RICERCA NEI CAMPIONI CLINICI DI MYCOBACTERIUM SPP.

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1 METODO NAZIONALE STANDARD RICERCA NEI CAMPIONI CLINICI DI MYCOBACTERIUM SPP. BSOP 40 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluation and Standards Laboratory Pagina 1 di 27 BSOP 40i5

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2006). Investigation of. specimens for Mycobacterium species. National Standard Method VSOP 40 Emissione 5. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 27

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE... 5 INFORMAZIONI TECNICHE CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE PRELIEVO DEL CAMPIONE TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO, QUANTITA E NUMERO DI CAMPIONI, E METODO DI PRELIEVO TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E LA PROCEDURA ANALITICA ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO PROCEDURA SUL CAMPIONE SELEZIONE DELLA PROVA ASPETTO MICROSCOPIA COLORAZIONE TRATTAMENTO DEL CAMPIONE CULTURA E MODALITA DI RICERCA SISTEMI AUTOMATICI DI MONITORAGGIO TERRENI DI COLTURA, CONDIZIONI E MICRORGANISMI PER TUTTI I CAMPIONI IDENTIFICAZIONE SENSIBILITA AGLI ANTIMICROBICI PROCEDURE DI REFERTAZIONE MICROSCOPIA COLTURA PROVE DI SENSIBILITA SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR INFECTIONS) RINGRAZIAMENTI E CONTATTI 22 BIBLIOGRAFIA Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 27

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato BSOP 40 Ricerca nei campioni clinici di Mycobacterium spp. Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data 5/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica Intero documento Riscritta ed aggiornata Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 27

5 RICERCA NEI CAMPIONI CLINICI DI MYCOBACTERIUM SPP. Tipologia dei campioni Espettorato Liquidi corporei sterili (LCR, liquido pleurico ecc) Cute e tessuti bioptici Pus (incluso i tamponi) Midollo osseo Sangue Lavaggio gastrico Urine Feci Tamponi laringei Lavaggio bronco-alveolare Campioni post-mortem SCOPO DEL DOCUMENTO Le procedure di seguito riportate sono state sviluppate per la ricerca e l isolamento dei micobatteri da diversi campioni clinici. Per decontaminare i campioni si raccomanda di usare tre metodi diversi, ma, non essendo dimostrata la superiorità di nessuno di loro, i laboratori avranno libera scelta in merito. Per garantire una maggior possibilità d isolamento si raccomandano l uso di metodi automatizzati e di terreni solidi. L applicazione delle tecnologie fenotipiche e di quelle molecolari consente l approccio più efficace per la diagnosi di laboratorio delle malattie tubercolari e non tubercolari. In questo Metodo Nazionale Standard non sono descritti trattamento, prevenzione e controllo della TB che sono riportati nel NICE tuberculosis clinical guideline 2 sviluppati dal National Centre for Chronic Conditions. INTRODUZIONE La tubercolosi umana (TB) è causata prevalentemente dal Mycobacterium tuberculosis e meno frequentemente da altri membri del M. tuberculosis complex (MTBC) che include M. bovis e M. africanum. I micobatteri diversi dai bacilli tubercolari (MOTT) sono sempre più frequentemente riscontrati come causa di malattia nell uomo. Non tutte le persone che sono infettate da bacilli tubercolari sviluppano malattia, e non tutti quelli che sono infettati divengono infettivi per gli altri. La malattia contagiosa si può sviluppare mesi od anni dopo l esposizione iniziale. Teoricamente la tubercolosi si può manifestare in qualsiasi sede corporea 3, ma è prevalente nei polmoni, nei quali si caratterizza per la formazione del granuloma. Si definisce tubercolosi primaria l insorgenza di un infezione da microrganismi MTBC. Nell infezione primaria la lesione si manifesta nel sito d ingresso del microrganismo, solitamente il polmone, sebbene possano essere coinvolte le tonsille, l intestino e la cute. In questo primo stadio possono essere infettati anche i linfonodi (complesso primario). La positivizzazione del test cutaneo alla tubercolina, che compare dopo 3 8 settimane dall infezione, indica la comparsa dell immunità cellulare e dell ipersensibilità cutanea. I foci che si sviluppano nell endotelio dei vasi sanguigni possono rompersi determinando una tubercolosi miliare disseminata. La tubercolosi post primaria si sviluppa come conseguenza della riattivazione dei microrganismi in una lesione primaria guarita o per una nuova infezione esogena 4. La tubercolosi post primaria si manifesta di solito dopo cinque o più anni dall inizio dell infezione primaria e può interessare i bambini e gli adulti 5. Solo in pochi casi l infezione da M. tuberculosis progredisce come malattia clinica. L incidenza della linfadenite cervicale e d altre manifestazioni non polmonari della TB sono più frequenti in soggetti di etnia asiatica 6. La carenza di vitamina D, frequentemente riscontrata in immigrati dall India 7, può essere un fattore predisponente. Tubercolosi polmonare L infezione si realizza inizialmente con l inalazione di droplet nuclei 8. Una volta in situ, i microrganismi possono essere catturati dalle cellule fagocitarie dell ospite entro le quali possono rimanere vitali ed anche continuare a moltiplicarsi 9. Da questo focus primario (focus di Ghon), i microrganismi diffondono per via linfatica nei linfonodi e possono Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 27

