella risposta al cetuximab. Il progetto si svilupperà in 4 fasi distinte: Fase 1: Realizzazione del modello cellulare di inibizione delle citochine proinfiammatorie mediante silenziamento genico. Verrà sfruttata la moderna tecnologia del CRISPR/CAS9 per creare un modello KO per il recettore IL1R1. L avvenuto silenziamento sarà valutato mediante "surveyor assay" e validato mediante analisi in western blot. Il silenziamento verrà effettuato sia su cellule sensibili che resistenti al cetuximab, già sviluppate e caratterizzate nel nostro laboratorio. Fase 2: Caratterizzazione mediante saggi di proliferazione e migrazione dei modelli cellulari sviluppati. In questa fase ci occuperemo di caratterizzare da un punto di vista funzionale i sistemi cellulari creati nella fase 1. Saggi di proliferazione sia in monostrato che in matrigel in 3D, e migrazione cellulare in transwell, verranno applicati per studiare il ruolo del KO di IL1R1, nei meccanismi di proliferazione del tumore primario e metastatizzazione. Fase 3: Comparazione del modello di silenziamento con inibitori di NF-KB e STAT3, capaci di inibire le stesse vie proinfiammatorie. I modelli cellulari silenziati, verranno comparati ai trattamenti con inibitori di NF-KB e STAT3. Verranno quindi analizzate le vie di segnalazione a valle dell EGFR, tra cui la via delle MAPK e AKT, in presenza degli inibitori e di stimolazioni con citochine infiammatorie (IL-1A, IL-1B e IL-8). Fase 4: Trattamento di modelli murini, inoculati con tumori resistenti al cetuximab, in seguito a silenziamento di IL1R1. Infine, i modelli cellulari sviluppati e caratterizzati in vitro, su IL1R1 wild type e KO, verranno inoculati in topi immunocompromessi e le caratteristiche del tumore verranno seguite nel tempo, in seguito al trattamento con cetuximab da solo e in combinazione con anticorpi anti IL1B.