cobas TaqScreen West Nile Virus Test for use on the cobas s 201 system

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1 cobas TaqScreen West Nile Virus Test for use on the cobas s 201 system PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. cobas TaqScreen West Nile Virus Test WNV 96 Tests P/N: cobas TaqScreen West Nile Virus Control Kit WNV CTL 6 Sets P/N: cobas TaqScreen Wash Reagent TS WR 5.1 L P/N: Per l'analisi dei campioni cadaverici con il test cobas TaqScreen per il virus del Nilo occidentale, è necessario utilizzare il seguente kit, oltre ai kit sopraelencati: cobas TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit CADV SPEC DIL 96 Tests P/N: INDICE GENERALE INDICE GENERALE...1 Indice delle tabelle...2 USO PREVISTO...3 RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST...3 PRINCIPI DELLA PROCEDURA...3 Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor...4 Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep...4 Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici con l'analizzatore COBAS TaqMan...4 Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR...4 Amplificazione selettiva...5 Rivelazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS TaqMan...5 Rivelazione dei prodotti della PCR...5 Gestione automatizzata dei dati con il software PDM...5 MATERIALI FORNITI DA ROCHE...6 ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE (ACQUISTABILI PRESSO ROCHE)...7 Strumentazione e software per il sistema cobas s 201 Configurazione C o Configurazione C MR1 (Maintenance Release 1)...7 Rack e materiali di consumo...7 REAGENTI...8 REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE...10 PRECAUZIONI...11 PREPARAZIONE DEI REAGENTI...12 RACCOLTA, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI...12 Campioni di donatori viventi...12 Campioni cadaverici...14 CREAZIONE DI POOL E PIPETTAMENTO DEI CAMPIONI...15 NOTE SULLA PROCEDURA...15 ISTRUZIONI PER L'USO...16 CONTROLLO DI QUALITÀ...19 La sezione Revisione del documento si trova in fondo a questo documento IT 1 Doc Rev. 2.0

2 RISULTATI...20 Repeat Needed...20 Analisi in pool - Resolution Needed...20 LIMITI DELLA PROCEDURA...21 CARATTERISTICHE DELLA PERFORMANCE...21 CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI...21 Riproducibilità...21 Sensibilità analitica - Health Canada Standard - Lineage Sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard - Lineage Sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel - Lineage Sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage Specificità analitica - Microrganismi potenzialmente interferenti e reattività crociata...26 Specificità analitica - Altre condizioni patologiche...26 Sostanze potenzialmente interferenti...27 Sostanze interferenti di tipo endogeno...27 Sostanze interferenti di tipo esogeno...27 CAMPIONI CADAVERICI...28 Riproducibilità...28 Specificità...29 Sensibilità analitica nei campioni cadaverici con Roche WNV Secondary Standard...29 Sensibilità...30 PERFORMANCE CLINICA - CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI...31 Sensibilità clinica - Analisi di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale...31 Specificità clinica...32 Risultati dei test in pool...32 Risultati dei test sui campioni individuali...33 RIFERIMENTI...34 Indice delle tabelle Tabella 1. Test cobas TaqScreen WNV - Dati di riproducibilità...22 Tabella 2. Riepilogo della sensibilità analitica - Health Canada West Nile Virus Standard...23 Tabella 3. Riepilogo della sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard...24 Tabella 4. Riepilogo della sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel...25 Tabella 5. Riepilogo della sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage Tabella 6. Microrganismi analizzati...26 Tabella 7. Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi - Risultati in base al lotto del kit...28 Tabella 8. Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi - Risultati in base alla coppia operatore-strumento...28 Tabella 9. Riepilogo dei risultati del test cobas TaqScreen WNV in materia di specificità dei campioni cadaverici e dei campioni di donatori viventi...29 Tabella 10. Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in campioni cadaverici moderatamente emolizzati...30 Tabella 11. Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in una matrice di campioni altamente emolizzati...30 Tabella 12. Riepilogo della sensibilità per il virus WNV con campioni cadaverici moderatamente emolizzati (MH) e con campioni altamente emolizzati (HH) IT 2 Doc Rev. 2.0

