DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA IDRAULICA, GEOTECNICA ED AMBIENTALE UNIVERSITA DI NAPOLI FEDERICO II

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1 DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA CIVILE E AMBIENTALE UNIVERSITÀ DI CATANIA DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA IDRAULICA, AMBIENTALE, INFRASTRUTTURE VIARIE, RILEVAMENTO POLITECNICO DI MILANO DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA IDRAULICA, GEOTECNICA ED AMBIENTALE UNIVERSITA DI NAPOLI FEDERICO II DIPARTIMENTO DI SANITÀ PUBBLICA UNIVERSITÀ DI FIRENZE DIPARTIMENTO AMBIENTE- SALUTE-SICUREZZA UNIVERSITÀ INSUBRIA DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA, UNIVERSITÀ DI FERRARA DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA CIVILE E AMBIENTALE, UNIVERSITÀ DI PALERMO DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA CHIMICA UNIVERSITA DI NAPOLI FEDERICO II DIPARTIMENTO DI INGEGNERIA CIVILE E AMBIENTALE, UNIVERSITÀ DI FIRENZE Workshop Salvaguardia dei corpi idrici dalla contaminazione da composti xenobiotici: nuovi strumenti per l'analisi, il controllo ed il trattamento nelle acque reflue civili ed industriali Sala Abete, ECOMONDO, Rimini 4 Novembre 2010

2 Metodologie di arricchimento microbico per la degradazione di sostanze recalcitranti E.*, Porfido A.*, Cincinelli A.**, Martellini T.**, Capei R*., Lorini C.* *Dip. Sanità Pubblica-Univ. di Firenze, V.le Morgagni Firenze **Dip. Chimica-Univ. di Firenze via della Lastruccia, Sesto Fiorentino (FI) eudes.lanciottinifi.it

3 METODOLOGIE DI ARRICCHIMENTO MICROBICO PER LA DEGRADAZIONE DI SOSTANZE RECALCITRANTI E., A. Porfido, A. Cincinelli, T. Martellini, R. Capei., C. Lorini Università degli Studi di Firenze - Dip. di Sanità Pubblica e Dip.di Chimica Sommario. Due gli obiettivi della ricerca: (1) valutare la capacità biodegradativa microbica dei ritardanti di fiamma polibromodifeileteri (PBDE) nelle acque reflue di impianti di depurazione misti toscani e lombardi; (2) valutare la biodegradazione microbica di idrocarburi petrolchimici. Sono stati determinati i principali congeneri PBDE nelle acque reflue che si ottengono dalla biodegradazione del deca-bde (209, in commercio). Su impianto da banco è stato effettuato un arricchimento microbico del fango attivo con due ceppi batterici (Burkholderia xenovorans e Rhodococcus jostii) per valutare le loro potenzialità biodegradative sui PBDE. I risultati dei due esperimenti (PBDE in impianti sul campo, PBDE in impianto da banco, ingressi vs uscite impianti) evidenziano una marcata capacità biodegradativa da parte sia delle ricche microflore presenti nei fanghi attivi sia dei ceppi B. xenovorans e R. jostii aggiunti ai fanghi attivi. E stata testata la biodegradazione di composti idrocarburici di origine petrolchimica, provenienti da acque marine del Golfo di Gela ad elevata salinità, e la biorigenerazione di carboni attivi granulari (GAC) saturi di composti petrolchimici, da parte di consorzi batterici indigeni e/o di singoli ceppi batterici (batterio alofilo aerobio Alcanivorax borkumensis). Tali esperimenti sono stati condotti incubando le brodocolture in termostato a 28 C, al buio e ossigenando mediante diffusori d aria. I risultati dei test biodegradativi sono riportati nella relazione del prof. Mancini dell Università di Catania. Il progetto di ricerca nazionale finanziato dal MIUR (PRIN 2007) è stato articolato su base locale (unità di ricerca Università di Firenze) in due parti distinte con diversi obiettivi: Parte 1: ATTIVITA' 6 DEL PROGETTO NAZIONALE "Utilizzo di specie microbiche opportunamente selezionate per la degradazione di composti xenobiotici". Tale attività si è posta l'obiettivo di analizzare il grado di bioconversione e biodegradazione microbica nelle acque reflue di xenobiotici interferenti endocrini ampiamente dispersi nelle matrici ambientali quali sono gli ignifughi, fra i quali i diffusi difenileteri polibromurati (PBDE), e di individuare ceppi batterici eterotrofi aerobi in grado di attaccare tali diffusi contaminanti.