6 raggiungere il torrente circolatorio, infettando il polmone e gli altri organi. Nella maggior parte dei soggetti i foci granulomatosi possono guarire. In ogni modo essi possono continuare a contenere microrganismi vitali. Fattori quali immunosoppressione, alcolismo, malnutrizione ed invecchiamento possono contribuire ad una riduzione della capacità di contenimento dell infezione. La diagnosi di TB polmonare si avvale di solito del contemporaneo riscontro di lesioni radiografiche del torace, reattività alla prova cutanea della tubercolina, e/o un risultato positivo per BAAR (bacilli acido alcol resistenti), che giustificano l inizio di una terapia in attesa dei risultati colturali 10. Si deve fare ogni sforzo per ottenere campioni idonei per la coltura in quanto la prova di sensibilità in vitro dell isolato diviene sempre più importante a seguito delle emergenti resistenze multiple ai farmaci, e la tipizzazione per essere utilizzata per dimostrare correlazioni epidemiologiche 11. Tubercolosi extra-polmonare Linfoadenite: è la più frequente forma d infezione extra-polmonare da micobatteri che, se causata da bacilli tubercolari, era nota come scrofola. I linfonodi cervicali sono quelli più frequentemente infettati sebbene possano esserne interessati altri 10. Gli ascessi possono sviluppare formazioni cavitarie. Nel Regno Unito la più frequente forma di linfoadenopatia pediatrica è causata da microrganismi appartenenti al M. avium complex (MAC) e M. malmoense 12. Con frequenza più ridotta, possono causare linfoadenopatia anche i MOTT. Tubercolosi miliare: il termine è stato introdotto per descrivere l aspetto a semi di miglio (nella radiografia del torace) delle lesioni infette, ma attualmente è utilizzata genericamente per descrivere tutte le manifestazioni ematogene progressive di tubercolosi disseminata. Neurotubercolosi Tubercolosi meningea è di solito causata dalla rottura di un tubercolo nello spazio subaracnoidale piuttosto che da una diffusione ematogena alle meningi. Le manifestazioni cliniche iniziano di solito con malessere, cefalea intermittente e febbricola, seguiti entro due settimane da cefalea persistente, vomito, confusione, meningismo e sintomi neurologici di tipo focale 13. La mortalità è superiore nei soggetti con < di 5 e > di 50 anni o in quelli in cui la malattia ha durata superiore a 2 mesi 14. La diagnosi di meningite tubercolare si avvale di un fondato sospetto clinico. Sebbene in questi casi il quadro liquorale presenti tipicamente un aumento del numero dei leucociti (GB) con predominanza dei linfociti, queste cellule possono essere assenti, mentre in alcuni pazienti, si osserva una prevalenza di granulociti polimorfonucleati 15. Le proteine del LCR sono di solito aumentate. Se si prelevano più campioni di LCR aumentano le probabilità di ottenere risultati positivi all esame batterioscopico e delle colture 14. Tubercolosi gastrointestinale era comunemente riscontrata in epoca pre-antibiotica nei pazienti con forma polmonare diffusa da ingestione delle secrezioni polmonari infette. Può essere causata dal M, tuberculosis o, in alcune aree rurali dal M. bovis, dopo alimentazione con latte infetto non pastorizzato. La diagnosi di TB gastrointestinale è spesso ottenuta con l endoscopia. La biopsia tissutale prelevata nell organo coinvolto fornisce il maggior numero di microrganismi per strisci e colture dei BAAR. Tubercolosi peritoneale si manifesta in forma di ascite (essudativa) o adesiva (asciutta). La forma ascitica è caratterizzata dalla presenza di liquido fluttuante, quella adesiva da aderenze fibrotiche e rigonfiamento addominale 16. Tubercolosi genitourinaria è infrequente prima della pubertà 10. L intervallo fra esordio dell infezione e sviluppo di malattia renale attiva è di solito molto lungo (anni o decenni). Con il progredire dell infezione, le lesioni del rene possono divenire caseose, con conseguente eliminazione di BAAR vitali nella pelvi renale e nell uretere, e l infezione può diffondersi poi alla vescica. L analisi dell urina rileva spesso proteinura, ematuria e piuria sterile 17. Tubercolosi ossea articolare e della colonna vertebrale sono di solito espressione di un infezione polmonare primaria che si diffonde all osso per via ematogena. Sono fattori predisponesti, deficit immunitari ed uso di droghe per via endovenosa 10. Sono più frequentemente coinvolte le articolazioni che sostengono pesi, quali il ginocchio e l anca 18. Per la diagnosi di TB ossea e delle articolazioni si usano strisci e colture di materiale bioptico, esame istologico e prova di reattività cutanea. La TB della colonna vertebrale (morbo di Pott) si localizza più frequentemente nella parte toracica inferiore e nelle aree lombari superiori. Si manifesta Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 27