3 Tabella 13. Sensibilità clinica di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale...31 Tabella 14. Specificità clinica del test cobas TaqScreen WNV - Test in pool...32 Tabella 15. Specificità clinica del test cobas TaqScreen WNV - Test di campioni individuali...33 USO PREVISTO Il test cobas TaqScreen West Nile Virus (WNV) è un test qualitativo in vitro destinato all'uso con il sistema cobas s 201 per la determinazione diretta dell'rna del virus del Nilo occidentale (RNA di WNV). Il test consente di individuare la presenza dell'rna di WNV in campioni di plasma umano ed è destinato all'uso nello screening dei donatori di sangue intero e/o di emocomponenti e degli altri donatori viventi. Inoltre il test può essere utilizzato per lo screening dei donatori di organi (campioni di plasma prelevati in presenza di battito cardiaco del donatore) e per l'analisi di campioni cadaverici (campioni ematici prelevati in assenza di battito cardiaco). Il test non è destinato all'uso con sangue di cordone ombelicale. È possibile eseguire lo screening del plasma di tutti i donatori analizzando i campioni individuali. Nel caso delle donazioni di sangue intero e/o di emocomponenti, i campioni di plasma possono essere analizzati in pool costituiti da non più di sei aliquote identiche di campioni individuali. Nel caso delle donazioni di organi e tessuti (in assenza di battito cardiaco), è possibile eseguire lo screening dei campioni di plasma e di siero soltanto come campioni individuali. Questo test non può essere utilizzato a sostegno della diagnosi. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST Il virus del Nilo occidentale (West Nile Virus, WNV) della famiglia dei Flaviviridiae appartiene al genere Flavivirus e al gruppo di virus dell'encefalite giapponese (Japanese Encephalitis Serocomplex). I virus di questo gruppo sono arbovirus potenzialmente in grado di causare meningite, encefalite e meningoencefalite. Appartengono al gruppo dei virus dell'encefalite giapponese il virus dell'encefalite giapponese, il virus dell'encefalite della Murray Valley, il virus Kunjin (ora formalmente riconosciuto come variante di WNV) e il virus dell'encefalite di Saint Louis, che causò un'epidemia di encefalite negli Stati Uniti attorno alla metà degli anni '70 1,2. Il test cobas TaqScreen WNV è un test qualitativo che consente di effettuare lo screening e la rivelazione dell'rna di WNV in campioni individuali o in pool di campioni infetti. Il test cobas TaqScreen WNV prevede la preparazione degli acidi nucleici sullo strumento COBAS AmpliPrep secondo una tecnica di estrazione generica. Per determinare la presenza dell'rna di WNV viene eseguita un'amplificazione PCR real-time automatizzata sull'analizzatore COBAS TaqMan. Nel kit è incluso un Controllo Interno (Internal Control, IC), per il monitoraggio della performance di ogni singolo test, e l'enzima AmpErase, che consente di ridurre la potenziale contaminazione da materiale amplificato in precedenza (amplicon). PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test cobas TaqScreen WNV utilizzato sul sistema cobas s 201 si basa su 4 procedure principali: 1. Creazione automatizzata dei pool di campioni e pipettamento dei controlli con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor 2. Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep 3. Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici e rivelazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS TaqMan 4. Gestione automatizzata dei dati con il software PDM (Pooling and Data Management) IT 3 Doc Rev. 2.0