4 Parte 2: ATTIVITA' 3 DEL PROGETTO NAZIONALE "Studi in batch di biodegradazione dei composti xenobiotici". Tale attività di ricerca ha avuto lo scopo di condurre uno studio, in collaborazione con l'unità di ricerca di Catania, sulla biodegradazione di composti idrocarburici di origine petrolchimica provenienti da acque marine ad elevata salinità e sulla biorigenerazione di carboni attivi granulari (GAC) saturi di composti petrolchimici, da parte di consorzi batterici indigeni o di singoli ceppi batterici da collezione. INTRODUZIONE Scarse risultano ancora le conoscenze sulle microflore in grado di bioconvertire e biodegradare gran parte degli xenobiotici sia in natura che negli impianti di depurazione dei reflui, in particolare le molecole persistenti e che bioaccumulano come risultano i prodotti petrolchimici e i ritardanti di fiamma PBDE. In questi ultimi anni ha destato molto interesse la possibilità di utilizzare i processi biologici per la riduzione del tenore di composti xenobiotici nelle acque (Beltran et al., 2000; Alvares et al., 2001; Kreuzinger et al., 2004; Jones et al., 2007), sia per gli evidenti vantaggi economici, sia per limitare la formazione di sottoprodotti che può caratterizzare i processi chimici (Gottschalk et al., 2000). Tuttavia pochi studi hanno riguardato la possibilità di condizionamento dello sviluppo della massa microbica nelle unità di trattamento biologico convenzionali degli impianti di depurazione, ottenuto aggiungendo, all interno di reattori sia aerobici che anaerobici, ceppi microbici isolati o di riferimento, prodotti in colture pure, alla popolazione microbica mista già presente (Ro et al., 2003; Aggelis et al., 2003; Dhouib et al., 2006). Alcuni di questi studi hanno esaminato i vantaggi di incentivare i trattamenti biologici mediante l'adsorbimento su carboni attivi. La parziale biorigenerazione dei carboni attivi si verifica durante il processo basato sui carboni arricchiti con popolazione biologica (BAC)(Ozgur, 2007). Due le ipotesi sul meccanismo di tale biorigenerazione: 1) la degradazione della sostanza adsorbita per effetto di enzimi extra-cellulari (Rodman, 1973); 2) una aliquota della rigenerazione dei carboni attivi è dovuta allo sviluppo del processo biologico sulla superficie in combinazione con il processo di adsorbimento, desorbimento e diffusione nei pori (Andrews and Tien, 1981).

5 PARTE 1 A) Difenileteri polibromurati (PBDE): xenobiotici emergenti possibili interferenti endocrini persistenti. I ritardanti di fiamma bromurati (BFR, Brominated Flame Retardant), fra cui prevalgono i PBDE (PolyBromoDiphenyl Ethers) e i TBBPA (tetrabromobisphenol A) e HBCD (hexabromocyclododecane), rappresentano un esempio tipico di xenobiotici che costituiscono un elevato rischio per la salute oltre che rappresentare un problema ecologico..tali sostanze ignifughe di sintesi sono persistenti nell ambiente e nel bioma e risultano molto diffuse nei comparti ambientali e negli ambienti antropizzati di gran parte dei paesi sviluppati. I rtitardanti di fiamma sono consentiti da gran parte dei Paesi in ossequio alle norme di sicurezza anti-incendio. Queste sostanze presentano indubbi vantaggi: ritardano e/o incrementano la resistenza all incendiabilità di numerosissimi prodotti commerciali di uso comune come plastiche dure, materiale elettrico e per elettronica (es. monitor), tessuti (per letti, sedili di auto ed aerei, vestiario, ecc.), mobili, prodotti schiumogeni in poliuretano, ecc. I PBDE costituiscono una famiglia di circa 209 singoli prodotti chimici (congeneri) diversi a seconda del numero e posizione degli atomi di bromo posizionati su due anelli aromatici di fenile del difeniletere. Tali sostanze sono aggiunte a un ampia varietà di prodotti commerciali (plastiche, poliuretano espanso e tessuti, materiale elettrico ed elettronico) per incrementare la loro resistenza al fuoco. Sono stati sintetizzati tre principali prodotti commerciali PBDE in forma di miscele: pentabromodifenile ossido o etere (penta-bde), octabromodifenile ossido o etere (octa-bde) e decabromodifenile ossido o etere (deca-bde). Ciascuna formulazione commerciale di norma contiene solo un limitato numero di congeneri dei possibili 209 distinti isomeri di PBDE sintetizzabili. Tuttavia è la miscela deca-bde che copre circa l 80% dell uso mondiale di questi prodotti. Stime recenti indicano in le tonnellate di tutti i ritardanti di fiamma prodotti annualmente, di cui sono bromurati (BDE). I maggiori congeneri PBDE (da deca a tetra) sono riportati in tabella 1 (FAO/WHO 2005). La tossicità di queste molecole è inversamente proporzionale al numero degli atomi di bromo presenti: le molecole tetra- e penta-bde a più bassa bromurazione risultano quindi le più tossiche.