7 principalmente nella tarda età pediatrica, nei giovani adulti e nell età avanzata, producendo un collasso vertebrale con conseguente deformazione della colonna. Batteriemia causata da Mycobacterium spp. si riscontra con sempre maggior frequenza dopo l aumento della progressiva diffusione dell infezione da HIV (Human Immunodeficiency Virus) e dell AIDS (Acquired Immune Deficiency Sindrome). Nei pazienti HIV positivi con infezione da Mycobacterium tuberculosis si possono avere emocolture positive con frequenza del 63% 19. Isolamento di Mycobacterium spp. si può avere da pazienti con altri tipi di immunodepressione quali la leucemia 20, 21. Sono state segnalate batteriemie da MOTT 22 26, la maggior parte delle quali causate da micobatteri appartenenti al Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC) 27. Le concentrazioni batteriemiche possono essere molto elevate e sono state riportate conte di 1-17 x 10 6 UFC/L 28. Ascesso tubercolare dello psoas origina da infezioni toraciche e della colonna vertebrale e diffonde all interno della guaina del muscolo psoas, talvolta estendendosi fino alla coscia. Tubercolosi e HIV/AIDS La ricomparsa della TB è strettamente correlata all epidemia causata dall HIV. Hanno subito l incremento più elevato di TB i gruppi a maggior rischio, quali i drogati per via endovenosa e le aree degli USA e dell Africa, nelle quali si sono registrate le più elevate percentuali d infezione da HIV. Povertà, sovra affollamento e mancanza di abitazioni sono i fattori socioeconomici comuni per la coesistenza d entrambe le infezioni da TB ed HIV. I pazienti infetti da HIV sono predisposti alla riattivazione di una pregressa TB ed anche ad una rapida progressione di un infezione acquisita di recente 29. Diverse specie del gruppo MOTT sono state isolate da infezioni sistemiche in pazienti HIV positivi, la più frequente è risultata la MAC. Tubercolosi multi-resistente ai farmaci (MDR-TB, multi drug resistant TB) Negli anni recenti sono stati segnalati in aumento in tutto il mondo i casi di TB resistenti ad uno od a più farmaci. M. tuberculosis diviene resistente ai farmaci per mutazione spontanea occasionale 30, 31. Si definisce resistenza primaria quella che si manifesta in pazienti che sono infettati da un ceppo gia resistente. La resistenza secondaria si manifesta quando un mutante resistente emerge nel corso dell infezione da un microrganismo originariamente sensibile, di solito conseguente a chemioterapia inadeguata. I regimi terapeutici per i MDR-TB tendono ad essere meno efficaci e più prolungati rispetto alla terapia per i TB sensibili. Micobatteri diversi dai bacilli tubercolari MOTT (Mycobacteria other than tubercle bacilli) I micobatteri diversi dai bacilli tubercolari sono conosciuti come agenti di malattia nell uomo dal Queste specie di Mycobacterium sono state variamente riportate come micobatteri non tubercolari, micobatteri ambientali, micobatteri anonimi, micobatteri atipici e micobatteri opportunisti. I MOTT sono ubiquitari e per l uomo presentano uno spettro di patogenicità variabile, sono trasmessi da persona a persona e sono spesso resistenti alla classica terapia anti-tubercolare 33. Sono state descritte circa novanta specie di micobatteri e più della metà sono riconosciute patogene obbligate od opportuniste per l uomo e gli animali. Specie a crescita lenta I sistemi automatici di coltura in fase liquida disponibili nel Regno Unito sono stati saggiati per verificare la loro capacità di rilevare un ampio spettro di micobatteri a crescita lenta e rapida; in ogni caso non si deve limitare la ricerca solo all isolamento delle specie dei micobatteri, specialmente se le indagini sono eseguite in pazienti immunocompromessi. I limiti di questi sistemi sono: incubazione ad una sola temperatura e difficoltà di aggiungere additivi di crescita necessari ad alcuni batteri particolarmente esigenti. Possono esser richiesti consigli ai Laboratori di Riferimento. Mycobacterium avium complex (MAC) Il M. avium complex (MAC) è un gruppo di microrganismi eterogeneo che include M. intracellulare, ma anche alcuni gruppi di micobatteri tassonomicamente non ben definiti. Nei soggetti immunocompetenti, i microrganismi MAC possono invadere l albero bronchiale, aree di bronchiectasie pre-esistenti o cavità presenti da lungo Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 27

8 tempo. MAC sono stati descritti come causa di linfoadenopatia cervicale nei bambini. Sono spesso presenti negli approvvigionamenti idrici e possono contaminare i campioni. Mycobacterium kansasii La più frequente malattia causata da M. kansasii è l infezione polmonare. Il microrganismo è fotocromogeno e si isola prevalentemente da pazienti con pre-esistente malattia polmonare cronica o con pneumoconiosi. Mycobacterium malmoense Il M. malmoense causa malattia polmonare in pazienti adulti e linfoadenopatia cervicale nei bambini. Tipicamente i pazienti sviluppano un infezione polmonare. La diagnosi d infezione da M. malmoense è simile a quella di M. kansasii, sebbene possa essere richiesta un incubazione fino a 12 settimane prima dello sviluppo di colonie rilevabili sui terreni solidi 34. Mycobacterium xenopi Le infezioni da M. xenopi possono essere simili a quelle TB polmonare e si riscontrano frequentemente in pazienti di sesso maschile con più di 45 anni affetti da HIV/AIDS. E un microrganismo termofilo con temperatura ottimale d incubazione a C. Può svilupparsi in grado minore e più lentamente anche a C. Mycobacterium marinum Il M. marinum è l agente causale del granuloma degli acquari, o delle piscine ; è una lesione cutanea localizzata che si manifesta in corrispondenza di una ferita esposta o di un abrasione, in seguito a contatto con l acqua di acquari, piscine o con acqua naturale sia dolce che salata. Questa specie ha uno sviluppo moderato con temperatura ottimale a C 35. Mycobacterium gordanae Questa è una specie comune nelle acque, sono stati riportati rari e controversi casi di malattia nei pazienti con HIV/AIDS. E un frequente contaminante dei campioni clinici. Specie a rapida crescita Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum Sono specie correlate e note come causa d infezioni della cute e dei tessuti molli 36. I microrganismi sono stati riscontrati nei liquidi di lavaggio da broncoscopia e possono essere associati a false positività nelle ricerche diagnostiche. Nei pazienti con fibrosi cistica il Mycobacterium abscessus è ritenuto un potenziale patogeno 37. Sebbene siano state riscontrate variazioni nelle sottospecie, la temperatura ottimale di crescita di questi microrganismi è compresa fra 30 e 33 C. Nuove tecnologie per la diagnosi e la tipizzazione del Mycobacterium tuberculosis Nuovi metodi su sangue intero per la diagnosi di tubercolosi latente La ricerca della tubercolosi latente è essenziale per il rilievo dei contatti e per il controllo di un epidemia. La prova cutanea con la tubercolina (TST, tubercolin skin test) è stata di consuetudine la più comunemente utilizzata per la ricerca dell infezione latente da Mycobacterium tuberculosis. Questa procedura non è comunque esente da problemi quali: variabilità dell interpretazione, risultati falsamente positivi e negativi, limitato periodo di scadenza della proteina purificata (PPD, purified protein derivative), soggettività della valutazione dei risultati, non disponibilità di controlli per la valutazione della prova 38, 39. Inoltre i micobatteri ambientali e la vaccinazione con il Bacillo di Calmette-Guèrin (BCG), derivato dal Mycobacterium bovis, di solito forniscono risultati falsamente positivi 38. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 27

