La genomica di nuova generazione

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1 La genomica di nuova generazione Negli ultimi anni, gli straordinari progressi conseguiti nel settore della genomica e delle biotecnologie hanno posto le basi per leggere e comprendere le informazioni contenute nel nostro DNA, il genoma. In particolare le nuove tecnologie di sequenziamento, Next Generation Sequencing (NGS), ci permettono oggi di accedere alla sequenza del nostro DNA in modo più facile ed efficace, fornendo una valutazione approfondita dell informazione genetica di ogni singolo individuo. Ogni persona nasce, infatti, con caratteristiche genetiche che la differenziano dagli altri e che la rendono unica. Mentre la maggior parte delle differenze nella sequenza del DNA tra persone diverse è innocua, alcuni cambiamenti, definiti mutazioni genetiche, possono alterare la funzionalità genomica e rendere quella persona portatrice di una specifica malattia genetica trasmissibile ai propri figli. I portatori di malattie genetiche sono tipicamente individui sani, completamente privi di sintomi ed inconsapevoli di essere a rischio di trasmettere tale errore del DNA ai figli. Il test GeneScreen GeneScreen Expanded è un test diagnostico, sviluppato da GENOMA Group, che permette di eseguire un analisi multipla di oltre 1500 malattie genetiche ereditarie, tra cui quelle più frequenti nella popolazione italiana, come la Fibrosi Cistica, l Anemia Falciforme, la Talassemia, la Sordità Ereditaria. GeneScreen consente alla coppia di conoscere, attraverso l analisi del loro DNA, se si è portatori di gravi malattie genetiche. Il test, quindi, permette di identificare le coppie a rischio di trasmettere ai loro figli una specifica malattia genetica. Indicazioni al test GeneScreen GeneScreen è indicato: Pag. 1 di 8

2 Per le coppie che progettano di diventare genitori, sia tramite concepimento naturale che mediante l accesso a tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA); Per le coppie che sono in attesa di un figlio, e che desiderano ridurre il rischio di trasmettere a quest ultimo una malattia genetica ereditaria; Per le coppie che fanno ricorso a tecniche di fecondazione eterologa, al fine di individuare un donatore di gameti che non sia portatore di mutazioni nei medesimi geni riscontrate in uno dei partners della coppia. L esame può essere effettuato su un singolo individuo o, preferibilmente, su entrambi i partners della coppia. Come viene effettuato il test GeneScreen Expanded? Il test viene eseguito mediante il prelievo di un campione ematico. Tramite un analisi complessa di laboratorio, Il DNA viene isolato dalle cellule nucleate ed amplificato mediante tecnica PCR.. Successivamente, attraverso un processo tecnologico avanzato di sequenziamento massivo parallelo (MPS), che impiega tecniche di Next Generation Sequencing (NGS) utilizzando sequenziatori ILLUMINA, si sequenziano completamente 95 geni (esoni e regioni introniche adiacenti, ± 5 nucleotidi)(tabella 1) ad elevata profondità di lettura. Le sequenze geniche ottenute vengono analizzate attraverso un avanzata analisi bioinformatica, per determinare la presenza di eventuali mutazioni nei geni in