6 PBDE Miscela Composizione congenere (% del totale) Penta 24-38% tetrabde, 50-60% pentabde, 4-8% esabde Octa 10-12% esabde, 44% eptabde, 31-35% octabde, 10-11% nonabde, <1% decabde Deca <3% nonabde, 97-98% decabde Singoli congeneri Altra denominazione BDE-47 2,2.4,4 -tetrabde BDE-99 2,2.4,4,5-pentaBDE BDE-153 2,2.4,4,5,5 -esabde BDE-209 2, ,4,5,5,6,6 -decabde Tabella 1. Composizione dei principali prodotti commerciali PBDE (fonte FAO/WHO 2005) Metodiche analitiche. La gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC/HRMS) è il metodo elettivo per la determinazione dei congeneri PBDE presenti spesso in tracce nei campioni ambientali, negli alimenti e nei tessuti umani e animali. Il limite di rilevabilità per i congeneri tetra- e penta-bde ha un range che varia da 0,005 a 0,05 ng/g (ppb), in quanto dipende dal contenuto di lipidi e dalla dimensione del campione. Diffusione ambientale dei PBDE. Fra i ritardanti di fiamma i PBDE risultano le molecole maggiormente impiegate e diffuse nell ambiente naturale e antropico. Dalla loro introduzione, anni 70, il Pianeta ne è ormai diventato saturo; diversi studi riportano la presenza dei PBDE negli ecosistemi marini di tutto il mondo, anche in regioni remote della Terra. I ricercatori li hanno rinvenuti ovunque: nei tessuti tessuti adiposi e nel fegato di Cetacei spiaggiati su arenili del Mediterraneo, negli orsi polari dell Artico, nei cormorani in Inghilterra, nelle orche del Pacifico. Sono state accertate tracce di PBDE nel fegato di merluzzo e nelle aringhe del mare del Nord e nelle anguille di acqua dolce in Olanda (4,6 µg/kg lipidi di BDE-47, BDE-99, BDE-100), nel pesce del mare di Dover (8,4-100 µg/kg lipidi di BDE-47) (Law et al. 2006). Monitoraggi ambientali hanno

7 evidenziato che tali molecole possono essere biomagnificate ai livelli più alti della catena alimentare, sollevando quindi preoccupazioni di ordine sanitario (sia umano che veterinario). In Svezia, in campioni di latte umano risalenti agli anni 70 non si rilevavano tracce di PBDE, mentre in campioni di latte materno del 1997 il contenuto medio in PBDE era di 4 parti per miliardo (ppb); nel 2004 i livelli di PBDE nel latte materno delle donne USA era volte superiore a quello delle donne europee. (de Wit 2002; Law et al. 2006; Schecter et al. 2004). La diffusione di tali sostanze è ormai ubiquitaria: in una comune casa di civile abitazione i PBDE sono presenti in bagno e camera da letto (in materassi e cuscini di gommapiuma, tappeti e imbottiture, cuscini di poltrone, asciugacapelli, telefoni), nel soggiorno [cuscini per divani, sedie e poltrone, apparecchi elettronici (computer, televisori), tappeti e imbottiture, giochi elettronici, cucce e lettiere per animali d affezione], in cucina e sala da pranzo (nei frullatori, forni a microonde, tostapane), negli esterni (televisori, stereo) (National Geographic 2006; de Wit 2002; Law et al. 2006; Schecter et al. 2004). Alimenti e PBDE. I PBDE assunti giornalmente con gli alimenti sono rilevanti, molteplici studi condotti in USA, Canada, Giappone e alcuni Paesi europei stimano che la media dell assorbimento (intake) oscilli fra 13 e 113 ng/die. Il maggior contributo all intake totale nei Paesi europei, in Giappone, Africa, America Latina e Asia è dato dal pesce, dai crostacei e dai molluschi, mentre in Canada e USA dalle carni bovine, dal pollame e dai loro derivati. Le medie stimate dell intake dei PBDE nelle regioni Nord Europa e Nord America sono rispettivamente 2,2 e 3,6 ng/kg di peso corporeo/die. L intake stimato per l Africa, l America Latina e l Asia è di rispettivamente 1,5, 2,1 e 1,2 ng/kg di peso corporeo/die (FAO/WHO 2005). In Italia, l analisi di tessuto muscolare ed epatico di pesce spada effettuata nel 2005 ha individuato la presenza di 19 congeneri PBDE in concentrazioni che variavano nel fegato tra 189 e pg/g p.f. e nel muscolo tra <0,04 e 1882 pg/g p.f. (rapporto WWF 2006). Aspetti tossicologici dei PBDE. Risalgono ormai agli anni 90 i primi allarmi sui possibili effetti tossici dei PBDE ampiamente usati come ritardanti di fiamma. L accumulo nell organismo umano (body burden) sta rapidamente aumentando, con una crescita esponenziale nelle persone e negli animali: i livelli raddoppiano ogni tre-cinque anni (FAO/WHO, 2005). Tossicocinetica dei PBDE. La forma prevalente di esposizione umana a tali sostanze è per via inalatoria (per esempio con le polveri delle abitazioni) e per contatto, mentre risulta minoritario l assorbimento per ingestione di alimenti contaminati dai diffusi decabde. I PBDE si