9 Per la diagnosi di tubercolosi latente è quindi sorta la necessità di un test più affidabile, sensibile e specifico. Per soddisfare questa esigenza sono stati sviluppati metodi su sangue intero in grado di rilevare presenza di linfociti T attivati dal M. tuberculosis o l interferone gamma prodotto da queste cellule 38, 40. Lo scopo delle ricerche è quello di identificare persone a maggior rischio di TB che possono trarre beneficio dal trattamento terapeutico della loro infezione latente. Questi soggetti sono individuabili ad esempio negli operatori sanitari e nei soggetti che hanno avuto contatti recenti con pazienti affetti da tubercolosi attiva ed in quelli affetti da patologie cliniche, quali diabete mellito, leucemia e linfoma. Il test QuantiFERON-TB GOLD determina l IFN-gamma, importante marcatore ematico della risposta immunologia cellulo-mediata alla tubercolosi Taggart ed al hanno segnalato che il test QuantiFERON-TB GOLD evidenzia una specificità precoce nella rilevazione dell infezione da microrganismi del M. tuberculosis complex in vari gruppi di pazienti. Nello screening della popolazione ciò può consentire una valutazione più specifica del rischio ed il superamento dei molti limiti attuali del TST. Anche il T Spot TB si è dimostrato un test particolarmente accurato per la tubercolosi, capace di rilevare l infezione latente e la forma attiva con elevato grado di sensibilità e specificità 40. La prova si basa sul conteggio dei linfociti T ematici attivati da specifici antigeni del M. tuberculosis. Analizzando un campione di sangue intero di soggetti ad elevato rischio di tubercolosi si può ottenere un risultato in 24 ore. I risultati non sono influenzati da una precedente vaccinazione con BCG o dalla presenza di ceppi di micobatteri ambientali 40. E in grado inoltre di diagnosticare la tubercolosi subclinica attiva in pazienti immunodepressi nei quali la prova cutanea alla tubercolina è risultata falsamente negativa 41. Analisi con matrici ad alta densità genomica di M. tuberculosis isolati da epidemie e da gruppi con TB Le epidemie sporadiche di tubercolosi sono uno dei principali rischi per la salute pubblica nei paesi industrializzati ed in quelli in via di sviluppo. L individuazione precoce ed accurata dei ceppi epidemici è fondamentale per la gestione ed il controllo di potenziali epidemie da TB. Recentemente è stato segnalato un test basato sulla PCR per la tipizzazione dei ceppi epidemici mediante analisi con microarray genomici sul DNA estratto 42. La tecnologia è in grado di differenziare con certezza gli isolati epidemici confrontandoli con un archivio di cloni di riferimento. Grazie alla sua capacità di determinare con esattezza i ceppi epidemici questo metodo rapido di biologia molecolare consente un approccio mirato alla sorveglianza ed al controllo delle epidemie di TB. Prove di amplificazione dell acido nucleico Le prove di amplificazione dell acido nucleico (NAAT, nucleic acid amplification tests) sono particolarmente utili in alcune situazioni, quali quelle di pazienti con sospetta tubercolosi in cui la microscopia è ripetutamente negativa. Più del 50% dei casi microscopico-negativi, positivi poi alla coltura, possono essere rapidamente diagnosticati con i NAAT. Tuttavia non sono disponibili per un uso generalizzato NAAT sufficientemente validati e ottimali per la ricerca del M. tuberculosis. Questi test devono essere usati con attenzione e limitati a circostanze particolari. INFORMAZIONI TECNICHE I campioni inviati per l esame colturale dei micobatteri appartengono a due categorie: quelli normalmente contaminati con flora residente e quelli provenienti da aree normalmente sterili. I campioni contaminati richiedono, prima della coltura, una fase di decontaminazione per ridurre la possibilità di crescita eccessiva di microrganismi diversi dai micobatteri; tuttavia un eccessiva decontaminazione dei campioni deve essere evitata in quanto può essere responsabile di risultati falsamente negativi 44..Per eseguire le colture per micobatteri i laboratori devono essere accreditati e disporre di un Controllo di Qualità Interno, ed aver ottenuto risultati soddisfacenti nella Valutazione Esterna di Qualità relativa ai vari livelli del servizio fornito, quali esame microscopico, coltura, identificazione e prove di sensibilità. Si deve ricordare che sebbene il piruvato di sodio aumenti la crescita del M. bovis, questo composto inibisce alcune specie di micobatteri atipici. Per quanto riguarda le centrifugazione, il suo tempo totale deve essere opportunamente incrementato dei tempi richiesti dallo strumento per raggiungere la velocità opportuna, e per l arresto. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 9 di 27

10 Sono state segnalate nei laboratori colture falsamente positive per contaminazione crociata e la loro percentuale è del 3,1% 45. La contaminazione crociata deve essere evitata utilizzando pipette separate e decontaminanti e altri reagenti aliquotati. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 10 di 27

11 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE Adeguati contrassegni di rischio in accordo con le strategie locali. Fare riferimento alle linee guida HSE/COSHH sulla raccolta e la sicurezza nella manipolazione dei campioni e per il contenimento di microrganismi del Gruppo di Rischio TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE Contenitori sterili a tenuta, chiusi in sacchetti di plastica. 1.3 PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE Processare tutti i campioni in cabine microbiologiche di sicurezza in ambiente con Livello di Contenimento 3. Eseguire tutte le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza microbiologica in ambiente con Livello di Contenimento 3. Usare piastre riscaldate in cabina microbiologica di sicurezza in ambiente con Livello di Contenimento 3 Per la centrifugazione utilizzare contenitori chiusi. Aprirli al termine della centrifugazione all interno di cabine di sicurezza microbiologica. I disinfettanti fenolici sono utilizzati in contenitori dedicati allo scarto dei liquidi di rifiuto. Riempire a metà un recipiente per la raccolta dei rifiuti con disinfettante fenolico al 10% ed versarvi il materiale da eliminare. Alla fine della giornata riempire il contenitore con acqua per ottenere la concentrazione di lavoro del 5% e lasciare agire per una notte. Eliminare secondo le indicazioni dei protocolli locali. Per la disinfezione delle superfici delle cabine microbiologiche di sicurezza e per la pulizia delle parti esterne della strumentazione utilizzare disinfettanti fenolici secondo le indicazioni del produttore. Trasferire direttamente in autoclave e sterilizzare immediatamente il materiale pronto per lo scarto. Utilizzare preferibilmente materiali di plastica monouso anziché quelli in vetro. NOTA: La fissazione al calore non uccide i micobatteri 53. I vetrini devono essere manipolati con attenzione (consultare la sezione 4.3). Riporre e trasportare i contenitori dei campioni in supporti progettati per ridurre al minimo la loro rottura e le perdite. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto 54. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 27