esame. L'analisi per individuare la delezione degli esoni 7 e 8 del gene SMN1 viene effettuata mediante tecnica MLPA e successiva elettroforesi capillare in sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente. La valutazione dell espansione delle triplette nucleotidiche ripetute nel sito fragile FRAXA viene eseguita mediante PCR fluorescente e successiva elettroforesi capillare in sequenziatore automatico. I geni elencati in Tabella 1, sono stati selezionati in base all incidenza nella popolazione delle malattie causate da mutazioni in tali geni, alla gravità del fenotipo clinico alla nascita ed all importanza del quadro patogenetico associato, seguendo le indicazioni dell American College of Medical Genetics (ACMG)(Grody et al., Genet Med 013:15:48 483). Risultati ottenibili con il test GeneScreen POSITIVO Presenza di una o più mutazioni: indica che il test ha rilevato una o più mutazioni a livello di uno (o più) geni. Il nostro genetista, in sede di consulenza genetica, spiegherà in maniera dettagliata il significato del risultato del test ed, eventualmente, prospetterà la necessità di estendere l esame all altro partner della coppia, al fine di verificare che quest ultimo non sia portatore delle medesima malattia genetica, nel qual caso si ravviserebbe un rischio di trasmissione della patologia ai figli. Le mutazioni riscontrabili tramite il test GeneScreen possono rientrare nelle seguenti categorie prognostiche: o con significato patologico noto; o con significato benigno in quanto sono riscontrabili in individui normali e sono prive di significato patologico; o con significato incerto in quanto non ancora note o caratterizzate dalla comunità medicoscientifica. Pag. di 8

3 Se entrambi i partners della coppia dovessero risultare positivi per il test, portatori di una mutazione con significato patologico noto nel medesimo gene, il nostro genetista potrà fornire una panoramica sulle opzioni diagnostiche attualmente disponibili per verificare lo stato di salute del feto, in caso di futura gravidanza. NEGATIVO - Assenza di mutazioni: indica che il test non ha rilevato la presenza di mutazioni nei geni esaminati. Parametri utilizzati per la refertazione delle varianti genetiche L analisi è mirata esclusivamente ai geni elencati in Tabella 1. Verranno refertate solo le mutazioni classificate come a significato patogenetiche noto o con significato incerto, sulla base dei dati della letteratura scientifica e la classificazione presente nel database di riferimento Human Gene Mutation Database (HGMD), aggiornato alla data del prelievo. Inoltre, seguendo le indicazioni dell American College of Medical Genetics (ACMG), sono state considerate come patogenetiche o presunte patogenetiche solo le mutazioni con un valore di Minor Allele Frequency (MAF) <5% (1000 Genomes Project), riferibile come la frequenza di ricorrenza dell allele meno comune all interno della popolazione. Target Coverage Si intende per Target Coverage, il numero medio di letture (reads) ottenute dal sequenziamento per ciascuna base nucleotidica costituente il gene. Le varianti con una profondità di lettura (numero di reads) inferiore a 30X non sono vengono evidenziate dall algoritmo di