8 staccano dalla plastica e dai tessuti resi ignifughi sotto forma di particelle di polvere o di gas che aderisce alla polvere, per cui i bambini e gli adulti inalano la polvere contaminata e in tale forma di esposizione inalatoria i bambini che camminano carponi assumono dosi elevate [circa 650 ppb nei bimbi di 18 mesi, quasi la metà (390 ppb) nei bimbi di 5 anni]. Recentemente risultano evidenze (Zota et al. 2008, FAO/WHO 2005) che elevate concentrazioni di PBDE nelle polveri domestiche sono associate con concentrazioni sieriche di PBDE a seguito di processi di bioaccumulo, con conseguenze quindi involontarie sulla salute umana della fornitura di standard (preventivi) per limitare l infiammabilità di molteplici prodotti commerciali nei vari ambienti di vita e di lavoro. Nel corpo umano e negli animali di laboratorio, la marcata sostituzione degli atomi di bromo porta ad un decremento della biodisponibilità. L assorbimento intestinale del decabde risulta limitato, con circa oltre il 90% della dose orale somministrata che viene rapidamente escreta con le feci, mentre nei congeneri a più bassa bromurazione (tetra- e penta-bde), ma con maggiore tossicità, oltre l 80% della dose orale viene assorbita. Il metabolismo dei PBDE consiste nelle fasi enzimatiche di reazione di idrossilazione e metilazione e, nel caso di congeneri con un più alto grado di bromurazione, di debromurazione ossidativa. L escrezione fecale rappresenta la via prevalente di eliminazione; la via di escrezione urinaria del BDE-47 (tetra-bde) risulta essere nei ratti secondaria, mentre importante al pari della via fecale nei topi. Pochi sono i dati disponibili sulla emivita dei singoli congeneri PBDE: giorni per tetra- ed esa- BDE. Tuttavia risultano ancora limitati i dati disponibili sulla tossicocinetica per l uomo; sulla base dell incremento osservato nelle concentrazioni dei PBDE nel tempo, i PBDE sono assorbiti e bioaccumulano (prevalentemente nel tessuto adiposo). Dati tossicologici. La tossicità acuta di miscele di PBDE risulta bassa nei roditori e nei conigli. I PBDE provocano negli animali di laboratorio problemi di sviluppo e danni all apparato riproduttivo, alla tiroide (alterazioni degli ormoni TSH, T4 e T3) e al neurosviluppo. Sulla base dei limitati dati tossicologici disponibili si stima che per i PBDE maggiormente tossici (tetra- e penta-bde) l esposizione a dosi minori che 100 µg/kg di peso corporeo/die è improbabile possano causare effetti avversi in animali da laboratorio (roditori). Negli studi di tossicità a breve-termine gli effetti principali delle miscele di PBDE sono visti nel fegato, nel rene e nella tiroide di entrambi i sessi. I pochi studi di tossicità a lungo termine (per carcinogenicità) condotti con una miscela di deca-bde somministrata con la dieta hanno evidenziato incrementi significativi dell incidenza degli adenomi epatocellulari e carcinomi nei topi femmina. Tuttavia, gran

9 parte degli studi in vitro per la genotossicità indicano che miscele di PBDE e singoli congeneri non sono genotossici. Evidenze sperimentali recenti stimano che nell uomo livelli di PBDE superiori a 100 ppb costituirebbero un serio rischio per i neonati. Infatti, sperimentazioni animali hanno evidenziato che la somministrazione in dosi massiccie di un PBDE sensibilmente tossico [come il penta-pbde, ancora presente in molti prodotti commerciali made in USA] a topi e ratti interferisce con il funzionamento della tiroide, causa problemi al sistema nervoso e all apparato riproduttivo e rallenta il neurosviluppo (FAO/WHO 2005). Non sono riportati in letteratura casi clinici nell uomo dopo ingestione orale di PBDE. In uno studio epidemiologico caso-controllo (FAO/WHO 2005) elevate concentrazioni di BDE-47 sono state trovate nel tessuto adiposo di casi di linfoma non-hodgkin, ma il significato eziologico di questa associazione è incerto. Tuttavia sono riportati in letteratura molti dati che evidenziano un incremento rilevante di PBDE nel latte materno e nel sangue umano; l assunzione alimentare (intake) di PBDE per l uomo adulto è stimata, dal comitato di esperti FAO/WHO sugli additivi alimentari, essere in media di circa 4 ng/kg peso corporeo/die (ovvero 0,004 µg/kg di peso corporeo/die), mentre nei neonati l intake attraverso l allattamento al seno è risultato superiore a 0,1 µg/kg di peso corporeo/die per la somma di tutti i congeneri PBDE misurati, inclusi quelli meno tossici. Di conseguenza sembra esserci un ampio MOE (margine di esposizione) per questo composto non genotossico (FAO/WHO 2005). I PBDE che dai test sugli animali sono risultati a maggiore tossicità (penta- e octa-bde) sono in via di graduale eliminazione; l Unione Europea ha messo al bando tali sostanze dall agosto Tuttavia non sono state ancora emanate limitazioni per i deca-bde, che costituiscono i composti PBDE più diffusi (80%) anche se meno tossici; tuttavia tali sostanze pongono seri rischi, in quanto vengono biodegradate dai batteri ambientali nelle varietà a maggiore tossicità (come il BDE-47: tetra-bde) (de Wit 2002; Law et al. 2006; Schecter et al. 2004). Valutazione del rischio PBDE. L utilizzo di dati sul grado di contaminazione da PBDE nelle matrici ambientali (per valutare la dose esterna) e del biomonitoraggio (biomarcatori di dose interna) consente di caratterizzare l esposizione umana, di individuare i trend di contaminazione/esposizione nella popolazione e di indirizzare la valutazione del rischio (risk assessment) di questi composti persistenti nell ambiente e nel biota. Il grado di ripartizione dei PBDE nei lipidi, la misurazione diretta dei congeneri BDE nei campioni biologici deve prevedere un buon biomarker di esposizione. Purtroppo, i dati