4 Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor Lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor consente di automatizzare il pipettamento dei pool e dei campioni individuali dei donatori, il trasferimento delle aliquote nelle piastre a pozzetti profondi (facoltativo) e il pipettamento dei controlli del test. Il sistema cobas s 201 viene utilizzato per i test di risoluzione dei pool reattivi e per l'identificazione dei campioni individuali reattivi presenti nel pool. Il sistema cobas s 201 è progettato per il trattamento dei campioni in batch. Un batch è un gruppo di campioni e controlli che vengono sottoposti insieme alle procedure di pipettamento, estrazione, amplificazione e rivelazione. Al termine del pipettamento di un batch sullo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, l'intero rack per campioni viene trasferito sullo strumento COBAS AmpliPrep per la fase successiva della procedura. Nota: per eseguire il test sui campioni cadaverici, diluire il campione con rapporto 1:5 utilizzando il diluente cobas TaqScreen per campioni cadaverici (CADV SPEC DIL) prima di avviare il pipettamento con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep Vengono analizzati simultaneamente gli acidi nucleici dei target e le molecole del Controllo Interno (IC) dell'armored RNA aggiunte, che agiscono da controllo per la procedura di preparazione e amplificazione/ rivelazione dei campioni. Il test cobas TaqScreen WNV contiene reagenti sufficienti per completare cinque fasi in sequenza sullo strumento COBAS AmpliPrep. La soluzione di Proteasi è preposta alla digestione enzimatica delle proteine per indurre la lisi, inattivare le nucleasi e facilitare il rilascio di RNA e DNA dalle particelle virali. L'aggiunta del Reagente di lisi nel campione induce la lisi virale e l'inattivazione delle nucleasi attraverso la denaturazione delle proteine. L'RNA e il DNA vengono rilasciati e allo stesso tempo protetti dalle nucleasi. Gli acidi nucleici rilasciati si legano alla superficie di silice delle particelle di vetro magnetizzate (Magnetic Glass Particles, MGP) aggiunte. Ciò è dovuto principalmente alla presenza di una carica netta positiva sulla superficie delle particelle di vetro e di una carica netta negativa degli acidi nucleici sotto la concentrazione dei sali caotropici e la forza ionica della reazione di lisi. Il Reagente di lavaggio rimuove le sostanze non legate e le impurità, come le proteine denaturate, i detriti cellulari e i potenziali inibitori della PCR (ad esempio, l'emoglobina ecc.), riducendo la concentrazione salina. Gli acidi nucleici purificati vengono rilasciati dalle particelle di vetro magnetizzate a una temperatura elevata con il Tampone di eluizione. Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici con l'analizzatore COBAS TaqMan Dopo l'isolamento degli acidi nucleici purificati, durante la preparazione automatizzata del campione, viene utilizzata la soluzione cobas TaqScreen WNV Master Mix (WNV MMX) per amplificare e rilevare l'rna del virus del Nilo occidentale (RNA di WNV) e l'rna del Controllo Interno (RNA IC). Dopo l'attivazione mediante aggiunta di acetato di manganese, la soluzione WNV MMX consente la trascrizione inversa, seguita dall'amplificazione PCR di una regione altamente conservata di RNA di WNV e di RNA IC, grazie all'uso di primer specifici. La rivelazione simultanea del DNA amplificato è possibile grazie alla generazione di segnali fluorescenti dalla degradazione 5'-nucleolitica delle sonde WNV-specifiche e IC-specifiche presenti anche nella soluzione WNV MMX. Vengono utilizzati due coloranti fluorescenti: il primo marca la sonda IC-specifica e il secondo marca la sonda target-specifica, consentendo l'identificazione indipendente di WNV e IC. Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR Le reazioni di trascrizione inversa e di amplificazione vengono eseguite con un enzima ricombinante termostabile, denominato DNA Polimerasi Z05. In presenza di manganese (Mn 2+ ), la DNA Polimerasi Z05 induce le attività di trascrittasi inversa e di DNA polimerasi. Ciò fa sì che nella stessa miscela di reazione possano avere luogo sia la trascrizione inversa, sia l'amplificazione mediante PCR. L'amplificazione mediante PCR si ottiene grazie alla DNA polimerasi Z05, che estende i primer appaiati lungo gli stampi target e produce una molecola di DNA a doppio filamento, denominata amplicon. Questo processo viene ripetuto per svariati cicli e, ad ogni ciclo, la quantità di DNA amplicon raddoppia. L'amplificazione interessa soltanto la regione dei genomi target compresa tra i primer, ma non coinvolge interi genomi IT 4 Doc Rev. 2.0

