ORMONI SESSUALI 2 LIVELLO PLASMATICI in LC/MS Codice LC72210 (Diidrotestosterone, Androsterone, Estrone, Testosterone, Estradiolo, Androstenedione)

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1 ORMONI SESSUALI 2 LIVELLO PLASMATICI in LC/MS Codice LC7221 (Diidrotestosterone, Androsterone, Estrone, Testosterone, Estradiolo, Androstenedione) INTRODUZIONE Ormoni e meccanismi dell'azione ormonale Il termine ormone indica una sostanza che, prodotta da una cellula endocrina, cioè a secrezione interna, viene liberata nel circolo sanguigno, provocando risposte funzionali in cellule localizzate a varia distanza dalla sua sede di produzione. Per l'espletamento dell'azione ormonale sono necessari, oltre alla sintesi e alla secrezione, il trasporto nel circolo sanguigno e la destinazione nei tessuti bersaglio dove sono presenti i recettori, strutture specializzate che riconoscono lo stimolo specifico e ne traducono il messaggio. I recettori possono essere sulla membrana della cellula o all'interno di essa; l'ormone che non può attraversare la membrana (per es., un peptide) si lega a recettori localizzati sulla membrana plasmatica, mentre quello che diffonde attraverso la membrana plasmatica all'interno della cellula (steroidi, iodotironine) si lega a recettori intracellulari (in genere situati nel nucleo). Indipendentemente dalla struttura e dal tipo di ormone, i recettori hanno caratteristiche comuni: tutti presentano una regione in grado di riconoscere e legare l'ormone e un'altra deputata alla generazione di un segnale intracellulare che traduce il messaggio ormonale in risposte funzionali della cellula bersaglio; anche le proprietà che regolano il legame dell'ormone (affinità, specificità, saturabilità, capacità di trasduzione, cioè di evocare effetti specifici) sono comuni per tutti i recettori. La comunicazione affidata agli ormoni avviene per la maggior parte attraverso il circolo ematico (azione endocrina), ma, in parte minore, anche mediante altre modalità. Alcuni ormoni agiscono infatti sulle cellule immediatamente circostanti la cellula che li produce (azione paracrina); in altre evenienze, invece, interagiscono con la stessa cellula secretrice (azione autocrina); altri ormoni, infine, vengono prodotti dai neuroni del sistema nervoso (azione neurocrina, che in realtà rappresenta una forma specializzata di azione paracrina). Sono stati identificati più di cinquanta ormoni, le cui caratteristiche funzionali vengono determinate dalla diversa struttura molecolare. In base a questa, essi vengono suddivisi in quattro grandi categorie: proteine e peptidi; steroidi; derivati dagli amminoacidi; derivati dagli acidi grassi polinsaturi. Gli ormoni, interagendo con i recettori localizzati a livello dei tessuti bersaglio, evocano risposte specifiche: regolano le attività enzimatiche, l'espressione genica e la sintesi delle proteine. Classificazione ormoni steroidei Sono liposolubili, diffondono liberamente all'interno della cellula ed esercitano la loro azione dopo essersi legati a recettori localizzati nel nucleo. La loro struttura chimica, che è policiclica, deriva dal colesterolo. Sono suddivisi, in base alla sede di produzione, in steroidi gonadici e surrenalici; vengono inclusi in questa categoria anche la vitamina D e i suoi analoghi. Gli ormoni steroidei prodotti dal surrene e dalle gonadi si dividono in sottogruppi in base al numero di atomi di carbonio del nucleo steroideo: il progesterone, i glucocorticoidi e i mineralcorticoidi derivano per sintesi successive dal pregnano, una sostanza semplice che contiene 21 atomi di carbonio, mentre gli estrogeni provengono dal nucleo dell'estrano che ha 18 atomi di carbonio, e gli androgeni dal nucleo dell'androstano, che contiene 19 atomi di carbonio. La sintesi degli ormoni steroidei segue tappe biosintetiche identiche sia nel surrene sia nell'ovaio o nel testicolo e la differenziazione nelle tre ghiandole endocrine dipende da una diversa distribuzione tessutospecifica degli enzimi di sintesi. La steroidogenesi passa attraverso una serie di tappe enzimatiche, in 1