12 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO OTTIMALE DI PRELIEVO DEL CAMPIONE Per la diagnosi iniziale di infezione da micobatteri tutti i campioni devono essere stati prelevati di recente e possibilmente prima dell inizio del trattamento anti tubercolare. 2.2 TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO, QUANTITA E NUMERO DI CAMPIONI, E METODO DI PRELIEVO Campioni di espettorato per ridurre al minimo la contaminazione i campioni devono essere stati prelevati di recente (da meno di 1 giorno). I migliori campioni sono quelli purulenti. Di prima mattina, per tre giorni consecutivi, devono essere raccolti circa 5 ml per ogni campione 55. In caso di tosse secca, prima dell espettorazione possono essere utili fisioterapia, drenaggio posturale o inalazione di aerosol con fisiologica. Lavaggio gastrico: è di solito utilizzato nei bambini quando sono presenti problemi di espettorazione. Raccogliere per 3 giorni consecutivi i campioni di prima mattina (prima della colazione) 55. Deve essere prodotto preferibilmente un volume minimo di 5 ml. Gli aspirati devono essere prelevati e processati rapidamente per evitare il deterioramento dei microrganismi dovuto all acidità del materiale. I risultati dell esame microscopico diretto del lavaggio gastrico possono essere fuorvianti perché i bacilli acido resistenti sono normalmente presenti nello stomaco. Fluidi corporei sterili (LCR, liquido pleurico ecc.) non richiedono la decontaminazione e possono essere seminati direttamente in terreni neutri, comunque, se richiesto, possono essere trattati con acido. Per il LCR raccogliere in modo asettico il maggior volume possibile in un contenitore sterile. Per gli altri liquidi è richiesto un volume massimo di 1L. Se dopo la prima puntura lombare è disponibile un volume ridotto ed i risultati dei conteggi cellulari e della concentrazione delle proteine fanno sospettare una meningite TB, deve essere considerata l opportunità di un secondo prelievo con l intento di ottenere un maggiore volume di campione per aumentare le possibilità di colture positive. Campioni urinari devono essere raccolti di primo mattino per tre giorni consecutivi in un contenitore universale. Se non sono disponibili contenitori per un campione completo di urine di primo mattino (UPM), può essere accettato un campione di UPM da mitto intermedio, anche se questa alternativa non è la migliore. Cute/tessuti o campioni autoptici di qualsiasi tipo devono essere omogeneizzati. Se si riceve un pezzo voluminoso può essere necessario selezionare e tagliare una parte appropriata di tessuto. In modo analogo, alcuni frammenti di tessuto possono richiedere di essere sminuzzati con bisturi e forbici sterili prima di essere omogeneizzati in modo adeguato. Prelevare asetticamente i campioni in contenitore sterile privo di conservanti aggiungendo acqua distillata sterile per prevenire l essiccamento. Selezionare, se possibile, una parte caseosa: la maggior parte dei microrganismi è presente alla periferia della lesione caseosa. Inviare il campione più voluminoso possibile. Campioni fecali presentano particolari problemi di contaminazione. Il loro valore è discutibile e di solito non sono inviati, anche se possono essere importanti nei pazienti immunocompromessi con malattia disseminata. E comunque vero che i micobatteri (alcune specie) possono essere responsabili di patologie intestinali. La coltura non è la miglior tecnica disponibile e deve essere eseguita solo se il clinico ne conosce completamente le problematiche. Pus o pus prelevato con tamponi deve essere raccolto in modo asettico e deve essere inviato il maggior volume possibile in un contenitore sterile. Tamponi laringei in alcuni pazienti rappresentano un alternativa all espettorato. I migliori sono di alginato di calcio che si dissolvono (entro certi limiti) in idrossido di sodio possono essere trattati come un campione di espettorato. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 12 di 27

13 Midollo osseo: prelevare la massima quantità possibile di campione ed aggiungerla direttamente al terreno di coltura. Lavaggio bronco-alveolare/lavaggio bronchiale: deve essere evitata la contaminazione del broncoscopio con acqua di rubinetto in quanto può contenere specie ambientali di micobatteri. Il volume minimo richiesto è preferibilmente di 5mL. Le emocolture devono essere seminate per prime per evitare la contaminazione nel caso in cui siano richiesti, sullo stesso campione di sangue, altri esami quali l emogas-analisi o la VES. E preferibile prelevare separatamente il sangue per l emocoltura. 57. La cute deve essere disinfettata nel sito di prelievo con etanolo o alcol isopropilico, lasciato poi asciugare. NOTA: l EDTA, anche in tracce, inibisce la crescita delle specie di Mycobacterium. 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile. 3.2 ACCORGIMENTI SPECIALI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO Campioni diversi dal sangue: refrigerare se il trasporto in laboratorio o l inizio dell analisi avviene dopo più di un ora. Lavaggi gastrici: se la procedura analitica avviene dopo più di 4 ore neutralizzare aggiungendo 100 mg di carbonato di sodio a circa 50 ml del campione 58. Emocolture: trasportare ed inserire il più presto possibile nel sistema automatico per emocolture. 4.0 PROCEDURA SUL CAMPIONE 4.1 SELEZIONE DELLA PROVA N/D 4.2 ASPETTO Liquidi corporei sterili: Ricercare la presenza di ogni tipo di coagulo, e se presente, includerlo nel materiale da analizzare. Registrare l eventuale presenza di sangue, ciò costituisce un utile informazione per stabilire il significato clinico dell eventuale successivo isolamento di micobatteri opportunisti. Biopsie dei tessuti: Analizzare tutto il tessuto se il campione è di piccole dimensioni. Selezionare il materiale caseoso (se presente) ed il tessuto circostante per approntare uno striscio ed eseguire la coltura di campioni voluminosi. MICROSCOPIA Eseguire l esame microscopico dopo omogeneizzazione e prima della decontaminazione dei campioni. 1. Centrifugare i campioni in contenitori chiusi a 3000 x g per 15 minuti Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 13 di 27

