cobas HEV Test degli acidi nucleici per l'uso sui cobas 6800/8800 Systems Per uso diagnostico in vitro cobas HEV 96 P/N:

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1 Test degli acidi nucleici per l'uso sui cobas 6800/8800 Systems Per uso diagnostico in vitro cobas HEV 96 P/N: cobas HEV Control Kit P/N: cobas NHP Negative Control Kit P/N:

2 Indice generale Uso previsto... 4 Riassunto e spiegazione del test... 4 Reagenti e materiali... 7 Reagenti e controlli cobas HEV... 7 Reagenti cobas omni per la preparazione dei campioni Requisiti per la conservazione e la manipolazione dei reagenti Materiali aggiuntivi necessari Strumentazione e software necessari Precauzioni e requisiti per l'uso Avvertimenti e precauzioni Manipolazione dei reagenti Buone pratiche di laboratorio Raccolta, trasporto, conservazione e creazione di pool di campioni Campioni di donatori viventi Istruzioni per l'uso Pipettamento automatico dei campioni e creazione di pool (opzionale) Note sulla procedura Esecuzione del test cobas HEV Risultati Controllo di qualità e validità dei risultati Interpretazione dei risultati Test di ripetizione su singolo campione Limiti della procedura Valutazione delle prestazioni non cliniche Caratteristiche delle prestazioni Campioni di donatori viventi Limite di sensibilità (LOD) Doc Rev

3 Riproducibilità Verifica del genotipo Specificità analitica Specificità analitica e sostanze interferenti Correlazione Tasso globale d'errore del sistema Informazioni supplementari Caratteristiche del test Produttore e distributori Marchi e brevetti Copyright Bibliografia Revisione del documento cobas HEV Doc Rev

4 Uso previsto Il test cobas HEV è un test qualitativo per l'amplificazione dell'acido nucleico in vitro, destinato alla rilevazione diretta dell'rna del virus dell'epatite E (Hepatitis E Virus, HEV), genotipi 1-4, nel plasma umano. Il test è destinato all'uso nello screening dell'rna di HEV in campioni di plasma di singoli donatori umani, inclusi donatori di sangue intero, emocomponenti (globuli rossi, piastrine e plasma) e altri donatori viventi. Per lo screening del plasma di tutti i donatori, è possibile analizzare i campioni individualmente. Per lo screening del sangue intero e degli emocomponenti, è possibile analizzare i campioni di plasma individualmente o in pool costituiti da aliquote di singoli campioni. Questo test non è destinato all'uso con campioni di sangue da cordone ombelicale. Questo test non è destinato all'uso per la diagnosi di HEV. Riassunto e spiegazione del test Premessa: screening del sangue per rilevare infezioni virali trasmesse tramite trasfusione Il virus dell'epatite E (HEV), un piccolo virus a RNA privo di involucro, appartenente al genere Hepevirus (famiglia Hepeviridae), è un patogeno umano con diffusione in tutto il mondo. 1 Il virus è costituito da una particella icosaedrale che racchiude un genoma costituito da un singolo filamento di RNA a senso positivo di 7,2 kb. 2 Sono stati identificati quattro genotipi HEV principali, che rappresentano un singolo sierotipo, negli uomini e negli animali (inclusi suini domestici, cinghiali, cervi e roditori). 1,3,4 La caratterizzazione molecolare dei diversi ceppi di HEV in circolazione tra gli uomini e gli animali ha portato all'identificazione di quattro genotipi principali. 1 Il genotipo 1, diffuso principalmente in Asia, e il genotipo 2, diffuso in Africa e in Messico, sono circoscritti agli uomini e si trasmettono attraverso l'acqua contaminata nei Paesi in via di sviluppo. 1,5 I genotipi 3 e 4 infettano uomini, maiali e altri mammiferi, causando sporadicamente casi di HEV autoctono sia nei Paesi in via di sviluppo, sia nei Paesi sviluppati. 6 Il genotipo 3 è l'unico attualmente identificato come causa di infezione autoctona negli USA 7 ed è inoltre la causa della maggioranza delle infezioni in Europa, Nuova Zelanda e Nord America. 1,8-12 Entrambi i genotipi 3 e 4 sono presenti in Giappone. 1 I genotipi HEV 1, 3 e 4 sono endemici in Cina. 1 L'epatite E acuta è più comune dell'epatite A in Cina, Francia, Regno Unito e Giappone. 1 La principale modalità di trasmissione dell'hev è la via oro-fecale, attraverso l'ingestione di acqua potabile contaminata, 1 anche se sono stati segnalati casi di trasmissione alimentare dovuta al consumo di carne di maiale, organi interni o molluschi crudi o poco cotti, e casi di trasmissione zoonotica dovuti al contatto con maiali e altri animali domestici o selvatici infetti. 7,13 La gamma completa delle fonti del virus HEV non è nota. 1 L'infezione da HEV provoca in genere un'infezione lieve, o subclinica, con una patologia autolimitante che può durare da 4 a 6 settimane. 1,8-11,17,18 I sintomi sono molto simili a quelli di altre forme di infezione da epatite virale, in particolare l'epatite A, e comprendono spossatezza, itterizia, febbre, malessere, nausea, vomito, anoressia e dolore addominale. 1 Spesso i pazienti presentano livelli elevati di alanina transaminasi (~1.500 UI/l) e molti presentano itterizia. 1 Occasionalmente le infezioni da HEV possono essere più gravi e provocare un'insufficienza epatica fulminante, specialmente nelle donne in gravidanza (per le quali il tasso di mortalità si attesta tra il 10% e il 25%), nei neonati e nei bambini sotto i 2 anni, nei pazienti con patologie epatiche pregresse (ad esempio, cirrosi) e nei soggetti immunocompromessi. 1,19-23 Ogni anno l'infezione da HEV causa oltre 3 milioni di casi sintomatici di epatite E e circa decessi. 24 Il tasso di mortalità complessivo è compreso tra lo 0,2% e il 4,0%. 1,25 Molti dei decessi causati dal genotipo 3 (HEV3) sono dovuti a insufficienza epatica acuta o subacuta in pazienti con patologie epatiche preesistenti, ad esempio insufficienza epatica collegata all'alcol. 1,22,26,27 Doc Rev

