INGEGNERIA GENETICA NELLE PIANTE

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1 INGEGNERIA GENETICA NELLE PIANTE L inserzione di uno o più geni nel corredo genetico di una pianta con metodiche di ingegneria genetica e di coltura in vitro di cellule e tessuti vegetali porta alla produzione di piante geneticamente modificate (GM), dette anche geneticamente ingegnerizzate, transgeniche o biotecnologiche. Il gene inserito può provenire dalla stessa specie o da specie affini (e in questo caso si può parlare di cisgene), ma può anche avere l origine più diversa (transgene) poiché, in base alla natura universale del codice genetico, anche geni provenienti da organismi evolutivamente molto lontani dai vegetali possono essere espressi con successo in una pianta. Le prime piante transgeniche sono state prodotte all inizio degli anni 80 del secolo scorso, suscitando un vivissimo interesse non solo nell accademia, ma anche nell industria.

2 Le piante GM Inserzione di uno o più geni nel genoma di una pianta mediante: 1. ingegneria genetica 2. coltura in vitro di cellule e tessuti Pomodori transgenici con un elevato contenuto di antociani.

3 Le piante GM Cellule somatiche totipotenti Trasformazione cellula somatica Totipotenza Rigenerazione in vitro Callogenesi Caulogenesi Rizogenesi

4 Cis-gene Trans-gene Il gene inserito proviene dalla stessa specie o da specie affini Il gene inserito proviene da specie filogeneticamente lontane La distinzione tra cis- e trans-gene è recente e volta a rendere più accettabile all opinione pubblica, e al legislatore, la produzione di nuove varietà biotecnologiche MA NON HA SENSO BIOLOGICO VISTA L UNIVERSALITÀ DEL CODICE GENETICO!

5 Le prime piante transgeniche sono state prodotte all inizio degli anni 80 INTERESSE INDUSTRIA RICERCA In campo agronomico In campo farmaceutico Analisi di modelli transgenici, per indagare il ruolo di singoli geni e le loro interazioni con altri geni

6 Il successo della nuova tecnologia fu tale che nell arco di pochi anni si arrivò alla commercializzazione dei primi prodotti, il pomodoro Flavr Savr nel 1994, e il mais Bt nel Nel 2015, 18 milioni di aziende coltivano piante transgeniche su una superficie di 180 milioni di ettari, in 29 paesi (USA, Brasile, Argentina, India, Canada). In Europa: Spagna, Germania, Romania, Repubblica Ceca. Le specie OGM oggi autorizzate alla coltivazione sono 30. Le principali sono: soia, mais, cotone, colza, riso, canna da zucchero, papaia, pomodoro, tabacco. Nel settore ornamentale ad esempio per ottenere la variegatura dei fiori di petunia. Oggi lo studio della biologia vegetale si basa ampiamente sull analisi di modelli transgenici, appositamente preparati nei laboratori di tutto il mondo, per scoprire il ruolo di singoli geni e delle loro interazioni con il resto del genoma. Esistono protocolli di trasformazione, che sono costantemente ottimizzati, per un numero di specie in continuo aumento.

7 La produzione di piante GM prevede 3 fasi: 1) preparazione di un COSTRUTTO contenente il gene di interesse in un vettore adatto ad assicurarne l espressione nella cellula vegetale; 2) un sistema per INTRODURRE IL COSTRUTTO nella cellula vegetale; 3) un sistema di RIGENERAZIONE che consenta di ottenere una pianta GM dalla cellula trasformata.

8 Tutti e tre i genomi della cellula vegetale possono essere trasformati tuttavia, nella quasi totalità dei casi il gene viene inserito nel genoma nucleare!