10 sperimentali disponibili indicano che esiste una significativa variabilità (>di 100 volte) nei livelli di PBDE nei lipidi della popolazione generale; è stato ipotizzato che possono giocare un ruolo nel profilo dei congeneri osservati sia il grado di esposizione che la tossicocinetica. L interpretazione dei dati del biomonitoraggio dei PBDE risulta ancora difficoltoso e non in grado di indirizzare le scelte di sanità pubblica, alcune questioni di risk assessment rimangono infatti insolute come le limitate conoscenze sull ambiente adiposo e sul trasporto dei congeneri PBDE, la limitata disponibilità di dati sulle popolazioni adulte, la mancanza di dati sulle popolazioni maggiormente suscettibili come i bambini (Birnbaum et al. 2006). B) Attività svolta e risultati della ricerca sulla biodegradazione microbica dei PBDE Nel primo anno di ricerca è stato inizialmente eseguito lo studio di fattibilità del progetto durante il quale è emerso l eccessivo costo degli standard e delle analisi necessarie per la determinazione dei numerosi congeneri dei ritardanti di fiamma, microinquinanti presenti solo in tracce (ng/g) nelle matrici ambientali. Tale valutazione ha portato a restringere l indagine ai soli ritardanti di fiamma più impiegati che sono le molecole polibromurate (PBDE), in particolare le specie deca-bde (209, di cui è attualmente ancora permesso l'uso in ambito CE) e penta- BDE (82-127, bandito in ambito UE e il più comune prodotto di degradazione del deca BDE); sono invece stati eliminati dalla ricerca gli ignifughi storici PFOS ormai in progressivo disuso. Il grado di tossicità ambientale e umana dei PBDE risulta maggiore quanto minori risultano gli atomi di bromo presenti nella molecola, con la maggiore tossicità ascritta alle frazioni penta-bde (99) e esa-bde (153)]. In fase di fattibilità è stata anche chiarita la mancata reperibilità nell area vasta Firenze-Prato-Pistoia di impianti di depurazione idonei alla sperimentazione (a circuito chiuso, di piccole dimensioni) e/o anche disponibili per la sua effettuazione. Pertanto si è arrivati alla scelta di utilizzare al posto dei 2 depuratori di liquami (civili e industriali) previsti, un impianto di depurazione a scala di laboratorio. E stata anche condotta una ricerca bibliografica sulla biotrasformazione aerobica e anaerobica dei PBDE nelle acque reflue che ha portato all'individuazione di due specie batteriche aerobie efficaci nel biorisanamento: Rhodococcus jostii (RHA1) e Burkholderia xenovorans (DSMZm 17367), che sono stati acquisite per la sperimentazione. Sempre nel primo anno è stata effettuata un indagine conoscitiva sui metodi di analisi dei PBDE nelle acque

11 reflue. Fra le tecniche strumentali utilizzate vi sono la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (GC/HRMS) e la gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa con detector a ionizzazione chimica negativa (GC/MS NCI mode). Per le prime analisi conoscitive di tipo semiquantitativo è stato impiegato invece il test ELISA (kit rapido specifico per i PBDE). Per le analisi dei PBDE ci si è avvalsi della collaborazione della Chimica analitica del Dipartimento di Chimica dell Università di Firenze (ricercatrici: dott.ssa Cincinelli e e Martellini). Una ulteriore ricerca è stata effettuata nel primo anno al fine di chiarire il range delle concentrazioni dei PBDE in ingresso e in uscita negli impianti di depurazione italiani e individuare le giuste concentrazioni di PBDE da utilizzare in ingresso nell impianto di depurazione a scala di laboratorio. Tale studio preliminare è stato condotto sulle acque reflue di impianti misti (civile più industriale) di depurazione dell area vasta Firenze-Prato-Pistoia (1 impianto) e dell'area Milano-Varese (4 impianti). Nel secondo anno di ricerca è stata effettuata la sperimentazione con l impianto di depurazione da banco (figura 1), in condizioni di aerobiosi, al buio (in quanto i PBDE subiscono fotodegradazione) e a temperatura ambiente, con fango primario prelevato da una vasca di ossidazione biologica di un impianto di depurazione a fanghi attivi misto (con prevalenza di reflui tessili caratterizzati da elevate concentrazioni di PBDE) dell area vasta metropolitana Firenze-Prato-Pistoia. In tal senso sono stati eseguiti tre tipi di esperimenti diversi: (1) con fango attivo arricchito dei due ceppi batterici da collezione (Burkholderia xenovorans) e Rhodococcus jostii, a concentrazioni di 10^4 CFU per ml), indicati in letteratura per la loro capacità di degradare i composti organici alogenati a più basso numero di atomi di alogeno) ossigenato per 96 h e rifornito di nutrienti; (2) esperimento in batch con fango attivo arricchito di due ceppi batterici da collezione (B. xenovorans e e R. jostii, a concentrazioni di 10^5 CFU per ml) ossigenato per 48 h; (3) esperimento in batch con fango attivo tal quale (ovvero con la sola microflora indigena e quindi senza arricchimento batterico) ossigenato per 48 h.