5 L'HEV3 può causare un'infezione cronica nel 60% degli individui immunodepressi infetti, il 10% circa dei quali sviluppa una cirrosi. 1 L'infezione si definisce cronica quando l'rna di HEV è persistente nel siero o nelle feci per almeno 6 mesi. 1 Molti di questi casi si verificano nei ricevitori di trapianto di organi solidi, sebbene siano stati riferiti anche casi di infezione in soggetti con malattie ematologiche che ricevono trasfusioni e chemioterapia e in alcuni soggetti con HIV Non sono state riferite infezioni croniche da HEV1 o HEV2. 1 L'infezione da HEV è associata anche ad alcune sindromi neurologiche, come la sindrome di Guillain-Barré, la paralisi di Bell, la mielite trasversa acuta, la meningoencefalite acuta, l'atassia, e l'encefalite. In genere i sintomi neurologici si risolvono nei pazienti che si liberano del virus. 1 Durante un'infezione acuta da HEV sono state riferite glomerulonefrite membrano-proliferativa e membranosa, pancreatite acuta e trombocitopenia severa, anche se non sono stati determinati i meccanismi patofisiologici o le eventuali relazioni causali. 1 La terapia con ribavirina si è dimostrata efficace nella cura dell'infezione severa acuta da HEV3. I ricevitori di trapianti con infezione cronica da HEV sono in genere trattati con riduzione dell'immunosoppressione (specialmente i farmaci che colpiscono le cellule T), interferone-α e ribavirina. 1 Perché utilizzare i test degli acidi nucleici Come altri virus responsabili delle epatiti, anche l'hev può essere trasmesso attraverso trasfusioni di sangue o di prodotti ematici. L'epatite E post-trasfusionale è stata osservata in molti Paesi. 1,34-39 A livello mondiale, il tasso di sieropositività all'hev tra i donatori di sangue è variabile tra lo 0,4% e il 20,6% Le infezioni asintomatiche da HEV si manifestano a un tasso elevato nel mondo e, a causa della prevalenza del virus, molti donatori di sangue potrebbero essere infetti e trasmettere il virus ai ricevitori dei loro prodotti ematici. Ad esempio, un recente studio sui donatori di sangue in Gran Bretagna ha rilevato che l'11% dei sieri dei donatori era reattivo alle IgG di HEV (prova di trascorsa infezione), mentre lo 0,7% dei sieri dei donatori era reattivo alle IgM (prova di infezione acuta). 46 Inoltre lo 0,7% dei minipool di plasma dei donatori inglesi conteneva l'rna di HEV. 47 Uno studio sui donatori di sangue in Cina ha prodotto risultati analoghi: il 32,6% dei sieri dei donatori era reattivo alle IgG, lo 0,94% dei sieri dei donatori era reattivo alle IgM e lo 0,07% delle donazioni era caratterizzato da viremia per l'hev. 48 Un'indagine globale sui pool di frazionamento del plasma ha evidenziato che il 10% dei pool analizzati era positivo all'rna di HEV. 48,49 Spiegazione del test Il test cobas HEV è un esame PCR qualitativo, destinato alla rilevazione dell'rna di HEV, che viene eseguito sul cobas 6800 System e sul cobas 8800 System. Il test cobas HEV consente la rilevazione simultanea dell'rna di HEV e del controllo interno in un unico test, da eseguire su una donazione di plasma individuale infetto, o su un pool di plasma costituito da più donazioni individuali. Principi della procedura Il test cobas HEV si basa sulla preparazione dei campioni completamente automatizzata (estrazione e purificazione dell'acido nucleico) e sulla successiva amplificazione e rilevazione mediante PCR. I cobas 6800/8800 Systems sono costituiti dal modulo di inserimento dei campioni, dal modulo di trasferimento, dal modulo di preparazione e dal modulo analitico. La gestione automatizzata dei dati è affidata al software cobas 6800/8800, che assegna risultati non reattivi, reattivi o non validi a tutti i test. I risultati possono essere visualizzati direttamente sullo schermo del sistema o stampati in un report. È possibile analizzare i campioni uno ad uno oppure creare un pool costituito da più campioni e analizzarlo. Il cobas p 680 instrument è uno strumento opzionale che viene utilizzato in un passaggio pre-analitico nel caso in cui debbano essere eseguiti i pool. Doc Rev

6 Gli acidi nucleici del campione e delle molecole di Armored RNA del controllo interno (IC) aggiunto, che funge da controllo del processo di preparazione e amplificazione/rilevazione del campione, vengono estratti simultaneamente. Inoltre il test utilizza due controlli esterni, uno positivo e uno negativo. Gli acidi nucleici virali vengono rilasciati grazie all'aggiunta della proteinasi e del reagente di lisi nel campione. Dopo il loro rilascio, gli acidi nucleici si legano alla superficie di silice delle biglie di vetro magnetiche aggiunte. Le sostanze che non formano legami e le impurità (ad esempio proteine denaturate, detriti cellulari e potenziali inibitori della PCR, come l'emoglobina) vengono rimosse nei passaggi successivi con il reagente di lavaggio, mentre gli acidi nucleici purificati vengono eluiti dalle biglie di vetro magnetiche con il tampone di eluizione a temperature elevate. Per ottenere l'amplificazione selettiva dell'acido nucleico target dal campione del donatore vengono utilizzati dei primer forward e reverse che sono specifici del virus e sono selezionati da regioni altamente conservate dell'acido nucleico virale. Un enzima DNA polimerasi termostabile viene utilizzato sia per la trascrizione inversa che per l'amplificazione. La soluzione Master Mix contiene trifosfato di deossiuridina (dutp) anziché trifosfato di deossitimidina (dttp), che è incorporato nel DNA appena sintetizzato (amplicone) Tutti gli ampliconi contaminanti che sono stati prodotti da sessioni precedenti di PCR verranno distrutti dall'enzima AmpErase [uracil-n-glicosilasi] contenuto nella soluzione Master Mix per PCR, durante il riscaldamento nel primo passaggio del ciclo termico. Al contrario, gli ampliconi che si sono appena formati non verranno distrutti perché l'enzima AmpErase si inattiva dopo l'esposizione a temperature superiori a 55 C. La soluzione cobas HEV contiene sonde di rivelazione specifiche per gli acidi nucleici del virus HEV e del controllo interno (IC). Ognuna delle sonde di rivelazione specifiche per HEV e IC è marcata con uno dei due fluorocromi univoci, che agiscono da rivelatori (reporter). Ogni sonda include anche un secondo fluorocromo, che agisce da soppressore (quencher). Le misurazioni dei due fluorocromi reporter vengono effettuate a lunghezze d'onda fisse, consentendo così l'identificazione e la discriminazione dei target dell'hev amplificato e del controllo interno (IC). 53,54 I segnali fluorescenti delle sonde intatte sono soppressi dal fluorocromo quencher. Nella fase di amplificazione mediante PCR, le sonde ibridizzano con lo stampo specifico di DNA a filamento unico e vengono scisse dall'attività nucleasica in direzione 5' 3' della DNA polimerasi, con la conseguente separazione dei fluorocromi reporter e quencher e la produzione di un segnale fluorescente. Con ogni ciclo di PCR viene generata una quantità crescente di sonde scisse e, parallelamente, si assiste all'aumento del segnale cumulativo del fluorocromo reporter. Poiché le misurazioni dei due fluorocromi reporter avvengono a lunghezze d'onda fisse, è possibile consentire la rilevazione e la discriminazione simultanea dei target amplificati dell'hev e del controllo interno (IC). Doc Rev