2 massima parte catalizzate dagli enzimi citocromo P4 (cp4) localizzati all'interno delle cellule, e inizia dalla trasformazione del colesterolo in pregnenolone. Questa tappa enzimatica è la più importante in quanto controlla la sintesi di tutti gli ormoni steroidei; anche in presenza di notevoli quantità di colesterolo, la possibilità di proseguimento della via biosintetica appare limitata, poiché dipende dall'attività dagli enzimi cp4. Il pregnenolone formato fuoriesce dal mitocondrio e viene trasferito sul reticolo endoplasmatico, dove subisce le successive modificazioni enzimatiche da parte dei cp4. Il pregnenolone è quindi il precursore comune dei principali ormoni steroidei. Gli androgeni vengono sintetizzati dalle cellule di Leydig del testicolo, dalla zona reticolare del surrene e dalle cellule della teca del follicolo e dall'interstizio dell'ovaio. La via biosintetica che procede dal pregnenolone segue due possibili direzioni: la prima via consiste nella trasformazione del pregnenolone in 17-idrossipregnenolone, di questo in deidroepiandrosterone, quindi in androstenediolo, e infine in testosterone, che è il principale ormone maschile. La seconda via consiste nella trasformazione del pregnenolone in progesterone, di questo in 17-idrossiprogesterone e quindi nella formazione di androstenedione, a sua volta successivamente trasformato in testosterone. In alcuni tessuti il testosterone necessita di un'ulteriore reazione di trasformazione in α-diidrotestosterone per esplicare la sua attività. Nel surrene dove, rispetto al testicolo, vi è una diversa distribuzione degli enzimi che catalizzano queste vie biosintetiche, la maggior parte della produzione di androgeni surrenali è diretta verso l'elaborazione di precursori del testosterone e, in maniera particolare, di deidroepiandrosterone e androstenedione, che hanno un'attività ormonale di più modesta entità. Circa il % del pregnenolone metabolizzato nella corteccia surrenale viene convertito in deidroepiandrosterone. Gli estrogeni e il progesterone, i principali ormoni femminili, sono gli steroidi prodotti in maggiore quantità dall'ovaio e sono coinvolti nella regolazione del ciclo mestruale e nella gravidanza. La formazione di questi steroidi deriva da tappe enzimatiche diversificate nei compartimenti cellulari dell'ovaio: follicoli e cellule interstiziali. Le cellule della granulosa, che contornano l'ovulo nel contesto del follicolo, subiscono la trasformazione in cellule luteiniche dopo l'ovulazione e il prodotto della trasformazione del pregnenolone è rappresentato dal progesterone. Le cellule della teca del follicolo e quelle interstiziali producono in prevalenza androstenedione attraverso le vie biosintetiche che sono già state descritte per gli androgeni. Anche le tappe enzimatiche coinvolte nel successivo destino metabolico dell'androstenedione hanno una caratteristica localizzazione cellulare: infatti il testosterone è sintetizzato solamente nelle cellule dell'ilo, mentre all'interno delle cellule della granulosa l'androstenedione viene trasformato in testosterone e a sua volta in estrone e estradiolo. Le cellule interstiziali hanno anche la capacità di trasformare il testosterone in diidrotestosterone. 2

3 Al contrario degli ormoni peptidici, la secrezione degli steroidi in circolo non procede attraverso un loro immagazzinamento all'interno delle cellule ma segue immediatamente la sintesi. Essi viaggiano nel plasma legati a proteine di trasporto specifiche, dotate di alta affinità, quali la globulina legante il cortisolo (CBG, Cortisol binding protein), le globuline leganti gli steroidi sessuali (SHBG, Sex hormone binding protein) e la proteina legante la vitamina D (DBP, Vitamin D binding protein). La CBG è una glicoproteina in grado di legare con uguale affinità cortisolo e progesterone. Le SHGB sono globuline che legano con elevata affinità il testosterone, mentre l'estradiolo è legato in prevalenza all'albumina. Il 98% degli steroidi gonadici, il 9% del cortisolo e il % dell'aldosterone circolano legati alle rispettive proteine di trasporto. Poiché solo l'ormone libero è in grado d'interagire con i recettori, e quindi di esprimere l'attività biologica, il legame plasmatico costituisce un'importante fase di riserva nel metabolismo di questi ormoni. Gli steroidi sintetici impiegati in terapia solitamente non contraggono legame con le proteine di trasporto e sono quindi in grado di esercitare effetti biologici immediati. I glucocorticoidi e i mineralcorticoidi vengono metabolizzati attraverso reazioni enzimatiche che determinano la perdita della loro attività ormonale oppure attraverso coniugazione con gruppi chimici che li rendono idrosolubili e ne determinano l'eliminazione con le urine. L'unica reazione metabolica che non si traduce in una perdita dell'attività biologica è rappresentata dalla conversione del testosterone in diidrotestosterone nelle cellule bersaglio. * *Bibliografia Enciclopedia della Scienza e della Tecnica (27) Andreani, Cassano 1977: Andreani, Domenico - Cassano, Cataldo, Trattato italiano di endocrinologia, Roma, SEU, Becker 199: Becker, Kenneth L., Principles and practice of endocrinology and metabolism, 2. ed., Philadelphia, Lippincott, 199 (1. ed.: 199). Faglia 1998: Faglia, Giovanni, Malattie del sistema endocrino e del metabolismo, 2. ed., Milano, McGraw-Hill, 1998 (1. ed.: 1993). Felig 199: Felig, Philip - Baxter, John D. - Frohman, Lawrence A., Endocrinology and metabolism, 3. ed., New York, McGraw-Hill, 199 (1. ed.: 1981). Giusti, Serio 1988: Giusti, Giorgio - Serio, Mario, Endocrinologia, fisiopatologia e clinica, Firenze, USES, Pinchera 1991: Pinchera, Aldo e altri, Endocrinologia e metabolismo. Fisiopatologia e clinica, Milano, Ambrosiana, Williams 1998: Williams, Robert H., Williams textbook of endocrinology, 9. ed., edited by Jean D. Wilson e altri, Philadelphia-London, Saunders, 1998 (1. ed.: 19). 3