12 Figura 1. Immagine dell impianto di depurazione da banco in cui sono visibili sia la vasca di ossidazione del fango attivo, in fase di aerobiosi, sia la vasca di sedimentazione. Risultati indagine sui PBDE negli impianti di depurazione di liquami misti L indagine analitica, condotta nei 5 impianti di depurazione esaminati (4 lombardi e 1 toscano) su 15 campioni di acqua (lombardi: 4 in ingresso, 4 in uscita e 4 in fanghi ispessiti; toscano: 1 ingresso, 1 uscita e 1 fango ispessito) e per ciascun campione tre repliche per la determinazione analitica delle concentrazioni, ha individuato che tutte le acque di depurazione e i fanghi ispessiti analizzati contenevano PBDE in concentrazioni rilevanti. I valori riscontrati (figura 2) oscillavano nelle acque di ingresso e di uscita da un massimo di 2100 ng/litro a un minimo di 0,2 ng/litro, mentre nei fanghi attivi da un massimo di ng/g a un minimo di 30 ng/g. Le concentrazioni di PBDE sono risultate ampiamente diversificate fra gli impianti lombardi e l impianto toscano (figure 3 e 4). In particolare i 4 impianti misti dell area Milano-Varese presentavano i seguenti valori di deca e penta BDE (figura 2): acque ingresso min 1,5-max 125 ng/l (per deca BDE, 209); min 0,5-max 14 ng/l (per penta BDE, 99); acque uscita: min 1-max 37 ng/l (per deca); min 0,2-max 0,6 ng/l (per penta). L area Firenze-Prato-Pistoia (1 impianto misto) presentava i seguenti valori di deca e penta BDE: acqua

13 ingresso 2100 ng/l (per deca), 12 ng/l (per penta); acqua uscita 300 ng/l (per deca), 2 ng/l (per penta). Figura 2. Risultati PBDE nei 4 impianti lombardi esaminati: fase disciolta e particolato. Risultati PBDE nei 4 impianti lombardi fase disciolta (ingresso: in; uscita: out) 8,00 7,00 6,00 Conc ng/l 5,00 4,00 3,00 BDE-209 Totale miscela Penta-BDE Totale BDE (tranne 209) 2,00 1,00 0,00 A in A out B in B out C in C out D in D out 0,5 ng/l Conc (ng/l) Fase particolato (ingresso: in; uscita: out) BDE-209 Totale miscela Penta-BDE Totale BDE (tranne 209) A in A out B in B out C in C out D in D out A in A out B in B out C in C out D in D out

14 Figura 3. Risultati PBDE nell impianto toscano. Concentrazione media PBDE (acqua ingresso: fase disciolta e fase particolato) Figura 4. Risultati PBDE nell impianto toscano. Concentrazione media miscele Penta e Deca BDE (acqua ingresso e acqua uscita impianto)

15 Risultati indagine sui PBDE nell impianto da banco. L indagine analitica ha determinato i valori dei principali congeneri che si producono nelle acque reflue, a seguito della biodegradazione del deca- BDE (209, il cui impiego è ancora tollerato in ambito comunitario), e in particolare nel fango attivo arricchito dei due ceppi batterici da collezione (Burkholderia xenovorans e Rhodococcus jostii), ossigenato per 96 h (esperimento 1). Fra i principali prodotti di biodegradazione del deca- BDE vi sono le miscele octa-bde e penta-bde, fino ad arrivare a mono- BDE. Va ricordato che i congeneri a maggiore tossicità risultano essere quelli con il minor numero di atomi di bromo e fra questi spiccano il penta e tetra-bde. Nell esperimento con l impianto da banco possono essere distinte, per la determinazione analitica dei BDE presenti, due fasi: - fango attivo tal quale e prima dell arricchimento microbico (tempo-0); - fango attivo dopo l arricchimento microbico (tempo-1, con ossigenazione in vasca di ossidazione per 96 h). L indagine analitica, peraltro ancora in corso, ha fornito i seguenti dati: il mono-bde al tempo 0 (figure 5 e 6) presenta valori al disotto del limite di rilevabilità (s.l.r), mentre al tempo-1 assume il valore di 48,8 ng/g; la miscela penta-bde al tempo 0 presenta il valore di 929,4 ng/g, mentre al tempo-1 di 463,5 ng/g; la miscela octa al tempo-0 presenta il valore di 258,5 ng/g, mentre al tempo-1 di 105,5 ng/g. Fra i singoli congeneri BDE (tabella 2) emergono alcuni valori di rilievo nel grado di biodegradazione: il tetra BDE 47 al tempo-0 presenta valori di 517,5 ng/g, che si riducono marcatamente al tempo-1 con valori di 107,2 ng/g; l esa BDE 154 al tempo-0 130,4 ng/g, al tempo-1 68,5 ng/g; l esa-bde 156 al tempo-0 118,9 ng/g, al tempo-1 77,2 ng/g; l epta- BDE 183 al tempo-0 258,5 ng/g, al tempo-1 105,5 ng/g; l epta-bde 191 al tempo-0 258,5 ng/g, al tempo-1 158,3 ng/g.