7 Reagenti e materiali Reagenti e controlli cobas HEV Tutti i reagenti e i controlli non ancora aperti devono essere conservati rispettando le condizioni indicate dalla Tabella 1 alla Tabella 4. Tabella 1 cobas HEV test cobas HEV Test Conservare a 2-8 C Cassetta per 96 test (P/N ) Componenti del kit Ingredienti del reagente Quantità per kit 96 test Soluzione proteinasi (PASE) Controllo Interno (IC) Tampone di eluizione (EB) Master Mix Reagente 1 (MMX-R1) HEV Master Mix Reagente 2 (HEV MMX-R2) Tampone Tris, < 0,05% EDTA, cloruro di calcio, acetato di calcio, 8% proteinasi (p/v) EUH210: Scheda dati di sicurezza disponibile su richiesta. EUH208: Può provocare una reazione allergica. Contiene: Subtilisina, Tampone Tris, < 0,05% EDTA, < 0,001% costrutto di Armored RNA del controllo interno (RNA non infettivo, incapsulato in MS2 batteriofaga), < 0,002% Poly ra RNA (sintetico), < 0,1% sodio azide Tampone Tris, 0,2% metil-4 idrossibenzoato Acetato di manganese, idrossido di potassio, < 0,1% sodio azide Tampone tricina, acetato di potassio, glicerolo, 18% dimetil sulfoxide, Tween 20, EDTA, < 0,06% datp, dgtp, dctp, < 0,14% dutp, < 0,01% primer upstream e downstream di HEV e IC, < 0,01% sonde fluorescenti di HEV, < 0,01% sonda fluorescente IC, < 0,01% aptamero oligonucleotidico, < 0,01% DNA polimerasi Z05D, < 0,01% enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) (batterico), < 0,1% sodio azide 13 ml 13 ml 13 ml 5,5 ml 6 ml Doc Rev

8 Tabella 2 cobas HEV Control Kit cobas HEV Control Kit Conservare a 2-8 C (P/N ) Componenti del kit Ingredienti del reagente Quantità per kit Simbolo di sicurezza e avvertimento Controllo positivo HEV (HEV (+) C) < 0,001% RNA sintetico (armored) di HEV incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2, plasma umano normale, non reattivo ai test brevettati per gli anticorpi anti- HCV, anti-hiv-1/2, HBsAg, anti-hbc, RNA di HIV-1, RNA di HIV-2, RNA di HCV, DNA di HBV, RNA di HEV, RNA di WNV e DNA di CMV non rilevabili con i metodi PCR. 0,1% Conservante ProClin ml (16 x 1 ml) Avvertimento H317: Può provocare una reazione allergica cutanea. P261: Evitare di respirare la polvere/i fumi/ i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. P272: Gli indumenti da lavoro contaminati non devono essere portati fuori dal luogo di lavoro. P280: Indossare guanti protettivi. P302 + P352: IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE, lavare abbondantemente con acqua e sapone. P333 + P313: In caso di irritazione o eruzione della pelle: consultare un medico. P363: Lavare gli indumenti contaminati prima di indossarli nuovamente. Doc Rev

9 Tabella 3 cobas NHP Negative Control Kit cobas NHP Negative Control Kit Conservare a 2-8 C (P/N ) Componenti del kit Ingredienti del reagente Quantità per kit Simbolo di sicurezza e avvertimento Controllo negativo di plasma umano normale (NHP-NC) Plasma umano normale, non reattivo ai test brevettati per gli anticorpi anti-hcv, anti- HIV-1/2, HBsAg, anti-hbc; RNA di HIV-1, RNA di HIV-2, RNA di HCV, DNA di HBV, RNA di HEV, RNA di WNV e DNA di CMV non rilevabili con i metodi PCR. 16 ml (16 x 1 ml) Avvertimento < 0,1% Conservante ProClin 300 H317: Può provocare una reazione allergica cutanea. P261: Evitare di respirare la polvere/i fumi/ i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. P272: Gli indumenti da lavoro contaminati non devono essere portati fuori dal luogo di lavoro. P280: Indossare guanti protettivi. P302 + P352: IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE, lavare abbondantemente con acqua e sapone. P333 + P313: In caso di irritazione o eruzione della pelle: consultare un medico. P363: Lavare gli indumenti contaminati prima di indossarli nuovamente. Doc Rev

10 Reagenti cobas omni per la preparazione dei campioni Tabella 4 Reagenti cobas omni per la preparazione dei campioni* Reagenti Ingredienti del reagente Quantità per kit Simbolo di sicurezza e avvertimento cobas omni MGP Reagent (MGP) Conservare a 2 8 C (P/N: ) cobas omni Specimen Diluent (SPEC DIL) Conservare a 2 8 C (P/N: ) cobas omni Lysis Reagent (LYS) Conservare a 2 8 C (P/N: ) cobas omni Wash Reagent (WASH) Conservare a C (P/N: ) Biglie di vetro magnetiche, tampone Tris, 0,1% metil-4 idrossibenzoato, < 0,1% sodio azide Tampone Tris, 0,1% metil-4 idrossibenzoato, < 0,1% sodio azide 42,56% (p/p) guanidina tiocianato, 5% (p/v) polidocanolo, 2% (p/v) ditiotreitolo, citrato di sodio diidrato Citrato di sodio diidrato, 0,1% metil-4 idrossibenzoato 480 test Non disponibili 4 x 875 ml Non disponibile 4 x 875 ml Pericolo H302: Nocivo per ingestione. H318: Provoca gravi lesioni oculari. H412: Nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. EUH032: A contatto con acidi libera gas molto tossici. P301 + P312: IN CASO DI INGESTIONE: in caso di malessere, contattare un CENTRO ANTIVELENI o un medico. P264: Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. P270: Non mangiare, né bere, né fumare durante l uso. P273: Non disperdere nell'ambiente. P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/ Proteggere gli occhi/il viso. P305 + P351 + P338: IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. P310: In caso di malessere, contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI o un medico. P330: Sciacquare la bocca. 4,2 litri Non disponibili * Questi reagenti non sono inclusi nel kit di test cobas HEV. Vedere elenco dei materiali aggiuntivi necessari (Tabella 7). Doc Rev