14 2. Scartare con attenzione il sopranatante in un recipiente contenente un disinfettante idoneo (ad esempio Hycolin, in concentrazione tale da raggiungere, dopo il versamento del supernatante di scarto, diluizione al 5% v/v) 3. Preparare uno striscio sottile del sedimento su un solo vetrino e fissare al calore su una piastra riscaldata (65 C 75 C). Collocare in seguito su un idoneo portavetrini o altro supporto. Colorare con metodo dell Auramina-fenolo *E importante che la centrifugazione sia eseguita con un appropriata Forza di Centrifugazione Relativa (FCR -). Questa varia da centrifuga a centrifuga ed è proporzionale alla lunghezza del braccio del rotore e alla velocità di rotazione. Non deve essere confusa con la velocità di Rotazione per Minuto (RPM). Nota: L esame dello striscio deve essere garantito per almeno sei giorni lavorativi alla settimana PREPARAZIONE DEGLI STRISCI Strisci di espettorato: Strisciare il sedimento ottenuto per centrifugazione dal campione trattato e (possibilmente) concentrato con un ansa di plastica su un vetrino, mantenendosi lontani dai margini 59. Non approntare strisci troppo sottili. Liquidi corporei sterili: Preparare gli strisci come in precedenza (strisci dell espettorato) dal sedimento dopo centrifugazione. Per il LCR può essere opportuno strisciare il materiale in strati successivi. Tessuto: Gli strisci dei tessuti garantiscono una sensibilità più elevata se preparati con tecniche istologiche, cioè colorando sezioni seriali con il metodo di ZN modificato. Si possono eseguire strisci diretti, ma questi sono solitamente poco sensibili. Se il materiale disponibile è scarso, la coltura dei tessuti prelevati di recente è il metodo diagnostico più sensibile perché fornisce il maggior numero di informazioni per il trattamento del paziente. Tamponi: Non esaminare con microscopica tamponi da prelievo unico, per prevenire una possibile contaminazione. L esame microscopico è indicato se si ricevono un paio di tamponi, oppure un tessuto associato ad un tampone con pus. Sangue: Eseguire l esame microscopico su ogni flacone che il sistema colturale automatizzato segnala come positivo o è giudicato positivo visivamente. Rimuovere poche gocce di miscela sangue/brodo trasferendole su un vetrino da microscopio pulito. Strisciare il campione con ansa sterile per ottenere uno strato sottile per la colorazione specifica dei microrganismi acido resistenti. 4.4 COLORAZIONE DEGLI STRISCI La colorazione Auramina-fenolo è più sensibile della Ziehl-Neelsen e pertanto più idonea per la valutazione di strisci da materiali clinici 59, 60. La colorazione di Ziehl-Neelsen consente l osservazione di dettagli morfologici ed è utile nell esame delle colture positive per BAAR, ma non è utilizzata per confermare i risultati dei campioni clinici positivi all Auramina fenolo. Prima del loro utilizzo nella routine, colorare dei vetrini di controllo, positivo e negativo, fissati in precedenza, con i nuovi lotti di Auramina-fenolo e Ziehl-Neelsen. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 14 di 27

15 4.4.1 COLORAZIONE DI STRISCI FISSATi AL CALORE CON AURAMINA-FENOLO PER LA RICERCA CON MICROSCOPIA IN FLUORESCENZA DI MICRORGANISMI ALCOL ACIDO RESISTENTI IN CAMPIONI CLINICI Versare sul vetrino il colorante Auramina-fenolo di recente preparazione e attendere per 10 minuti 2. Lavare con acqua e asciugare il vetrino 3. Versare il decolonizzante a base di acido-alcol (1% v/v) e lasciare agire per 3 5 minuti 4. Allontanare il decolorante acido-alcol e aggiungere il colorante di contrasto da lasciare agire per secondi Il colorante di contrasto è composto da: Rosso Tiazina 0.02% p/v in soluzione acquosa Permanganato di potassio 1% 5. Sciacquare con acqua e porre il vetrino ad asciugare su un supporto inclinato 6. Esaminare ad ingrandimento a 25x o 40x con microscopio ad epi-fluorescenza (ingrandimenti con obiettivi a 40x non richiedono coprioggetto) NOTA: Se si utilizzano confezioni commerciali seguire le indicazioni del produttore COLORAZIONE CON ZIEHL-NEELSEN DI STRISCI FISSATI AL CALORE PER LA RICERCA DI MICRORGANISMI ALCOOL ACIDO RESISTENTI NELLE COLTURE POSITIVE Coprire il vetrino con cabol fuxina concentrata 2. Scaldare in modo moderato e lasciare per 3-5 minuti a partire da quando si ha sviluppo di vapori 3. Lavare accuratamente con acqua 4. Decolorare per 2-3 minuti con una soluzione di acido alcol (al 3% v/v), lavare con acqua, aggiungere nuovamente acido-alcol per 3-4 minuti fino a quando il vetrino assume una debole colorazione rosa 5. Lavare accuratamente con acqua 6. Controcolorare per 30 secondi con di blu di metilene o verde malachite (1% p/v) 7. Lavare con acqua e lasciare asciugare 8. Applicare l olio di immersione e leggere con microscopio a luce trasmessa NOTA: Se si utilizzano confezioni commerciali seguire le indicazioni del produttore. 4.5 TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Di seguito sono descritti i tre metodi di decontaminazione/digestione attualmente utilizzati per trattare i campioni. Non sono disponibili rilievi o valutazioni per raccomandare un metodo ottimale. La scelta del metodo appropriato ed il tempo di azione variano in funzione del grado contaminazione del campione. I laboratori devono controllare il grado di contaminazione e ridurla al minimo livello. NOTA: I campioni da sedi sterili non devono essere trattati prima della loro coltura. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 15 di 27