4 Schema della via biosintetica PROFILI ORMONI STEROIDEI Gli ormoni steroidei sono stati organizzati e suddivisi in 4 profili in modo da evidenziare a livello surrenalico le quattro vie di biosintesi principali che sfociano nell ormone che determina l effetto finale a livello dei tessuti bersaglio. I profili primari sono i seguenti: 1. Profilo Glucocorticoidi 2. Profilo MineralCorticoidi 3. Profilo Ormoni Sessuali 1 Livello 4. Profilo Ormoni Sessuali 2 Livello In questo modo si riesce a coprire tutte le necessità dell endocrinologia delle ghiandole surrenaliche con un dettaglio che sarebbe stato impensabile fino a poco tempo fa. Il profilo 3 contiene anche due ormoni sessuali di prevalente origine extra-surrenalica: Testosterone ed Estradiolo che possono dare una informazione rapida a seconda dell età e del sesso del soggetto esaminato. 4

5 In un certo qual modo fungono da cartina di tornasole della sintesi centrale degli ormoni sessuali rispetto ad una disfunzione di tipo periferico ossia tissutale che dopo quello gonadico è maggiormente responsabile della sintesi di molecole analoghe. Questo profilo può essere integrato da quello di 2 livello sia maschile che femminile. Il primo sicuramente ha una enorme importanza per tutte quelle manifestazioni che interessano l utilizzo periferico degli ormoni sessuali, specialmente androgeni nelle donne ed estradiolo nel maschio. Disfunzioni a questo livello danno origine a tutta una serie di segni quali, irsutismo, alopecia, acne, seborrea ecc. Un tale profilo avrebbe sicuramente una grande importanza sia per i pediatri, ginecologi, andrologi, ma anche i dermatologi che disporrebbero di uno strumento biochimico in grado di differenziare il tipo di risposta del bulbo pilifero rispetto alla ghiandola sebacea nelle manifestazioni sopracitate. Il Profilo di 2 livello femminile, se portato a livelli di sensibilità adeguate, potrebbe essere utile nel definire il grado di trasformazione del testosterone in estradiolo da parte del tessuto adiposo e rendere conto per esempio della comparsa di ginecomastia nei pazienti maschi affetti da obesità come pure monitorarne la terapia. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 2 33 Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE del 27/1/1998 e del Dl.ivo n.332 del 8/9/2 sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 2 Ormoni sessuali 2 livello plasmatici in LC/MS Novembre 213