11 Requisiti per la conservazione e la manipolazione dei reagenti I reagenti devono essere conservati e manipolati rispettando le condizioni indicate dalla Tabella 5 alla Tabella 6. I reagenti che non sono ancora stati caricati sui cobas 6800/8800 Systems devono essere conservati alla temperatura indicata nella Tabella 5. Tabella 5 Reagente Conservazione dei reagenti (non ancora caricati sul sistema) Temperatura di conservazione cobas HEV Test 96 cobas HEV Control Kit cobas NHP Negative Control Kit cobas omni Lysis Reagent cobas omni MGP Reagent cobas omni Specimen Diluent cobas omni Wash Reagent 2-8 C 2-8 C 2-8 C 2-8 C 2-8 C 2-8 C C Dopo il caricamento sui cobas 6800/8800 Systems, i reagenti sono conservati alla temperatura appropriata e la data di scadenza viene monitorata dal sistema. Il sistema consente l'utilizzo dei reagenti soltanto se sono rispettate tutte le condizioni descritte nella Tabella 6. Il sistema impedisce automaticamente l'uso dei reagenti scaduti. La Tabella 6 fornisce all'utente informazioni utili sulle condizioni di manipolazione dei reagenti previste per i cobas 6800/8800 Systems. Tabella 6 Scadenza dei reagenti sui cobas 6800/8800 Systems Reagente Data di scadenza del kit Stabilità del kit aperto Numero di sedute per cui il kit può essere usato Stabilità a bordo (tempo cumulativo a bordo fuori dal frigorifero) cobas HEV Test 96 Data non superata 30 giorni dal primo utilizzo Max 10 sedute Max 8 ore cobas HEV Control Kit cobas NHP Negative Control Kit Data non superata Data non superata Non disponibili Non disponibile Max 8 ore Non disponibili Non disponibile Max 8 ore cobas omni Lysis Reagent Data non superata 30 giorni dal caricamento* Non disponibile Non disponibile cobas omni MGP Reagent Data non superata 30 giorni dal caricamento* Non disponibile Non disponibile cobas omni Specimen Diluent Data non superata 30 giorni dal caricamento* Non disponibile Non disponibile cobas omni Wash Reagent Data non superata 30 giorni dal caricamento* Non disponibile * Il calcolo inizia dalla prima volta che il reagente viene caricato sui cobas 6800/8800 Systems. Non disponibile Doc Rev

12 Materiali aggiuntivi necessari Tabella 7 Materiali e consumabili da utilizzare sui cobas 6800/8800 Systems Materiale P/N cobas omni Processing Plate cobas omni Amplification Plate cobas omni Pipette Tips cobas omni Liquid Waste Container cobas omni Lysis Reagent cobas omni MGP Reagent cobas omni Specimen Diluent cobas omni Wash Reagent Sacchetto per rifiuti solidi Contenitore per rifiuti solidi Strumentazione e software necessari Il software cobas 6800/8800 e il pacchetto di analisi cobas HEV verranno installati sullo strumento (o sugli strumenti). Il server IG (Instrument Gateway) verrà fornito con il sistema. Tabella 8 Strumentazione Apparecchiatura P/N cobas 6800 System (opzione mobile) e cobas 6800 System (fisso) e cobas 8800 System cobas p 680 instrument (opzionale, per il pipettamento e la creazione di pool) Modulo di inserimento dei campioni Per ulteriori informazioni sui tubi primari e secondari accettati dagli strumenti, consultare il Manuale Operatore dei cobas 6800/8800 Systems e il Manuale Operatore del cobas p 680 instrument. Nota: contattare il rappresentante Roche locale per richiedere un listino dettagliato dei rack per campioni, dei rack per puntali otturati e dei vassoi portarack accettati dagli strumenti. Doc Rev

13 Precauzioni e requisiti per l'uso Avvertimenti e precauzioni Come richiesto per qualsiasi procedura di analisi, per lo svolgimento di questo test è necessario attenersi alle buone pratiche di laboratorio. Data l'elevata sensibilità di questo test, fare attenzione ad evitare la contaminazione dei reagenti e delle miscele di amplificazione. Solo per uso diagnostico in vitro. Tutti i campioni e i controlli devono essere manipolati come materiale a rischio biologico, seguendo le buone procedure di laboratorio descritte in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories e nel documento M29-A3 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 38,39 Questa procedura deve essere eseguita esclusivamente da personale esperto nella manipolazione di materiale a rischio biologico e nell'uso del test cobas HEV, dei cobas 6800/8800 Systems e del cobas p 680 instrument (opzionale). Tutti i materiali di origine umana devono essere considerati a rischio biologico e quindi manipolati adottando precauzioni universalmente valide. In caso di fuoriuscita accidentale, disinfettare immediatamente l'area con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua distillata o deionizzata (diluire la candeggina domestica 1:10) oppure seguire le procedure previste dal proprio laboratorio. I kit cobas HEV Control Kit e cobas NHP Negative Control Kit contengono plasma derivato da sangue umano. Il materiale di provenienza è stato analizzato con test degli anticorpi brevettati ed è risultato non reattivo agli anticorpi anti-hcv, anti-hiv-1/2, HBsAg e anti-hbc. I test basati sui metodi PCR eseguiti sul plasma umano normale hanno inoltre confermato l'assenza di RNA di HEV, RNA di HIV-1 (gruppi M e O), RNA di HIV-2, RNA di HCV, DNA di HBV, RNA di WNV e DNA di CMV. Allo stato attuale, tuttavia, nessun metodo di analisi garantisce con assoluta certezza che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Non congelare il sangue intero. È consigliato l'uso di pipette sterili monouso e puntali di pipettamento privi di nucleasi. Per garantire prestazioni ottimali del test, utilizzare soltanto i consumabili forniti o consigliati. Le schede di sicurezza (Safety Data Sheets, SDS) possono essere richieste al rappresentante Roche locale. Per un corretto svolgimento del test, attenersi scrupolosamente alle procedure e alle linee guida approvate. Qualunque deviazione dalle procedure e dalle linee guida approvate potrebbe compromettere le prestazioni del test. Potrebbero essere generati risultati falsi positivi senza un'adeguata prevenzione dell'effetto carryover durante la manipolazione e la preparazione dei campioni. Doc Rev

