Piante e Genomica ecologica. I meccanismi di difesa delle piante e il potenziale impiego nel miglioramento delle colture agricole

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1 Piante e Genomica ecologica integrazione fra meccanismi molecolari subcellulari e funzioni delle comunità ecologiche Interazioni ecologiche complesse Trascrizione Metabolismo I meccanismi di difesa delle piante e il potenziale impiego nel miglioramento delle colture agricole L interazione pianta-erbivoro produce effetti a diversi livelli 1

2 Le piante sono costantemente soggette ad attacchi Patogeni (batteri e microbi) Insetti ed animali Insetti vs mammiferi erbivori In natura il 99% delle specie erbivore sono insetti Gli insetti consumano il 99% della biomassa vegetale Il 50% degli insetti sono specialisti ovvero attaccano una singola specie vegetale lo 0.1% dei mammiferi erbivori sono specialisti Koala e eucalipto Panda e bambù 2

3 Ordine dei Coleotteri (maggiolini) sono in genere specialisti Ordine dei Ortotteri (cavallette) sono generalisti ovvero attaccano più specie vegetali 3

4 Ordine dei lepidotteri (farfalle e falene) la forma larvale è chiamata in maniera generica bruco Circa il 90% dei lepidotteri sono specialisti Farfalla Monarca Cavolaia maggiore 4

5 Nella interazione piante-lepidotteri il peggior nemico della pianta è uovo bruco crisalide farfalla Interazione piante-lepidotteri: cosa si sa e cosa è stato sfruttato dalle biotecnologie vegetali 5

6 Le piante ferite si difendono In maniera diretta: Difesa biologica Induzione di enzimi in risposta alla ferita indotta dal bruco Difesa chimica: Tossine Deterrenti Metaboliti secondari In maniera indiretta: Emissione di composti volatili VOC Volatile Organic Compounds Attraggono i predatori degli insetti Comunicano con altre piante Interazione tritrofica 6

7 Sistema modello Helicoperva Zea o bruco del mais (corn earworm) Meccanismi di difesa diretta della pianta Induzione di enzimi in seguito a ferita: Inibitori delle proteasi : pin II Polifenolo ossidasi (PPO) (produzione chinoni) Arginasi (idrolizza ARG in ornitina ed urea) Ascorbato ossidasi Estraz. RNA Espressione genica RT-PCR 7

8 Cosa succede quando un bruco mangia una foglia? Ghiandole mandibolari Secerne saliva prodotta dalle ghiandole mista a sostanze rigurgitate (volicitina) che inducono la risposta di difesa Ghiandole labiali Schema sperimentale per studiare i meccanismi di difesa diretta delle piante 8

9 Effetti della saliva sull espressione dell inibitore delle proteasi pin II Le piante ferite si difendono In maniera diretta: Difesa biologica Induzione di enzimi in risposta alla ferita Difesa chimica: Tossine Metaboliti secondari Deterrenti 9

10 Una sostanza può essere tossica per un bruco e fonte di nutrimento per un altro bruco Il bruco della Monarca non si ciba mai delle foglie di cavolo Le farfalle cavolaie sono attratte dalla sinigrina che, per la forma larvale è uno stimolante Altre sostanze tossiche prodotte da varie specie vegetali sono gli Alcaloidi o neurotossine 10

11 I terpeni, sostanze volatili dotate di aroma, sono coinvolti nella difesa chimica diretta e indiretta Esistono varie classi di terpenoidi con funzioni varie e distanti 11

12 Meccanismi di difesa indiretti Emissione di VOC Volatile Organic Compounds Caratteristiche dei VOC: Attraggono i predatori degli insetti Comunicano con altre piante Sono sostanze volatili Sono dotati di aroma Sostanze eterogenee Composti alifatici Composti aromatici Fenoli e Terpeni Una miscela di 150 composti volatili può risultare nel l profumo di un singolo fiore Metodiche per a raccolta e la misurazione dei composti volatili foglie piante Analisi tramite gas cromatografia e MS 12

13 L interazione tritrofica pianta-parassita-parassitoide Le piante si difendono dall attacco degli insetti emettendo sostanze volatili che attirano i nemici naturali degli insetti. Esempio di interazione tritrofica Mais Zea mais Larve di Spodoptera exigua Vespe che parassitano le larve deponendovi sopra le uova (Cotesia marginiventris) 13

14 Protocollo utilizzato: Analisi della produzione di VOC (gene della terpene sintetasi TPS10) Produzione di un OGM (iperespressione di TPS10 in Arabidopsis taliana Analisi comportamentale (risposta di Cotesia marginiventris) 14

15 Gene della terpene sintetasi TPS10 1. Iperespressione in batteri 2. Caratterizzazione dell attività enzimatica 3. Analisi dell espressione in pianta Alti livelli di trascritti si ritrovano nelle foglie di mais danneggiate dagli erbivori Emissione di VOC Piante di mais Le piante sane di solito emettono piccole quantità di Volatiles Organic Compounds (VOC) Schnee et al PNAS 103:

16 Emissione di VOC In seguito ad attacco da erbivori le piante di mais rilasciano sesquiterpeni Schnee et al PNAS 103: I terpeni prodotti dalle piante in seguito ad attacco da erbivori sono quelli prodotti dal gene TPS10 espresso in E. coli piante batteri Gas cromatografia 16

17 Generazione di piante transgeniche: Arabidopsis che esprime TPS10 Orf di tps10 amplificata con primers specifici e clonata tra il promotore CaMV 35S e il terminatore del gene della Nopalina nel vettore binario pbin420 TPS10 Costrutto inserito in Agrobacterium tumefaciens ed usato per trasformare Arabidopsis Linee gm selezionate per la resistenza alla Kanamicina Integrazione del gene confermata con PCR Le piante trasformate con tps10 emettono 2.1 µg/pianta/ora di prodotti del gene 17

18 Raccolta e misura dei composti volatili foglie piante Analisi tramite gas cromatografia e MS Analisi comportamentale: la risposta del parassitoide Cotesia marginiventris Piante di Mais infestate per 15 ore con 20 bruchi di Spodoptera litteralis Arabidopsis transgenica per TPS10 Femmine di C. marginiventris naive e experienced Olfattometro 18

19 Schema di Olfattometro a due braccia Risposta della vespa Cotesia marginiventris a Arabidopsis che emette sesquiterpene Gruppi di sei vespe vengono introdotte nella camera centrale e possono scegliere di entrare in una delle sei braccia - il passaggio viene bloccato da una retina metallica Wild type OGM Olfattometro a sei braccia 19

20 La risposta delle femmine di C. marginiventris experienced sulle piante di Mais infestate con Spodoptera litteralis è indistinguibile dalla risposta delle vespe experienced su Arabidopsis transgenica per TPS10 Il gene terpene sintetasi TPS23 è espresso esclusivamente nelle radici 20

21 Queste scoperte possono essere sfruttate dalle biotecnologie vegetali per il miglioramento delle colture agricole? 21