6 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: Gli Ormoni sessuali 2 livello vengono deproteinizzati con un opportuno reagente contenente lo standard interno, centrifugati, diluiti e iniettati in LC/MS. Recupero del Metodo : 1% Sensibilità del Metodo (LLOD) : Androstenedione,1 ng/ml Androsterone,3 ng/ml Diidrotestosterone,7 ng/ml Estradiolo,1 ng/ml Estrone, ng/ml Testosterone,1 ng/ml Sensibilità del Metodo (LLOQ) : Androstenedione,3 ng/ml Androsterone,1 ng/ml Diidrotestosterone,2 ng/ml Estradiolo,2 ng/ml Estrone,2 ng/ml Testosterone,3 ng/ml Range di Linearità : Androstenedione,3-1 ng/ml Androsterone,1-1 ng/ml Diidrotestosterone,2-1 ng/ml Estradiolo,2 - ng/ml Estrone,2-2 ng/ml Testosterone,3-1 ng/ml ANALITA Accuratezza intra-giorno Precisione intra-giorno CV% inter-giorno (Errore %) (CV%) (Errore %) Calibratore Calibratore Calibratore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore Androstenedione,3% 4,2% 3,9% 1,2%,%,% 11,%,9%,% Androsterone 12,9% 4,%,1% 1,4%,4% 8,7% 1,7%,7% 9,1% Diidrotestosterone 1,% 7,%,2% 13,9% 8,8% 7,3% 13,9% 8,8% 7,% Estradiolo 11,1%,% 4,8% 12,8%,8%,1% 14,1% 9,%,9% Estrone 2,% 4,% 4,1% 14,4%,8% 4,% 1,%,7%,4% Testosterone 1,%,3% 4,8% 13,% 7,2%,% 1,4% 7,4%,8% ANALITA Concentrazioni utilizzate per calcolare Precisione e Accuratezza Calibratore Inferiore Medio Superiore Androstenedione,1,8 1 Androsterone,2 1, 2 Diidrotestosterone,1 1,2 1 Estradiolo,,4 Estrone,2,1 2 Testosterone,1 1,2 1

7 Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente A Soluzione Deproteinizzante, x ml Reagente B Soluzione Standard Interno, 1 x 2 µl Reagente C Soluzione Diluente, 1 x 3 ml Reagente D1 Calibratore liofilo plasmatico Livello 1, 1 x 1 ml Reagente D2 Calibratore liofilo plasmatico Livello 2, 1 x 1 ml Reagente D3 Calibratore liofilo plasmatico Livello 3, 1 x 1 ml Reagente D4 Calibratore liofilo plasmatico Livello 4, 1 x 1 ml Reagente D Calibratore liofilo plasmatico Livello, 1 x 1 ml Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Reagente M1 Fase Mobile M1, 1 x ml Reagente M2 Fase Mobile M2, 1 x ml Dotazione strumentale minima richiesta : Modalità per il prelievo ematico : Strumento LC-MS triplo quadrupolo medio-alto livello (S/N di almeno 1./1 per 1 pg di Reserpina iniettato) Modalità di lavoro MRM, APCI positivo Evaporatore a centrifuga Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con EDTA come anticoagulante. Centrifugare a 4 rpm per minuti. Separare il plasma e stoccarlo a 2 C. Stabile 4 settimane. 7

8 PROCEDURA ANALITICA IMPORTANTE: NON VANNO USATE PROVETTE O VIALS DI VETRO DURANTE NESSUNO STEP PREPARATIVO. FASE 1 : Ricostituzione del Reagente Deproteinizzante Aggiungere al Reagente A Sol. Deproteinizzante µl di Reagente B Sol. Standard interno (Stabile mesi a - 2 C) FASE 2 : In provette eppendorf dispensare in sequenza. Calibratore Campione Controlli Reagente D1-D 2 µl Calibratore Campione 2 µl Controlli 2 µl Reagente A Soluzione Deproteinizzante (dopo ricostituzione come alla FASE 1) µl µl µl Deproteinizzare direttamente sul vortex per 2 secondi FASE 3 : Centrifugare a 14. giri per 1 minuti. FASE 4 : Prelevare µl di surnatante e portare a secco (stabile 1 mese a 2 C) FASE : Aggiungere µl di Reagente C Soluzione Diluente Vortex per 1 minuto FASE : Centrifugare a 14. giri per 1 minuti. Trasferire tutto il surnatante in vials con insert in polipropilene INIEZIONE : Iniettare 1-2 µl della soluzione nel sistema LC N.B: il campione è stabile 2 giorni a 2-8 C. Release N 2 Ormoni sessuali 2 livello plasmatici in LC/MS Novembre 213 8