14 Manipolazione dei reagenti Manipolare tutti i reagenti, i controlli e i campioni seguendo le buone pratiche di laboratorio, al fine di prevenire il carryover dei campioni e dei controlli. Prima dell'uso ispezionare visivamente ogni cassetta dei reagenti, del diluente, del reagente di lisi e del reagente di lavaggio per confermare l'assenza di perdite. In caso di perdite accertate, non utilizzare il materiale per il test. Il reagente di lisi cobas omni contiene guanidina tiocianato, una sostanza chimica potenzialmente pericolosa. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. I kit cobas HEV Test, cobas omni MGP Reagent e cobas omni Specimen Diluent contengono sodio azide come conservante. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita dei reagenti, diluire il liquido con acqua prima di asciugare. Evitare che il reagente di lisi cobas omni, contenente guanidina tiocianato, entri in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). L'eventuale miscela potrebbe produrre gas altamente tossici. Smaltire tutti i materiali entrati in contatto con i campioni e i reagenti nel rispetto dei regolamenti previsti a livello locale, nazionale e internazionale. Buone pratiche di laboratorio Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro designate. Indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit. Per evitare contaminazioni è necessario sostituire i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti dei kit cobas HEV e cobas omni. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli. Lavare accuratamente le mani dopo avere manipolato i reagenti dei kit e dopo aver rimosso i guanti. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro del laboratorio con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% e acqua deionizzata o distillata (candeggina per uso domestico diluita 1:10). Successivamente pulire la superficie con etanolo al 70%. In caso di fuoriuscita di liquidi sui cobas 6800/8800 Systems, seguire le istruzioni contenute nel Manuale Operatore dei cobas 6800/8800 Systems per pulire accuratamente e decontaminare la superficie dello strumento (o degli strumenti). Doc Rev

15 Raccolta, trasporto, conservazione e creazione di pool di campioni Nota: manipolare tutti i campioni e i controlli come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Conservare tutti i campioni dei donatori alle temperature indicate. La stabilità dei campioni risente delle temperature elevate. Campioni di donatori viventi Con il test cobas HEV è possibile utilizzare plasma raccolto in EDTA, CPD, CPDA1, CP2D e sodio citrato al 4% (plasmaferesi) come anticoagulante. Per la manipolazione e la centrifugazione, attenersi alle istruzioni fornite dal produttore della provetta/sacca di raccolta del campione. Il sangue raccolto in anticoagulante EDTA, CPD, CPDA1, CP2D o in provette BD PPT (Becton-Dickinson EDTA Plasma Preparation Tubes) può essere conservato per un massimo di 12 giorni alle seguenti condizioni: o I campioni devono essere centrifugati entro e non oltre 72 ore dal prelievo. o Se conservati a più di 8 C, i campioni sono stabili per 72 ore fino a 25 C (e per 24 ore fino a 30 C nell'arco delle 72 ore). A parte nei casi sopra descritti, i campioni devono essere conservati a 2-8 C. Il plasma separato dalle cellule può inoltre essere conservato per 30 giorni a <-18 C con tre cicli di congelamento/scongelamento. Vedere la Figura 1. Figura 1 Condizioni di conservazione dei campioni 30 Anticoagulante EDTA, CPD, CPDA1, CP2D o PPT Temperatura ( C) 25 8 Sangue intero 2 < Plasma congelato (congelato/scongelato max 3 volte) Il plasma da aferesi raccolto in citrato di sodio al 4% può essere conservato per 30 giorni a 2-8 C. o Se conservati a più di 8 C, i campioni sono stabili per 72 ore fino a 25 C (e per 24 ore fino a 30 C nell'arco delle 72 ore). Per un'eventuale spedizione, imballare ed etichettare i campioni come previsto dai regolamenti nazionali e/o internazionali per il trasporto di campioni e agenti eziologici Giorni Doc Rev

16 Istruzioni per l'uso Pipettamento automatico dei campioni e creazione di pool (opzionale) Il cobas p 680 instrument è un componente opzionale dei cobas 6800/8800 Systems, utilizzato per il pipettamento automatico e la creazione di pool di campioni dalle aliquote di più campioni primari. Per ulteriori informazioni, consultare il Manuale Operatore del cobas p 680 instrument. Note sulla procedura Non utilizzare i reagenti cobas HEV Test, cobas HEV Control Kit, cobas NHP Negative Control Kit cobas omni oltre la data di scadenza. Non riutilizzare i consumabili. Sono esclusivamente monouso. Per informazioni sulla corretta manutenzione degli strumenti, consultare il Manuale Operatore dei cobas 6800/8800 Systems. Esecuzione del test cobas HEV La procedura del test è descritta dettagliatamente nel Manuale Operatore dei cobas 6800/8800 Systems e nel Manuale Operatore del cobas p 680 instrument. Nella Figura 2 è illustrata una sintesi della procedura. Figura 2 Procedura del test cobas HEV Doc Rev

17 Risultati I cobas 6800/8800 Systems identificano l'rna di HEV in modo automatico e simultaneo per i campioni e i controlli. Controllo di qualità e validità dei risultati Insieme ad ogni batch vengono analizzati un controllo negativo [( ) C] e un controllo positivo [HEV (+) C]. Nel software cobas 6800/8800 e/o nel report verificare se sono presenti flag e risultati ad essi associati per confermare la validità del batch. Il batch è valido se non sono presenti flag per nessuno dei due controlli. I risultati vengono automaticamente considerati non validi dal software cobas 6800/8800 in caso di fallimento del controllo negativo e dei controlli positivi. Flag dei controlli Tabella 9 Flag per i controlli positivi e negativi Controllo negativo Flag Risultato Interpretazione ( ) C Q02 Invalid L'intero batch è considerato non valido se il risultato del controllo ( ) C non è valido. Controllo positivo Flag Risultato Interpretazione HEV (+) C Q02 Invalid L'intero batch è considerato non valido se il risultato del controllo HEV (+) C non è valido. Se il batch non è valido, è necessario ripetere il test sull'intero batch, compresi campioni e controlli. Doc Rev