analisi bioinformatica. Accuratezza del test GeneScreen Le tecniche attuali di sequenziamento del DNA producono risultati con un accuratezza superiore al 99%. Benché questo test sia molto accurato bisogna sempre considerare i limiti dell esame, di seguito descritti. Limiti del test GeneScreen Questo esame valuta solo le malattie genetiche ed i geni elencati in Tabella 1. Il test non evidenzia altre malattie genetiche o geni non specificamente investigati. L esame inoltre non è in grado di evidenziare: mutazioni localizzate nelle regioni introniche oltre ± 5 nucleotidi dai breakpoints; delezioni, inversioni o duplicazioni maggiori di 0 bp; mosaicismi della linea germinale (cioè mutazioni presenti solo nei gameti). Un risultato NEGATIVO - Assenza di mutazioni per i geni investigati non esclude la possibilità di essere portatori di una mutazione localizzata in una regione del genoma non investigata dall esame. E possibile che alcune zone del proprio DNA non possano essere sequenziate o che abbiano una copertura inferiore ai limiti fissati dagli esperti di GENOMA Group per garantire un analisi accurata delle varianti. Queste regioni non saranno quindi comprese nell analisi qualora non superino gli standard qualitativi richiesti. In alcuni casi, il risultato di un analisi genomica può rivelare una variante o mutazione del DNA con un significato clinico non certo o determinabile in base alle attuali conoscenze medicoscientifiche. Pag. 3 di 8

4 L interpretazione delle varianti genetiche si basa sulle più recenti conoscenze disponibili al momento dell analisi. Tale interpretazione potrebbe cambiare in futuro con l acquisizione di nuove informazioni scientifiche e mediche sulla struttura del genoma ed influire sulla valutazione stessa delle varianti. Alcune patologie possono essere causate o regolate da più di una variante nel suo DNA in uno o più geni. Alcune di queste varianti possono non essere ancora state identificate o validate dalla comunità scientifica e quindi non essere riportate come patogenetiche al momento dell analisi. Limite intrinseco della metodologia NGS utilizzata è la mancanza di uniformità di coverage per ciascuna regione genica analizzata. Tale limite si traduce nella possibilità, insita nelle metodiche NGS, che specifiche mutazioni dei geni selezionati potrebbero non essere state rilevate dal test. La valutazione dell espansione delle triplette nucleotidiche ripetute nel sito fragile FRAXA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR), per i limiti intrinseci della metodica, potrebbe non evidenziare la presenza di espansioni di triplette di grosse dimensioni. Quindi, in caso pazienti di sesso femminile nelle quali viene evidenziato un genotipo omozigote, la PCR potrebbe non aver amplificato un allele con un espansione di grosse dimensioni, e quindi trattarsi di un falso omozigote. In quest'ultimo caso, il risultato dovrebbe essere confermato mediante esame di secondo livello. Bibliografia 1. Blythe S, Farrell PM. Advances in the diagnosis and management of cystic fibrosis. Clin Biochem. 