9 La trasformazione della cellula vegetale può essere sia stabile che transiente Trasformazione stabile Trasformazione transiente Piante GM Il transgene si integra nel genoma ospite e: - È espresso come un gene endogeno - È repilcato in mitosi - È ereditato dalle piante figlie Singole cellule trasformate Il gene è introdotto nelle cellule ma non inserito nel genoma - È espresso - Non è replicato per mitosi - Non è ereditato dalle piante figlie

10 L inserzione del transgene nel genoma nucleare avviene mediante ricombinazione illegittima Impossibilità di prevedere il sito di inserzione del transgene Diversi livelli di trascrizione a seconda della regione del genoma in cui il transgene si è inserito Necessità di ottenere numerose piante GM per selezionare quella con i livelli di trascrizione desiderati

11 Metodi di trasformazione Biologici Chimico-fisici Uso di: 1) batteri 2) virus Uso di: 1) scariche elettriche 2) trattamenti chimici 3) nanoproietili

12 Trasformazione di protoplasti mediata da polietilenglicole (PEG) Il PEG induce la fusione di vescicole di membrana plasmatica DNA in liposomi Protoplasto DNA nudo Dai protoplasti trasformati è possibile rigenerare una pianta GM

13 Trasformazione di protoplasti mediata da polietilenglicole (PEG) I maggiori limiti sono: - Bassa efficienza di trasformazione - Necessità di rigenerare la pianta da singoli protoplasti Usata principalmente per la trasformazione transiente di protoplasti

14 Elettroporazione Scariche elettriche brevi e di alta intensità permeabilizzano reversibilmente la membrana plasmatica, causando la formazione transiente di pori

15 Elettroporazione Il DNA presente nella miscela di elettroporazione può entrare nella cellula La parete riduce la frequenza di trasformazione, per cui è usata soprattutto per la trasformazione transiente di protoplasti

16 Vigorosa agitazione delle colture cellulari in presenza di fibre, o baffi di carburo di silicio

17 Vigorosa agitazione delle colture cellulari in presenza di fibre, o baffi di carburo di silicio Tecnica, usata con successo soprattutto con monocotiledoni Semplice da attuare, consente di ottenere alte rese di trasformazione Pone il problema della tossicità del carburo di silicio

18 Tecnica biolistica Gene gun = Cannone genico Biolistica = biologia + balistica Micoproiettili di orotungsteno

19 Tecnica biolistica Il nome di tecnica biolistica deriva dalla fusione di balistica biologica (in inglese biological ballistic da cui biolistic) e riassume il principio alla base della tecnica, che consiste nello sparare dei microproiettili di un supporto inerte, ricoperti di una biomolecola, di solito DNA, all interno della cellula. La tecnica è stata sviluppata negli anni 80 per ovviare alla recalcitranza delle monocotiledoni alla trasformazione con Agrobacterium. Lo strumento per il bombardamento di microproiettili (microprojectile bombardment) consiste in un meccanismo per accelerare a velocità desiderate i microproiettili così da regolare la loro capacità di penetrazione all interno del tessuto bersaglio. La forza che accelera il macroproiettile (un leggero disco di acetato di cellulosa di circa 2,5 cm di diametro) è una scarica del gas inerte elio, da cui il nome Biolistics PDS-1000He dello strumento. Le velocità dei microtrasportatori (supersoniche, fino a 400 m s-1), particelle di diametro minuscolo (0,8-1 μm) di metalli inerti come oro, iridio o tungsteno, dipendono dalla capacità di accelerare il macrotrasportatore.

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21 Manipolazione genetica del polline Con il termine manipolazione genetica del polline si intende l inserimento di geni nel genoma naturale del granulo pollinico o la modificazione di geni presistenti. L introduzione diretta di DNA nel polline può essere effettuata mediante il bombardamento con microproiettili. I microproiettili penetrano nelle cellule veicolando il materiale genetico senza compromettere in modo irreversibile l integrità delle cellule stesse in quanto le lesioni prodotte sono temporanee.