18 Interpretazione dei risultati Se un batch è valido, verificare nel software cobas 6800/8800 e/o nel report se sono presenti flag per ogni singolo campione. I risultati dovranno essere interpretati applicando i seguenti criteri: Un batch valido può includere risultati sia validi che non validi per i campioni dei donatori, a seconda di quali sono i flag associati ai singoli campioni. I risultati dei campioni sono validi soltanto se sono validi i controlli positivi e il controllo negativo del batch corrispondente. Per ogni campione vengono misurati simultaneamente due parametri: HEV e controllo interno. I risultati finali del test cobas HEV per i campioni sono visualizzati nel software. Oltre ai risultati generali, nel software cobas 6800/8800 vengono visualizzati anche i risultati dei singoli target, che dovranno essere interpretati applicando i seguenti criteri: Tabella 10 Risultati per i singoli target e relativa interpretazione Risultati dei target Non reattivo all'hev Reattivo all'hev Non valido Interpretazione Nessun segnale rilevato per il target HEV; segnale IC rilevato. Rilevato il segnale per il target HEV; segnale IC rilevato o non rilevato. Segnali del target e IC non rilevati. Test di ripetizione su singolo campione È necessario ripetere il test per le provette campione con un risultato finale Invalid per il target. Limiti della procedura Il test cobas HEV è stato valutato soltanto in combinazione con i prodotti cobas HEV Control Kit, cobas NHP Negative Control Kit, cobas omni MGP Reagent, cobas omni Lysis Reagent, cobas omni Specimen Diluent e cobas omni Wash Reagent per l'uso sui cobas 6800/8800 Systems. L'affidabilità dei risultati è influenzata dal metodo di raccolta, conservazione e manipolazione dei campioni. Con questo test non è consentito utilizzare plasma con eparina, poiché l'eparina svolge un'azione inibitoria sulla PCR. L'identificazione dell RNA di HEV dipende dal numero di particelle virali presenti nel campione e può essere influenzata dalle modalità di raccolta, conservazione e manipolazione del campione, da fattori legati al paziente (come l'età e la presenza di sintomi), nonché dallo stadio dell'infezione e dalle dimensioni del pool. Anche se rare, le mutazioni nelle regioni altamente conservate di un genoma virale coperte dal test cobas HEV possono alterare i legami dei primer e/o delle sonde e impedire l'identificazione del virus. A causa delle differenze intrinseche tra le tecnologie, è consigliabile che gli utenti, prima di passare da una tecnologia a un'altra, svolgano studi sulla correlazione tra i metodi nei propri laboratori alla scopo di qualificare tali differenze. Si consiglia agli utenti di elaborare norme/procedure specifiche. Doc Rev

19 Valutazione delle prestazioni non cliniche Caratteristiche delle prestazioni Campioni di donatori viventi Limite di sensibilità (LOD) Standard Internazionale OMS Il limite di sensibilità (Limit of Detection, LOD) del test cobas HEV per l'rna di HEV è stato determinato in base allo Standard internazionale dell'oms per l'hev (codice PEI 6329/10). Lo standard dell'oms prevede la preparazione di 3 serie di diluizioni indipendenti dello standard virale con plasma umano normale, negativo al virus (HEV), in EDTA. Ogni serie di diluizioni è stata analizzata con 3 diversi lotti dei kit del test cobas HEV, circa 63 volte per lotto, per un totale di circa 189 test per ogni concentrazione. Per il virus HEV, l'analisi PROBIT eseguita sui dati combinati tra le serie di diluizioni e i lotti di reagenti ha consentito di fare una stima del limite di sensibilità e di calcolare il limite minimo e massimo dell'intervallo di confidenza al 95% (Tabella 11). Le percentuali di reattività osservate negli studi sul limite di sensibilità dedicati ad ogni virus sono sintetizzate nella Tabella 12. Tabella 11 Risultati dell'analisi PROBIT sui dati del limite di sensibilità raccolti con lo standard virale in plasma con EDTA Analita Unità di misura LoD Limite inferiore di confidenza al 95% Limite superiore di confidenza al 95% HEV UI/ml 18,6 15,9 22,6 Tabella 12 Riepilogo delle percentuali di reattività all'hev in plasma con EDTA Concentrazione RNA HEV (UI/ml) N. reattivi N. ripetizioni valide % reattivi Limite inferiore di confidenza al 95% (monolaterale) ,0% 98,4% ,2% 91,8% ,3% 82,6% ,4% 54,2% ,5% 22,2% Doc Rev

20 Riproducibilità La riproducibilità del test cobas HEV sui cobas 6800/8800 Systems è stata determinata utilizzando lo Standard internazionale dell'oms per l'hev (codice PEI 6329/10). Lo studio consisteva nell'analizzare 3 pannelli di HEV a concentrazioni pari a circa 0,5, 1 e 2 volte il valore LoD del test cobas HEV. Sono stati eseguiti i test per le seguenti componenti di variabilità: variabilità tra giorni (su 3 giorni) variabilità tra lotti (con 3 diversi lotti di reagenti del test cobas HEV) variabilità tra strumenti (con 3 diversi cobas 8800 Systems) Con ognuno dei 3 pannelli sono stati effettuati circa 21 test, per un totale di 63 test con ogni lotto di reagenti. Tutti i dati validi sulla riproducibilità sono stati valutati calcolando la percentuale di risultati reattivi ai test per ogni livello di concentrazione e tenendo conto di tutte le componenti variabili. I limiti degli intervalli di confidenza al 95% bilaterali per ogni percentuale di reattività sono stati calcolati per ognuno dei tre livelli di HEV che sono stati analizzati su 3 giorni, con 3 lotti di reagenti e 3 diversi cobas 8800 Systems. Il test cobas HEV è riproducibile su più giorni, lotti di reagenti e strumenti. I risultati riguardanti la variabilità tra lotti di reagenti sono sintetizzati nella Tabella 13. Tabella 13 Riepilogo della riproducibilità tra lotti di reagenti per il test cobas HEV Analita HEV Concentrazione 2 x LoD 1 x LoD 0,5 x LoD Lotto di reagenti % reattivi (test reattivi/validi) Limite inferiore dell'intervallo di confidenza al 95% Limite superiore dell'intervallo di confidenza al 95% 1 100,0% (61/61) 94,1% 100,0% 2 100,0% (63/63) 94,3% 100,0% 3 100,0% (63/63) 94,3% 100,0% 1 88,9% (56/63) 78,4% 95,4% 2 96,8% (60/62) 88,8% 99,6% 3 100,0% (63/63) 94,3% 100,0% 1 82,5% (52/63) 70,9% 90,9% 2 95,2% (60/63) 86,7% 99,0% 3 84,1% (53/63) 72,7% 92,1% Doc Rev