1984;17: Haque IS, Lazarin GA, Kang HP, et al. Modeled Fetal Risk of Genetic Diseases Identified by Expanded Carrier Screening. JAMA. 016;316(7): de Graaf G, et al. Am J Med Genet 015;167(4): Cragan JD, et al. MMWR CDC Surveill Summ 1995 Aug 5;44(4): Cystic Fibrosis Foundation Patient registry 01 annual data report. Bethesda, Maryland. 013 Cystic Fibrosis Foundation. 6. Bell CJ, et al. (011) Sci Transl Med.3(65):65ra4 7. Lazarin et al. (013) Genet Med.15(3): Archibald et al. (017) Genet Med. doi: /gim Committee Opinion No American College of Obstetricians and Gynecologists. (017) Obstet Gynecol.19:e Henneman L, Borry P, Chokoslivi D, et al. Responsible implementation of expanded carrier screening. European Journal of Human Genetics. 016;4,e1 e Edwards JG, Feldman G, Goldberg J, et al. Expanded Carrier Screening in Reproductive Medicinepoints to Consider. A Joint Statement of the American College of Medical Genetics and Genomics, American College of Obstetricians and Gynecologists, National Society of Genetic Counselors, Perinatal Quality Foundation, and Society for Maternal-Fetal Medicine.Obstet Gynecol 015;15(3): Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 015;17(5): Pag. 4 di 8

5 Tabella 1: GeneScreen Expanded - Elenco dei geni analizzati AAAS ATP7B COL6A3 ESPN GNPTAB KCNV NBN PEX6 SELENON TGM1 ABCA1 ATP8B1 COL7A1 ESRRB GNPTG KDM5C NDP PEX7 SEMA4A TH ABCA3 ATR COL9A1 ETFA GNRHR KIAA0 NDRG1 PFKM SEPSECS THRA ABCA4 ATRX COL9A ETFB GNS KIF7 NDUFA1 PGK1 SERPINA1 THRB ABCB11 AUH COQ ETFDH GORAB L1CAM NDUFA7 PGM1 SETX TIMM8A ABCB4 B4GALT1 COQ8A ETHE1 GP1BA LAMA ABCB7 B9D COQ9 EVC GP1BB LAMA3 ABCC BBS1 COX10 EVC GP9 LAMB NDUFAF NDUFAF 4 NDUFAF 5 PHF8 SFTPB TK PHGDH SFTPC TLR3 PHKG SGCA TMC1 ABCC6 BBS10 COX15 EXOSC3 GPC3 LAMB3 NDUFS3 PHYH SGCB TMEM16 ABCC8 BBS1 COX6B1 EYS GPR143 LAMC NDUFS4 PKHD1 SGCD TMEM67 ABCD1 BBS CPS1 F11 GPR179 LAMP NDUFS5 PKLR SGCG TMIE ABCD4 BCHE CPT1A F GRHPR LARGE1 NDUFS6 PLAG6 SGSH TMPRSS3 ACAD8 BCKDHA CPT F5 GRIA3 LBR NDUFS7 PLCE1 SHD1A TNFRSF11 B ACAD9 BCKDHB CRB1 F8 GRIK LCA5 NDUFS8 PLEC SH3TC TNNT1 ACADL BCOR CRLF1 F9 GRM6 LDHA NDUFV1 PLEKHG5 SHROOM4 TPO ACADM BCS1L CRTAP FAH GRXCR1 LDLR NEB PLG SIL1 TPP1 ACADS BEST1 CRX ACADSB BLM CSTB FAM16 A FAM161 A ACADVL BLOC1S6 CTH FAM0C GUCYD LHFPL5 GSS LDLRAP1 NEFL PLOD1 SIX6 TPRN GTFH5 LHCGR NEU1 PLP1 SLC1A1 TRAPPC9 NEUROG 3 PMM SLC1A3 TRDN ACAT1 BRCA CTNS FANCA GUSB LHX3 NHEJ1 PMP SLC1A6 TREX1 ACE BRIP1 CTSC FANCB HADH LIFR NHLRC1 PNPO SLC16A TRIM3 ACOX1 BRWD3 CTSD FANCC HADHA LIG4 NHP POLG SLC17A5 TRIM37 ACSF3 BSCL CTSK FANCD HADHB LIPA NHS POLR1C SLC19A TRIOBP ACSL4 BSND CUL4B FANCE HAL LIPH NKX-1 POMGNT1 SLCA5 TRMU ACTN4 BTD CYBA FANCG HAMP LMBRD1 NKX-5 POMT1 SLC4A1 TSEN54 ADA BTK CYBB FANCI HAX1 LMNA NLGN3 POMT SLC5A13 TSFM ADAMTS1 3 C3 CYP11A1 FANCL HBA1 LOXHD1 NLGN4X POR SLC5A15 TSHB ADAMTS CA CYP11B1 FANCM HBA LPL NLRP7 POU1F1 SLC5A0 TSHR ADAMTSL CANT1 CYP11B FAS HBB LRAT NMNAT1 POU3F4 SLC5A TSPAN7 Pag. 5 di 8