16 4.5.1 CAMPIONI DA SEDI NON STERILI Questo metodo è appropriato per i seguenti campioni: Espettorato Lavaggio gastrico Lavaggio bronco-alveolare/lavaggio bronchiale Feci Tamponi laringei Omogeneizzazione è una fase importante per migliorare la sensibilità della coltura. Questa procedura può essere ottenuta aggiungendo specifiche sostanze, come di seguito specificato o prolungando la miscelazione del campione su vortex fino alla sua omogeneizzazione. L omogenizzazione può essere ottenuta con i seguenti metodi: Trattamento con ditiotreitolo Sciogliere i campioni utilizzando ditiotreitolo (Sputasol TM ) in eccesso e agitando su vortex fino all omogeneizzazione del campione Centrifugare a 3000x per 15 minuti e scartare il sopranatante in un contenitore contenente disinfettante, lasciando 1 ml di sedimento Trattamento con N-acetil-L cisteina (NALC): Includere la NALC nella fase di decontaminazione (consultare decontaminazione dei campioni con NALC.NaOH) Decontaminazione dei campioni può essere ottenuta usando i metodi seguenti. Il tempo delle diverse fasi deve essere riveduto da ogni laboratorio in funzione della percentuale di contaminazione. I laboratori che utilizzano sistemi di coltura automatizzati devono fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per l utilizzo di metodi di decontaminazione compatibili. Decontaminazione dei campioni con NaOH 0.5 N: 1. Aggiungere al campione 7 ml di NaOH (0.5 N) 2. Lasciare agire l NaOH (0.5 N) per 25 minuti, passare su vortex ad intervalli regolari. Questa è una fase importante che deve essere eseguita in modo esatto Decontaminazione dei campioni con NALC-NaOH 1. Aggiungere al campione un uguale volume di soluzione di NALC-NaOH (NALC 2% e NaOH 0.5 N, preparata da non più di 24 ore) 2. Agitare la provetta su vortex per non più di 20 secondi. Capovolgere la provetta in modo che NALC NaOH entri in contatto con l intera superficie della provetta. Evitare agitazioni eccessive 3. Per decontaminare il campione lasciare riposare la provetta per 25 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 16 di 27

17 Neutralizzazione I laboratori che utilizzano sistemi di coltura automatizzati devono fare riferimento alle raccomandazioni del produttore relative ai metodi di decontaminazione compatibili. Neutralizzare il campione con 14 ml di KH 2 PO 4 OPPURE Diluire la sospensione con tampone fosfato sterile M (ph 6.8) fino ad un volume di almeno 20 ml e capovolgere alcune volte per miscelare il contenuto CAMPIONI CON PESANTE CONTAMINAZIONE DA BATTERI GRAM NEGATIVI Questo metodo è idoneo per i seguenti materiali: Urine Cute o tessuto bioptico da sedi non sterili Campioni bioptici post mortem Feci Pus, aspirati e liquidi Pretrattamento Centrifugare tutti i campioni liquidi (LCR, urine, liquido pleurico e pus) in contenitori chiusi a 3000x per 15 minuti Aprire i contenitori e decantare con attenzione il sopranatante in un recipiente di scarto contenente un disinfettante fenolico, quale l Hycolin (facendo in modo da ottenere una diluizione, una volta aggiunto il sopranatante, pari al 5% v/v) Omogeneizzare i campioni di tessuto e trasferirli in un comune contenitore sterile. Con un bisturi sterile tagliare il tessuto in piccoli frammenti. Inserire una parte del campione in una piccola provetta sterile da conservare a -20 C per l eventuale ripetizione della coltura in caso di contaminazione. Decontaminazione 1. Aggiungere un uguale volume di H 2 SO 2 (0.5N) a tutti i campioni liquidi/tessuti e lasciare agire l acido per minuti. I tempi delle diverse fasi devono essere riveduti in funzione delle percentuali di contaminazione rilevate nei singoli laboratori per i diversi tipi di campione 2. Dopo il trattamento, riempire il contenitore con acqua distillata e centrifugare a 3000x per 15 minuti. Scartare il sopranatante in un recipiente per la raccolta dei rifiuti lasciando circa 1 ml di sedimento Neutralizzazione Neutralizzare il campione con NaOH (0.5 %) CAMPIONI CONTAMINATI DA PSEUDOMONAS SPP. Questo metodo è adatto per l espettorato o per i campioni respiratori di pazienti con fibrosi cistica e bronchite che sono presumibilmente colonizzati da Pseudomonas aeruginosa. Omogeneizzazione Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 17 di 27