16 Tabella 2 Concentrazioni dei singoli congeneri di BDE, espressi in ng/g, nel fango attivo dell impianto da banco prima (tempo 0) e dopo (tempo 1) l arricchimento microbico. (slr = sotto limite di rilevabilità) Senza arricchimento microbico (tempo 0) (ng/g) Con arricchimento microbico (tempo 1) (ng/g) BDE-7 slr 48,80 BDE15 slr 59,77 BDE-17 87,5 68,6 BDE28 75,5 61,2 BDE-49 79,6 114,8 BDE-71 59,3 49,0 BDE47 517,5 107,2 BDE-66 76,1 67,8 BDE ,2 130,0 BDE ,4 18,6 BDE-99 84,2 81,0 BDE- 185,5 68, BDE ,4 68,5 BDE ,1 76,8 BDE ,5 67,6 BDE ,9 77,2 BDE ,6 74,0 BDE ,5 105,5 BDE ,5 158,3 mono slr 48,8 penta 929,4 463,5 octa 258,5 105,5

17 Figura 5 Concentrazioni (ng/g) dei singoli congeneri di BDE determinate nel fango dell impianto da banco al tempo 0 e al tempo 1. Figura 6 Concentrazioni (ng/g) dei congeneri costituenti le tre principali miscele PBDE (mono, penta e octa) determinate nel fango dell impianto da banco al tempo 0 e al tempo 1. Mettendo a confronto i dati raccolti in ingresso e in uscita dell'impianto da banco emerge chiaramente come si sia verificato un

18 abbattimento dei PBDE in uscita impianto; tale riduzione in uscita impianto è per alcuni congeneri molto elevata fino a raggiungere un massimo del 500% (come nel caso del tetra-bde 47). Si assiste anche in uscita impianto ad una rilevante trasformazione in congeneri a minor numero di atomi di bromo che risultano a maggiore tossicità ambientale e umana. Non sono ancora disponibili i dati relativi alla determinazione dei PBDE sul fango attivo arricchito di due ceppi batterici da collezione (B. xenovorans e R. jostii) e ossigenato per 48 h (esperimento 2), e sul fango attivo tal quale e ossigenato per 48 h (esperimento 3), in quanto ancora in corso le analisi per la determinazione delle concentrazioni dei vari BDE. Una prima valutazione dei dati complessivi prodotti dai due esperimenti (PBDE in impianti sul campo, PBDE in impianto da banco), tratta dal confronto dei dati di ingresso e uscita impianti, evidenzia come vi sia una marcata capacità biodegradativa esercitata sui PBDE da parte delle ricche microflore prevalentemente batteriche presenti nei fanghi attivi e dai ceppi Burkholderia xenovorans e Rhodococcus jostii inoculati nei fanghi. I risultati raggiunti, se verranno confortati dai risultati delle analisi ancora in corso per la determinazione dei deca-bde (al tempo-0 e al tempo-1) nell'esperimento 1 e di tutti i PBDE negli esperimenti 2 e 3, orientano verso un approfondimento del processo biodegradativo batterico dei PBDE delle acque reflue e un allargamento dell'indagine ad altre matrici come ad esempio quella alimentare che tanto rilievo assume in sanità pubblica. PARTE 2 Attività svolta e risultati della ricerca La parziale biorigenerazione dei carboni attivi si verifica durante il processo basato sui carboni arricchiti con popolazione biologica (BAC)(Ozgur, 2007). Carenti gli studi sula cinetica di desorbimento di idrocarburi xenobiotici adsorbiti su carbone attivo granulare nel trattamento di acque contaminate con elevati livelli di salinità. Due le ipotesi sul meccanismo di tale biorigenerazione: 1) la degradazione della sostanza adsorbita per effetto di enzimi extra-cellulari (Rodman, 1973). I batteri (circa 1 micron) non penetrano nei pori dei carboni, per cui la degradazione all'interno di questi avviene attraverso enzimi extracellulari che raggiungono i micropori, dove interagiscono con il substrato adsorbito e promuovono la degradazione idrolitica. Per la minore affinità di adsorbimento dei prodotti di degradazione, questi vengono desorbiti diventando disponibili per le cellule microbiche. 2) una aliquota della

19 rigenerazione dei carboni attivi è dovuta allo sviluppo del processo biologico sulla superficie in combinazione con il processo di adsorbimento, desorbimento e diffusione nei pori (Andrews and Tien, 1981). Un gradiente di adsorbimento inverso della concentrazione può determinarsi con un tasso critico di biodegradazione nel biofilm e nella fase acquosa. Le sostanze adsorbite vengono quindi desorbite nel biofilm e, attraverso esso, raggiungono la fase liquida, risultando accessibili alla degradazione microbica. Nuove ricerche devono determinare le condizioni ottimali per la biorigenerazione in alcune tipologie di acque contaminate da idrocarburi xenobiotici originate dall'industria del petrolio, che possono raggiungere elevati livelli di salinità. E sulla base di tali premesse che si è sviluppata la collaborazione con il gruppo di ricerca di Catania, indirizzata alla valutazione della rigenerazione biologica del carbone attivo utilizzato per il biorisanamento delle acque marine contaminate dalle acque di lavaggio delle petroliere, ricche di prodotti chimici recalcitranti alla biodegradazione. Il nostro gruppo di Firenze ha effettuato nel primo anno un ampia ricerca bibliografica, al fine di individuare i ceppi batterici più idonei al biorisanamento, che ha portato all individuazione dei generi Alcanivorax e Cycloclasticus quali degradatori in condizioni di aerobiosi dei prodotti petrolchimici inquinanti, e ha progettato una serie di bioreattori in batch nei quali effettuare le colture batteriche in presenza di carbone attivo saturato con acqua di mare ricca di prodotti petroliferi. Nel secondo anno di ricerca si sono eseguiti gli esperimenti in batch e in aerobiosi sia di biorigenerazione del carbone attivo saturato con acqua di mare contaminata da prodotti petrolchimici (esperimento A), sia di biodegradazione della sola acqua di mare inquinata da prodotti petrolchimici (esperimento B). In questi esperimenti si è scelto di aggiungere alla microflora batterica marina il batterio alofilo aerobio Alcanivorax borkumensis (ceppo da collezione disponibile: DSMZ 11573). Il ceppo è stato prima rivitalizzato e poi acclimatato con l acqua di mare contaminata. Sono poi state allestite le due serie di esperimenti: una prima serie (A)(figura 7) è stata effettuata su brodocolture di Alcanivorax borkumensis (a concentrazioni di 108 CFU/ml) con carbone attivo granulare (GAC) e acqua di mare (grezza e chiariflocculata), al fine di valutare l efficacia di A. borkumensis nel biorigenerare il carbone attivo granulare; una seconda serie (B) (figura 8)è stata poi condotta, al fine di valutare le capacità degradative del ceppo Alcanivorax borkumensis sugli inquinanti petrolchimici sia da solo che in associazione con la comune