9 ORMONI SESSUALI 2 LIVELLO - Avvertenze REAGENTE D1-D2-D3-D4-D : CALIBRATORI LIOFILI Lot. 4 LIVELLO LIVELLO LIVELLO LIVELLO LIVELLO 1 (ng/ml) 2 (ng/ml) 3 (ng/ml) 4 (ng/ml) (ng/ml) DIIDROTESTOSTERONE,8,9 1,2,8 13,9 ANDROSTENEDIONE,,,8 3,9 7, ANDROSTERONE,8 1,2 1,4 7,3 13,3 ESTRONE,1,1,14,8 1,7 ESTRADIOLO,3,3,4 2,2 4,8 TESTOSTERONE,,9 1,2,9 1,4 Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema LC. Aggiungere esattamente 1 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 3 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 3 mesi se conservati a 2-8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e mesi a 2 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : x 1 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova RRHD Eclipse Plus C18 ( x 2,1 mm, 2, um), termostatata a C Disconnettere il detector e far passare una soluzione di Metanolo : Acqua (8 : 2 v/v) al flusso di 3 ul / minuto per 2 minuti. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con una soluzione di Fase Mobile M1 : Fase Mobile 2 ( : v/v) al flusso di 4 ul / minuto per 3 minuti. Effettuare due iniezioni di Acqua di grado HPLC prima di procedere con la serie analitica. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 2 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA Lavare con una soluzione contenente Metanolo : Acqua (8 : 2 v/v) al flusso di 3 ul / minuto per 1 minuti. La colonna va stoccata in una soluzione contenente Metanolo : Acqua (8 : 2 v/v). LAVAGGIO AGO DI INIEZIONE Lavare con una soluzione contenente Metanolo : Acqua (8 : 2 v/v). 9

10 SETTAGGIO DEI FLUSSI GRADIENTE Tempo (min) % M1 (POMPA A) % M2 (POMPA B) Flusso (µl/min) Frammentazioni (ottimizzate su AB SCIEX QTRAP 4) Analita Q1 Q3 ENERGIA DI COLLISIONE Androstenedione Androsterone Diidrotestosterone Estradiolo Estrone Testosterone 273, ,1 2,2 273, ,1 271, , ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE LC7221 Calibratore plasmatico per Ormoni Sessuali 2 livello x 2 x 1 ml LC72317 Controllo plasmatico per Ormoni steroidei Livello 1 x 1 ml LC72318 Controllo plasmatico per Ormoni steroidei Livello 2 x 1 ml LC72319 Controllo plasmatico per Ormoni steroidei Livelli 1 e 2 2 x x 1 ml SK7221 Starter kit Ormoni Sessuali 2 livello 1 Pz Z Colonna analitica RRHD Eclipse Plus C 18 ( x 2.1 mm. 2. um) 1 Pz S297U Vial di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 1 Pz S24722 Riduttori di volume in polipropilene per vials da 2 ml 1 x 1 Pz BIBLIOGRAFIA: 1

11 Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography-thermospray mass spectrometry using stable isotope dilution Hiromi Shibasaki, Takashi Furuta, Yasuji Kasuya Steroid Hormone Analysis by Tandem Mass Spectrometry Steven J. Soldin and Offie P.Soldin Quantification of anabolic hormones and their metabolites in bovine serum and urine by liquid chromatography-tandem mass spectroscophy R. Draisci, L. Palleschi, E. Ferretti, L.Lucentini, P. Cammarata Identification of ten corticosteroids in human hair by liquid chromatography-ionspray mass spectrometry V. Cirimele, P.Kintz, J.P. Goullè, B. Ludes A Confirmatory HPLC-MS/MS Method for Ten Synthetic Corticosteroids in Bovine Urines, JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY S. Rhea Savu, L. Silvestro, A. Haag and F. Sorgel, VOL. 31, (199). Automated solid-phase extraction for concentration and clean-up of female steroid hormones prior to liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. B. Alvarez Sanchez, F. Priego Capote, J. Ruiz Jimenez, M.D. Luque de Castro. An approach to lipidomics, Journal of Chromatography A, 127 (28) 4 4. Detection, quantification and confirmation of anabolic steroids in equine plasma by liquid chromatography and tandem mass spectrometry Fuyu Guan, Cornelius E. Uboh, Lawrence R. Soma, Yi Luo, Jeffery Rudy, Thomas Tobin., Journal of Chromatography B, 829 (2) 8. Liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometric analysis of corticosterone in rat plasma using selected ion monitoring, Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy. Journal of Chromatography B, 77 (21) Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography thermospray mass spectrometry using stable isotope dilution, Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy, Journal of Chromatography B, 92 (1997)

12 ORMONI SESSUALI 2 LIVELLO PLASMATICI ( Cromatogrammi di Riferimento ) Time, i Time, i Fig. 1 : Calibratore Livello 1 Fig. 2 : Calibratore Livello R.T ANDROSTENEDIONE R.T ANDROSTENEDIONE R.T. 3.1 ESTRONE R.T. 3.1 ESTRONE R.T. 3.2 ESTRADIOLO R.T. 3.2 ESTRADIOLO R.T. 3.3 TESTOSTERONE R.T. 3.3 TESTOSTERONE R.T. 4.1 DIIDROTESTOSTERONE R.T. 4.1 DIIDROTESTOSTERONE R.T ANDROSTERONE R.T ANDROSTERONE 12