21 Verifica del genotipo Per poter definire le prestazioni del test cobas HEV con riferimento all'identificazione dei 4 genotipi del virus HEV, sono stati analizzati 16 campioni clinici univoci e 7 isolati da coltura di HEV con genotipi noti. Tutti i campioni sono stati quantificati in modo tracciabile rispetto allo standard dell'oms per l'hev. Tutti i 16 campioni clinici sono stati prima diluiti con plasma umano normale, negativo al virus (HEV), in EDTA, fino a 5 volte il valore LoD del test cobas HEV. Di questi, 10 campioni sono stati analizzati anche in forma non diluita. Tutti i 7 isolati da coltura sono stati prima diluiti con plasma umano normale, negativo al virus (HEV), in EDTA, fino a 5 volte il valore LoD del test cobas HEV. Tutti i campioni clinici e gli isolati da coltura sono stati identificati sia in forma non diluita, sia in forma diluita 5 x LoD (Tabella 14). Tabella 14 Campioni clinici e isolati da coltura di HEV Genotipo Campioni clinici Isolati da coltura % reattivi (n. reattivi/n. campioni analizzati) non diluiti % reattivi (n. reattivi/n. campioni analizzati) diluiti a 5 x LoD % reattivi (n. reattivi/n. campioni analizzati) diluiti a 5 x LoD 1 non analizzato* non analizzato* 100,0% (3/3) 2 non analizzato* non analizzato* 100,0% (1/1) 3 100,0% (10/10) 100,0% (10/10) non analizzato* 4 non analizzato* 100,0% (6/6) 100,0% (3/3) *Volume insufficiente per eseguire il test senza diluizione/con diluizione Doc Rev

22 Specificità analitica La specificità analitica del test cobas HEV è stata valutata con riferimento alla reattività crociata con 28 microrganismi ad una concentrazione di 10 6 particelle, copie o PFU/ml, inclusi 21 isolati virali, 6 ceppi batterici e 1 isolato di lievito (Tabella 15). I microrganismi sono stati aggiunti a plasma umano normale, negativo al virus, in EDTA. I test sono stati eseguiti con e senza l'aggiunta del virus HEV ad una concentrazione approssimativa di 3 x LoD del test cobas HEV per ogni virus. I microrganismi analizzati non hanno causato reazioni crociate o interferenze con il test cobas HEV. Tabella 15 Microrganismi analizzati ai fini della specificità analitica Virus Flavivirus Batteri Lieviti Adenovirus 5 West Nile Virus Escherichia coli Candida albicans Cytomegalovirus Dengue Virus type 1 Propionibacterium acnes Epstein-Barr Virus Usutu Virus Staphylococcus aureus Herpes Simplex Virus type 1 Herpes Simplex Virus type 2 Hepatitis A Virus Staphylococcus epidermidis Streptococcus viridans Staphylococcus haemolyticus Hepatitis B Virus Hepatitis C Virus Hepatitis G Virus Human Immunodeficiency Virus (HIV-1 Group M) Human Immunodeficiency Virus (HIV-2) Human T-cell lymphotropic Virus type I Human T-cell lymphotropic Virus type II Human Herpes Virus 6 Influenza Virus A Parvovirus B19 Chikungunya Virus Varicella Zoster Virus I campioni di plasma provenienti da ognuno di questi stati patologici (Tabella 16) sono stati analizzati con e senza l'aggiunta del virus HEV ad una concentrazione approssimativa di 3 x LoD del test cobas HEV. Questi stati patologici non hanno causato reazioni crociate o interferenze con il test cobas HEV. Tabella 16 Campioni degli stati patologici analizzati ai fini della specificità analitica Stato patologico Adenovirus type 5 Hepatitis B Virus Human T-cell lymphotropic Virus type I Cytomegalovirus Hepatitis C Virus Human T-cell lymphotropic Virus type II Dengue Virus Herpes Simplex Virus type 1 Parvovirus B19 Epstein-Barr Virus Herpes Simplex Virus type 2 West Nile Virus Hepatitis A Virus Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) Doc Rev

23 Specificità analitica e sostanze interferenti Sostanze interferenti di tipo endogeno Campioni di plasma contenenti livelli patologicamente elevati di trigliceridi (fino a 33,2 g/l), emoglobina (fino a 4,7 g/l), bilirubina non coniugata (fino a 0,28 g/l), albumina (fino a 60 g/l) e DNA umano (fino a 0,004 g/l) sono stati analizzati con e senza l'aggiunta del virus HEV, ad una concentrazione pari a circa 3 x LoD del test cobas HEV. Queste sostanze endogene non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas HEV. Sostanze interferenti di tipo esogeno Campioni di plasma umano normale, negativo al virus HEV, in EDTA, contenenti concentrazioni eccezionalmente elevate di principi attivi (Tabella 17) sono stati analizzati con e senza l'aggiunta del virus HEV, ad una concentrazione 3 x LoD del test cobas HEV. Queste sostanze esogene non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas HEV. Tabella 17 Campioni clinici analizzati con vari principi attivi Nome del principio attivo Acetaminofene (paracetamolo) Acido acetilsalicilico (aspirina) Acido ascorbico (vitamina C) Atorvastatina Fluoxetina Ibuprofene Loratadina Nadololo Naprossene Paroxetina Fenilefrina Cloridrato Sertralina Concentrazione 1324 µmol/l 3620 µmol/l 342 µmol/l 600 µg Eq/l 11,2 µmol/l 2425 µmol/l 0,78 µmol/l 3,88 µmol/l 2170 µmol/l 3,04 µmol/l 491 µmol/l 1,96 µmol/l Doc Rev