20 flora batterica marina, mediante l allestimento di brodocolture contenenti acqua di mare contaminata da prodotti petrolchimici, nutrienti, microflora indigena e A. borkumensis (a concentrazioni di 1016 CFU/ml). Tutte le brodocolture sono state incubate in termostato a 28 C, al buio e ossigenate mediante diffusori d aria. Figura 7. Colture in batch per la biorigenerazione batterica di GAC saturo di idrocarburi petrolchimici (esperimento A). Figura 8. Colture per la biodegradazione batterica di acqua di mare inquinata da

21 prodotti petrolchimici marini (esperimento B). Risultati indagine biorigenerazione e biodegradazione microbica I dati ottenuti relativi al grado di biodegradazione dei prodotti petrolchimici e di biorigenerazione del GAC saturo di prodotti petrolchimici sono stati determinati ed elaborati dall unità di ricerca di Catania, alla cui relazione si rimanda (Mancini et. Al.). RINGRAZIAMENTI Il presente lavoro si inquadra nell ambito del progetto Salvaguardia dei corpi idrici dalla contaminazione da composti xenobiotici: nuovi strumenti per l'analisi, il controllo ed il trattamento nelle acque reflue civili ed industriali finanziato dal Ministero dell Università e della Ricerca Scientifica nell ambito dei Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Anno finanziario 2007). BIBLIOGRAFIA Bedard, D.L., R Unterman, L H Bopp, M J Brennan, M L Haberl, and C Johnson (1986). Rapid assay for screening and characterizing microorganisms for the ability to degrade polychlorinated biphenyls. Appl. Environ. Microbiol. 51: Birnbaum L.S., Cohen Hubal E.A. (2006) Polybrominated diphenyl ethers. A case study for using biomonitoring data to address risk assessment questions. Environmental Health Perspectives 114 (119), Denef, V.J., J. Park, T.V. Tsoi, J.-M. Rouillard, H. Zhang, J.A. Wibbenmeyer, W. Verstraete, E. de Wit C.A. (2002) An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere 46, Dye J.A., Venier M., Zhu L., Ward C.R., Hites R. A., Birnbaum L.S. (2007) Elevated PBDE levels in pet cats: sentinels for humans? Environ. Sci. Technol. 41, Goris, Johan, Paul De Vos, Jesús Caballero-Mellado, Joon-Hong Park, Enevold Falsen, James M. Tiedje, and Peter Vandamme (2004) Classification of the PCB- and biphenyl degrading strain LB400 and

22 relatives as Burkholderia xenovorans sp. nov. Intl J. Syst Evol Microbiol. 54: Gulari, S.A. Hashsham, and J.M. Tiedje. (2004). Biphenyl and benzoate metabolism in a genomic context: Outlining genome-wide metabolic networks in Burkholderia xenovorans LB400. Appl. Environ. Microbiol. 70: FAO/WHO. Joint FAO/WHO expert committee on food additives (JECFA). Sixty-fourth meeting. Rome, 8-17 February Pubblicazione consultabile al sito web: nal.pdf Law R.J, Allchin C.R., de Boer J., Covaci A., Herzke D., Lepom P., Morris S., Tronczynski J., de Wit C.A. (2006) Levels and trends of brominated flame retardants in the european environment. 64, Martin K.M., Rossing M.A., Ryland L.M., DiGiacomo R.F., Freitag W.A. (2000) Evaluation of dietary and environmental risk factors for hyperthyroisim in cats. J. Am. Vet. Med. Assoc. 217, Nebbia C. (2009) Residui di farmaci e contaminanti ambientali nelle produzioni animali. Edises, Napoli. Schecter A., Papke O., Tung K.C., Staskal D., Birnbaum L. (2004) Polybrominated diphenil ethers contamination of United States food. 38(20) Schecter A., Papke O., Tung K.C., Harris J.J., Dahlgren J. (2005) Polybrominated diphenil ethers flame retardants in the U.S. population: current levels, temporal trends, and comparision with dioxins, dibenzofurans, and polychlorinated biphenlyls. 47, Zota A.R., Rudel R.A., Morello-Frosch R.A., Brody J.G. (2008) Elevated house dust and serum concentrations of PBDE in California: unintended consequences of forniture flamability standards? Environ. Sci. Technol. 42 (21),

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