22 Agrobacterium tumefaciens un ingegnere genetico naturale Gram-negativo affine a Rhizobium (famiglia Rhizobiaceae) Fitopatogeno delle dicotiledoni Causa il tumore del colletto È in grado di trasferire alla cellula vegetale alcuni dei suoi geni che vengono integrati nel genoma vegetale e inducono la formazione della massa tumorale detta galla, habitat ideale per la proliferazione del batterio

23 Agrobacterium tumefaciens un ingegnere genetico naturale T-DNA (Transfer-DNA) kb Tumore del colletto (galla) Plasmide Ti (Tumor-inducing) 200 e le 800 kb

24 Regioni terminali (25 bp) = Lb a Rb Opine = biosintesi aminoacidi Auxine e Citochinine = oncogeni T-DNA Geni Vir = coinvolti nella percezione, infezione e integrazione del T-DNA

25 Agrobacterium tumefaciens Infezione in natura Quando una pianta subisce una ferita le cellule rilasciano composti fenolici di difesa che diffondono nel suolo Acetosiringone Alcuni di questi fenoli sono percepiti dagli agrobatteri che si muovono verso la fonte di emissione della sostanza (chemiotassi) Vir A-Vir G Chemiotassi Fenoli di difesa

26 Agrobacterium tumefaciens Infezione in natura Quando l agrobatterio è a contatto con la cellula vegetale emette un pilo di infezione e trasferisce il T-DNA con un meccanismo simile alla coniugazione

27 Agrobacterium tumefaciens Infezione in natura Nel nucleo il T-DNA si integra nel genoma nucleare e i suoi geni vengono espressi come se fossero geni endogeni Viene indotta la formazione della galla (oncogeni) e la biosintesi di aminoacidi (opine) utilizzabili solo dal batterio

28 Agrobacterium tumefaciens Trasformazione genetica delle piante Mentre Rb e Lb sono essenziali per il trasferimento del T- DNA, paradossalmente il T-DNA stesso non lo è LB DNA estraneo RB Siti di integrazione Qualunque sequenza di DNA inclusa tra i bordi Lb e Rb viene trasferita nelle cellule vegetali dall apparato di trasferimento di Agrobacterium

29 Agrobacterium tumefaciens Infezione in natura La capacità di infettare la cellula vegetale, di trasferire il T-DNA e di integrarlo nel genoma nucleare è legata all espressione dei geni Vir

30 Agrobacterium tumefaciens Trasformazione genetica delle piante

31 Agrobacterium tumefaciens Trasformazione genetica delle piante I plasmidi Ti non sono adatti ad essere usati come vettori di trasferimento, perché: 1) Auxine/Citochine prodotte dal T-DNA impediscono corretta rigenerazione della pianta 2) Produzione di opine non è utile per la pianta (dannosa?) 3) Plasmidi Ti sono troppo grandi ( Kb)

32 Agrobacterium tumefaciens Sistema del vettore binario: DNA da trasferire e geni vir possono trovarsi su plasmidi differenti - Sono mantenuti i bordi Lb ed Rb Vettore binario - Vengono rimossi: 1. i geni vir 2. gli oncogeni (auxine, citochinine) 3. i geni per le opine - tra i bordi L ed R vengono inseriti: 1. i DNA da integrare nel genoma 2. un marcatore di (es. resistenza a kanamicina) Plasmide helper - È inserito un altro plasmide, che contiene i geni vir ma non il T-DNA

33 Agrobacterium tumefaciens Sistema del vettore binario 1) VETTORE BINARIO 2) PLASMIDE HELPER (disarmato) Per amplificare il plasmide in E.Coli Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina geni VIR No geni VIR Aiuta il trasferimento del T-DNA del VETTORE BINARIO

34 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI Alcuni protocolli elaborati hanno permesso l utilizzo di A. tumefaciens anche in mais e riso

35 L EDITING GENETICO E LA TECNICA CRISPR-CAS9: Forbici molecolari per tagliare il DNA in punti precisi