24 Correlazione Valutazione delle prestazioni del test cobas HEV rispetto al test Realstar HEV RT-PCR Kit 1.0 Le prestazioni del test cobas HEV e del test Realstar HEV RT-PCR Kit 1.0 test (Altona Diagnostics) sono state messe a confronto utilizzando 100 campioni individuali di plasma normale, positivo ai test NAT per l'hev. Sono stati analizzati 100 campioni positivi non diluiti e 67 campioni positivi con diluizione 1:6. Sono stati inoltre analizzati 100 campioni di plasma negativi all'hev non diluiti con entrambi i metodi. I campioni sieronegativi hanno evidenziato una specificità del 100%, generando 100 risultati non reattivi su 100 totali con entrambi i metodi. Per quanto riguarda i campioni positivi, i due metodi hanno prodotto risultati concordanti in base al test di McNemar, a dimostrazione del fatto che le prestazioni del test cobas HEV e del test Realstar HEV RT-PCR Kit 1.0 sono equivalenti (Tabella 18). Tabella 18 Correlazione dei campioni positivi (non diluiti) Metodi Risultati per HEV Test Realstar HEV RT-PCR Kit 1.0 cobas HEV Non diluito Diluito 1:6 Non reattivi Non reattivi 0 3 Reattivi Non reattivi 0 3 Non reattivi Reattivi 1 9 Reattivi Reattivi Totale Test di McNemar, valore p (bilaterale, α=0,05) Tasso globale d'errore del sistema 1,00 0,09 Il tasso globale d'errore del sistema per il test cobas HEV è stato calcolato ripetendo 100 test su campioni di plasma in EDTA, arricchiti con HEV. I campioni sono stati analizzati ad una concentrazione del target approssimativamente 3 x LoD e in pool costituiti da 1 solo campione (non diluito). Per questo studio sono stati utilizzati il cobas 8800 System e il cobas p 680 instrument (pipettamento e creazione di pool). Lo studio dimostra che tutte le ripetizioni dei test hanno prodotto risultati reattivi all'hev, pertanto il tasso globale d'errore del sistema è pari allo 0%. L'intervallo di confidenza esatto al 95% bilaterale è pari allo 0% per il limite inferiore e al 3,62% per il limite superiore [0%: 3,62%]. Doc Rev

25 Informazioni supplementari Caratteristiche del test Tipo di campione Quantità di campione necessaria Quantità di campione analizzata Durata del test Plasma 1000 µl 850 µl I risultati sono disponibili in meno di 3 ore e mezza dal caricamento del campione sul sistema. Doc Rev

26 I seguenti simboli appaiono su tutte le confezioni di prodotti diagnostici PCR di Roche. Tabella 19 Simboli utilizzati sulle etichette dei prodotti diagnostici PCR di Roche Software ausiliario Dispositivo medico-diagnostico in vitro Mandatario nella Comunità Europea Limite inferiore dell'intervallo assegnato Foglio di dati del codice a barre Fabbricante Codice del lotto Conservare al buio Rischio biologico Contenuto sufficiente per <n> test Numero di catalogo Limiti di temperatura Consultare le istruzioni per l'uso File di definizione del test Contenuto del kit Limite superiore dell'intervallo assegnato Distribuito da Utilizzare entro Solo per valutazione delle prestazioni IVD Questo prodotto è conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro. Assistenza Tecnica ai clienti USA Doc Rev

27 Produttore e distributori Tabella 20 Produttore e distributori Fabbricato negli USA Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße Mannheim, Germany Marchi e brevetti Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Straße 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal Vedere Copyright 2014, Roche Molecular Systems, Inc. Doc Rev

28 Bibliografia 1. Kamar N, Bendall R, Legrand-Abravanel F, et al. Hepatitis E. Lancet. 2012;379: Ahmad I, Holla RP, Jameel S. Molecular virology of hepatitis E virus. Virus Res. 2011;161: Meng XJ, Purcell RH, Halbur PG, et al. A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94: Yugo DM, Meng XJ. Hepatitis E virus: foodborne, waterborne, and zoonotic transmission. Int J Environ Res Public Health. 2013;10: Balayan MS, Andjaparidze AG, Savinskaya SS, et al. Evidence for a virus in non-a, non-b hepatitis transmitted via the fecal-oral route. Intervirology. 1983;20: Dalton HR, Bendall R, Ijaz S, Banks M. Hepatitis E: an emerging infection in developed countries. Lancet Infect Dis. 2008;8: Meng XJ. Hepatitis E as a zoonotic disease in the United States. Oral presentation by X.J. Meng at the NIH Research Workshop: Hepatitis E in the United States, Bethesda, Maryland. March 2012; Mansuy JM, Péron JM, Abravanel F, et al. Hepatitis E in the south west of France in individuals who have never visited an endemic area. J Med Virol. 2004;74: Dalton HR, Stableforth W, Thurairajah P, et al. Autochthonous hepatitis E in Southwest England: natural history, complications and seasonal variation, and hepatitis E virus IgG seroprevalence in blood donors, the elderly and patients with chronic liver disease. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2008;20: Wichmann O, Schimanski S, Koch J, et al. Phylogenetic and case-control study on hepatitis E virus in Germany. J Infect Dis. 2008;198: Dalton HR, Fellows HJ, Gane EJ, et al. Hepatitis E in New Zealand. J Gastroenterol Hepatol. 2007;22: Tsang TH, Denison EK, Williams HV, Venczel LV, Ginsberg MM, Vugia DJ. Acute hepatitis E infection acquired in California. Clin Infect Dis. 2000;30: Teo CG. Much meat, much malady: changing perceptions of the epidemiology of hepatitis E. Clin Microbiol Infect. 2010;16: Colson P, Borentain P, Queyriaux B, et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. J Infect Dis. 2010;202: Matsuda H, Okada K, Takahashi K, Mishoro S. Severe hepatitis E virus infection after ingestion of uncooked liver from a wild boar. J Infect Dis. 2003;188: Tei S, Kitajima N, Takahashi K, Mishoro S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. Lancet 2003;362: Gotanda Y, Iwata A, Ohnuma H, et al. Ongoing subclinical infection of hepatitis E virus among blood donors with an elevated alanine aminotransferase level in Japan. J Med Virol. 2007;79: Mitsui T, Tsukamoto Y, Suzuki S, et al. Serological and molecular studies on subclinical hepatitis E virus infection using periodic serum samples obtained from healthy individuals. J Med Virol 2005;76: Doc Rev