6 ADGRG1 CAPN3 CYP17A1 FASLG HCCS LRP NOP10 PPT1 SLC6A TSPYL1 ADGRV1 CASK CYP19A1 FASTKD HESX1 LRP5 NPC1 PQBP1 SLC6A3 TTC37 ADK CASP10 CYP1B1 FBLN5 HEXA LRPPRC NPC PRCD SLC6A4 TTN AFF CASQ CYP1A FERMT3 HEXB LRTOMT NPHP1 PRF1 SLC6A5 TTPA AGA CBS CYP7A1 FGA HFE LYST NPHP3 PRKRA SLC35A1 TUBA1A AGL CCDA CYP7B1 FGB HFE MAGT1 NPHP4 PRODH SLC35C1 TUFM AGPS CCDC103 CYP4V FGD1 HGD MAK NPHS1 PROM1 SLC35D1 TULP1 AGT CCDC39 CYP7B1 FGD4 HGF MANB1 NPHS PROP1 SLC37A4 TUSC3 AGTR1 CD19 DHGDH FH HGSNAT MARVELD NR0B1 PRPS1 SLC39A4 TWNK AGTR CD47 DBT FHL1 HIBCH MAT1A NRE3 PRSS1 SLC3A1 TYK AGXT CDAP DCLRE1 C FIG4 HLCS MATN3 NR5A1 PRX SLC45A TYMP AHCY CD30 DCX FKRP HMGCL MBTPS NSD1 PSAP SLC46A1 TYR AHI1 CD3D DDB FKTN HMOX1 MCCC1 NSDHL PSAT1 SLC4A11 TYRP1 AIPL1 CD3E DDC FLNA HOGA1 MCCC NSUN PTEN SLC5A5 UBA1 AIRE CD3G DFNB59 FLVCR1 HP MCEE NTRK1 PTH1R SLC6A19 UBEA ALAS CD40LG DGUOK FMR1 HPD MCOLN1 NUP6 PTS SLC6A8 UBE3A ALDH3A CDH3 DHCR4 FOLR1 HPRT1 MCPH1 NXF5 PUS1 SLC7A7 UBR1 ALDH4A1 CDH3 DHCR7 FOXG1 HPS1 MECP NYX PYGM SLC7A9 UGT1A1 ALDH5A1 CDHR1 DHDDS FOXN1 HPS3 MED1 OAT QDPR SLC9A6 UNC13D ALDH7A1 CDK5RAP ALDOA CDKL5 DLD FRAS1 DKC1 FOXP3 HSD11B MED17 OCA RAB3 SLX4 UNC93B1 HSD17B1 0 MED5 OCRL RAB7A SMARCAL 1 UPF3B ALDOB CENPJ DLG3 FREM HSD17B3 MEFV OFD1 RAB39B SMN1 UQCRB ALG1 CEP15 DLL3 FTCD HSD17B4 MERTK OPA3 ALG1 CEP90 DMD FTSJ1 HSD3B MESP OPHN1 RAB3GAP 1 RAB3GAP SMN SMPD1 UQCRQ ALG CERKL DMP1 FUCA1 HSPD1 MFRP ORAI1 RAD51C SMS USH1C ALG3 CFH DNAH5 FXN HSPG MFSD8 OSTM1 RAG1 SNAI USH1G ALG6 CFP DNAI1 G6PC HTRA1 MGAT OTC RAG SNAP9 USHA ALG8 CFTR DNAI G6PC3 HUWE1 MID1 OTOA RAPSN SOX3 USP9X ALG9 CHM DNAJC19 G6PD HYAL1 MKKS OTOF RARS SP110 VDR ALMS1 CHRNA1 DNAL1 GAA HYLS1 MKS1 OXCT1 RAX SPG11 VIPAS39 ALPL CHRND DNMT3B GALC ICOS MLC1 P3H1 RDH1 SPG0 VLDLR UROS Pag. 6 di 8

7 ALS CHRNE DOCK8 GALE IDH3B MLYCD PAH RDX SPG7 VPS13A AMACR CHRNG DOK7 GALK1 IDS MMAA PAK3 RELN SRD5A VPS13B AMPD1 CHST6 DOLK GALNS IDUA MMAB PALB REN SRD5A3 VPS33B AMT CIITA DPAGT1 GALNT3 IFNGR1 MMACHC PANK RFT1 SRPX VRK1 ANO5 CLCN1 DPM1 GALT IFNGR MMADHC PAX3 RGR ST3GAL3 VSX ANTXR CLCN5 DPYD GAMT IFT80 MOCS1 PAX6 RHO ST3GAL5 VWF AP1S1 CLCN7 DSP GAN IGBP1 MOCS PAX8 RLBP1 STAR WAS AP1S CLDN1 DUOX GBA IGF1 MOGS PC RMRP STAT1 WDR6 AP3B1 CLDN14 DUOXA GBE1 APTX CLDN19 DYNCH 1 IGHMBP MPDU1 PCBD1 GCDH IKBKAP MPI PCCA AQP CLN3 DYSF GCH1 IKBKG MPL PCCB RNASEH A RNASEH B RNASEH C STIL STIM1 STRA6 WFS1 WHRN WISP3 AR CLN5 EDA GCSH IL1B MPV17 PCDH15 RP STRC WNT10A ARG1 CLN6 EDAR GDAP1 IL1RB1 MPZ PCDH19 RPE65 STX11 WNT3 ARHGEF6 CLN8 EDN3 GDF5 IL1RAPL 1 MRE11 PDE6A RPGR STXBP WNT7A ARHGEF9 CLRN1 EDNRB GDI1 IL1RN MRPS16 PDE6B RPGRIP1L SUCLA WRN ARL13B CNGA1 EFEMP GFM1 ILRA MRPS PDE6C RPL10 SUCLG1 XIAP ARL6 CNGA3 EFNB1 GHRHR ILRG MTHFR PDE6G RPS6KA3 SUMF1 XPA ARSA CNGB1 EGR GJA1 IMPDH1 MTM1 PDHA1 RRMB SUOX XPC ARSB CNGB3 EIFAK3 GJB1 IMPG MTMR PDHB RS1 SURF1 ZDHHC9 ARSE COG1 EIFB5 GJB INPP5E MTR PDHX RYR1 SYN1 ZEB ARSF COG7 ELK1 GJB3 INSR MTRR PDP1 SACS SYP ZFYVE6 ARX COG8 EMD GJB6 INVS MTTP PDSS1 SAG TAF1 ZIC3 ASL COL11A1 ENO3 GJC IQCB1 MUT PDSS SAMD9 TAT ZMPSTE4 ASNS COL17A1 ENPP1 GK IQSEC MVK PDX1 SAMHD1 TAZ ZNF41 ASPA COL18A1 EPMA GLA ISCU MYD88 PDZD7 SBDS TBCE ZNF469 ASPM COL1A1 ERBB3 GLB1 ITGA6 MYO15A PEPD SBF TCAP ZNF674 ASS1 COL1A ERCC GLDC ITGB4 MYO3A PEX1 SC5D TCF4 ZNF711 ATIC COLA1 ERCC3 GLE1 IVD MYO5A PEX10 SCNA TCIRG1 ZNF81 ATM COL4A3 ERCC4 GLIS3 IYD MYO6 PEX1 SCNN1A TCN ATP6AP COL4A4 ERCC5 GMA JAK3 MYO7A PEX13 SCNN1B TECTA ATP6V0A COL4A5 ERCC6 GNAS KCNJ1 NAGA PEX SCNN1G TERT ATP6V1B1 COL6A1 ERCC8 GNE KCNJ11 NAGLU PEX6 SCO1 TFR Pag. 7 di 8

8 ATP7A COL6A ESCO GNMT KCNJ13 NAGS PEX5 SCO TG Pag. 8 di 8