18 Consultare la sezione Decontaminazione 1. Aggiungere al campione una quantità sufficiente di acido ossalico al 3% fino a riempire un normale contenitore di plastica 2. Lasciare agire l acido per 30 minuti (o più a lungo se necessario) agitando ad intermittenza per facilitare l omogeneizzazione e la decontaminazione 3. Centrifugare il campione per 15 minuti a 3000x g 4. Decantare il sopranatante in un contenitore con disinfettante Neutralizzazione Neutralizzare il campione con NaOH (0.5N). 4.6 COLTURA E RICERCA I campioni di LCR, sangue e quelli prelevati da sedi normalmente sterili non richiedono la decontaminazione. Per escludere altre cause d infezione, oltre alla coltura per micobatteri, su questi campioni devono essere eseguite colture per la ricerca di altri patogeni (consultare BSOP 27 Ricerca sul liquido cerebrospinale, BSOP 37 Ricerca su emocolture per microrganismi diversi da Mycobacterium spp.). Ciò consente anche di escludere la presenza di batteri non-tubercolari o di evidenziare la necessità di procedure di decontaminazione. A questo punto prendere in considerazione: la necessità di ricorrere a prove di biologia molecolare. Centrifugare il LCR prima dell esecuzione della coltura e della preparazione dello striscio. Utilizzare la quantità restante del sedimento e del sopranatante (se disponibile) per la coltura. Per i campioni di LCR, dopo la semina su terreni di coltura idonei, aggiungere al contenitore originale un terreno di coltura liquido ed incubare con gli altri terreni. Omogeneizzare i tessuti e le biopsie e, se necessario, decontaminarli. Seminare con tecnica asettica direttamente sulla superficie dei terreni solidi o nei terreni di arricchimento i tessuti bioptici e di osso sminuzzati in piccoli frammenti SISTEMI AUTOMATICI DI MONITORAGGIO I sistemi automatici di coltura sono raccomandati per una più rapida ed agevole ricerca della crescita dei micobatteri. I sistemi automatici segnalano lo sviluppo dei micobatteri rilevando il consumo di ossigeno o la produzione di CO 2. Questi sistemi riducono la media del tempo richiesto a giorni 62, 63. I terreni solidi devono essere utilizzati comunque 64, 65. Si raccomanda l utilizzo di un Lowenstein Jensen contenente piruvato per ottimizzare la crescita del M. bovis. Alcuni micobatteri atipici possono non produrre segnali di crescita nei terreni liquidi e la possibilità di un loro utilizzo esclusivo è ancora in fase di valutazione. I terreni solidi sono indispensabili per alcuni tipi di campione, come la cute, quando si devono utilizzare temperature d incubazione differenziate. I sistemi automatici di coltura sono pure utilizzati per le prove di sensibilità, con riduzione del tempo di risposta dei risultati a 4-12 giorni. NOTA: Se il campione ha un volume insufficiente per tutte le indagini richieste, le prove da eseguire devono essere selezionate su indicazione clinica (consultare BSOP 27 Ricerca sul liquido cerebrospinale). Al termine dell incubazione, seguendo le indicazioni del produttore, per ridurre il rischio di falsi negativi, le colture negative dei sistemi automatici in terreno liquido, prima di essere scartate, devono essere controllate visivamente per rilevare l eventuale sviluppo di crescita. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 18 di 27

19 4.6.2 COLTURA Tutti i campioni vengono analizzati nel modo seguente: 1. Seminare con 0.2 ml di campione trattato sulla superficie di un tubo di Lowenstein Jensen contenente piruvato (LJ) usando pipette graduate, sterili, monouso, ed in un terreno di coltura liquido (usando il volume appropriato secondo le indicazioni del produttore) 2. Seminare i campioni prelevati dalle sedi superficiali, quale la cute, su due set di terreni, uno dei quali è incubato a C 3. Inclinare i terreni a becco di clarino in modo da consentire al campione di seminare l intera superficie. Verificare che il tappo sia chiuso ermeticamente 4. incubare i tubi a C per settimane, verificando le colture ogni settimana per individuare un possibile sviluppo di bacilli alcol-acido resistenti 5. Preparare i flaconi di terreno liquido secondo le istruzioni del produttore 6. Registrare i flaconi delle colture liquide nel sistema ed incubare secondo le indicazione del produttore. Per piccoli volumi di LCR incubare fino a 10 settimane 7. Conservare il sedimento avanzato, non trattato, nell eventualità che i campioni richiedano la decontaminazione. Non conservare aliquote di LCR, l intero volume deve essere posto in coltura per ottimizzare la percentuale d isolamento 8. Seguire le indicazioni del produttore quando il sistema segnala una coltura positiva 9. Confermare con colorazione di Ziehl Neelsen la presenza nelle colture di Bacilli Acido Alcol Resistenti (BAAR) 10. Inviare al Laboratorio di Riferimento aliquote delle colture confermate positive (in piccole fiale/provette sterili, con tappo a vite a tenuta) secondo le regolamentazioni postali e di trasporto Se nessun BAAR è stato isolato da un flacone o da un terreno solido positivi, eseguire la colorazione di Gram per verificare la presenza di contaminazione 12. Verificare la contaminazione dopo la fase di decontaminazione usando piastre di verifica della purezza (non necessarie per alcuni sistemi in fase liquida) NOTA: Entro il primo giorno lavorativo dal ricevimento tutti i campioni devono essere seminati in terreno liquido (sistemi automatici) e sui terreni solidi convenzionali. Dal laboratorio deve essere fornito un servizio di sei giorni settimanali per garantire gli standard raccomandati dal Department of Health. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 19 di 27

20 4.7 TERRENI DI COLTURA, CONDIZIONI E MICRORGANISMI PER TUTTI I CAMPIONI Aspetti clinici/ condizioni Terreni standard Incubazione Temp C Atmosfera Tempo Lettura colture Microrganismo(i) ricercato Tutti i campioni Sistemi automatici in terreno liquido Aerobica Seguire le istruzioni del produttore Continua Mycobacterium spp E LJ + piruvato settimane 34 Sangue Sistemi automatici In terreno liquido Aerobica Seguire le istruzioni del produttore Continua Mycobacterium spp Per queste situazioni, aggiungere quanto segue Aspetti clinici/ condizioni Terreni supplementari Incubazione Temp C Atmosfera Tempo Lettura colture Microrganismi ricercati Infezioni cutanee granuloma da acquario Ulcere cutanee LJ + piruvato Aerobica 12 settimane Settimanale M. marinum M. ulcerans (Ulcera di Buruli) Se si usano sistemi automatici di monitoraggio, dopo aver eseguito la decontaminazione, fare riferimento ai protocolli locali ed alle raccomandazioni del produttore 4.8 IDENTIFICAZIONE Livello minimo Livello di genere Mycobacterium (definito dalla colorazione di Ziehl Neelsen sullo striscio della coltura) Inviare al Laboratorio di Riferimento NOTA: inviare solo isolati positivi per BAAR. Contattare il Laboratorio di Riferimento per l invio di colture. Revisione no: 5 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 20 di 27