5 Amplificazione selettiva L'amplificazione selettiva degli acidi nucleici target nei campioni è ottenuta dal test cobas TaqScreen WNV grazie all'uso dell'enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) e del trifosfato di deossiuridina (dutp). L'enzima AmpErase riconosce e catalizza la distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina 3, ma non del DNA contenente deossitimidina o dell'rna contenente ribouridina 4,5. La desossiuridina non è presente nel DNA naturale, ma è sempre presente nell'amplicon in quanto il trifosfato di desossiuridina viene utilizzato con il trifosfato di timidina come uno dei dntp nel reagente WNV MMX e pertanto solamente l'amplicon contiene deossiuridina. La deossiuridina rende l'amplicon contaminante sensibile alla distruzione da parte dell'enzima AmpErase prima dell'amplificazione dell'rna target. Inoltre, qualsiasi prodotto non specifico eventualmente formatosi dopo l'attivazione iniziale della soluzione WNV MMX tramite manganese viene distrutto dall'enzima AmpErase. L'enzima AmpErase, che è contenuto nella soluzione WNV MMX, catalizza la segmentazione del DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosi in posizione C1. Quando viene riscaldata nella prima fase del ciclo termico, la catena di DNA dell'amplicon si spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'enzima AmpErase rimane inattivo per un periodo di tempo prolungato dopo essere stato esposto a temperature superiori a 55 C, di conseguenza non distrugge l'amplicon target che si è formato dopo la reazione PCR. Rivelazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS TaqMan Durante l'amplificazione PCR, l'elevata temperatura intermittente durante i cicli induce la denaturazione dell'amplicon target e dell'amplicon IC, formando un DNA a filamento singolo. Le sonde oligonucleotidiche specifiche del test si ibridizzano al filamento singolo del DNA amplificato. L'amplificazione, l'ibridizzazione e la rivelazione sono simultanee. Rivelazione dei prodotti della PCR La soluzione cobas TaqScreen WNV MMX contiene sonde di rivelazione specifiche per gli acidi nucleici di WNV e IC. Ogni sonda di rivelazione è marcata con due coloranti fluorescenti, uno che agisce da reporter e l'altro da quencher. Alle sonde target-specifiche è associato un tipo di colorante reporter, che viene misurato a una determinata lunghezza d'onda. Alla sonda IC-specifica è associato un secondo colorante reporter, che viene misurato a una lunghezza d'onda diversa. In entrambe le sonde è presente uno stesso tipo di colorante quencher. Questo sistema consente di rilevare il target di WNV amplificato a una specifica lunghezza d'onda e, simultaneamente, di rilevare l'acido nucleico di IC a una diversa lunghezza d'onda. Prima che l'amplificazione mediante PCR abbia inizio, le sonde sono intatte e la fluorescenza del colorante reporter è soppressa dal colorante quencher in virtù del trasferimento di energia tipo Förster. Durante l'amplificazione mediante PCR, le sonde si ibridizzano a specifiche sequenze di DNA a filamento singolo e vengono segmentate dall'attività della 5'-3' nucleasi della DNA polimerasi Z05 nello stesso momento in cui ha luogo l'amplificazione. Una volta che i coloranti reporter e quencher si separano per effetto di questa segmentazione, l'attività di fluorescenza del reporter è rilevata. Ad ogni ciclo di PCR viene generato un numero maggiore di sonde segmentate e il segnale cumulativo del colorante reporter aumenta progressivamente. Le rivelazione real-time dei prodotti della PCR è ottenuta misurando la fluorescenza dei coloranti reporter rilasciati, i quali rappresentano uno il target WNV, uno l'ic. 6, 7 Gestione automatizzata dei dati con il software PDM L'applicazione Roche PDM Data Manager consente all'utente di rivedere e stampare i risultati. Roche PDM Data Manager classifica i risultati di tutti i test come non reattivi, reattivi o non validi. Oltre che per recuperare ed esaminare i risultati della PCR, il software Roche PDM può essere utilizzato dall'operatore per stampare report, eseguire ricerche dei risultati, accettare i risultati dei donatori e, facoltativamente, trasmettere i risultati a un sistema LIS IT 5 Doc Rev. 2.0

6 MATERIALI FORNITI DA ROCHE Per la rivelazione dell'rna di WNV nei campioni di plasma vengono forniti i tre kit necessari: (1) il test cobas TaqScreen West Nile Virus, (2) il kit di controlli cobas TaqScreen West Nile Virus e (3) il reagente di lavaggio cobas TaqScreen. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale. cobas TaqScreen West Nile Virus Test (P/N: ) WNV CS1 (Cassetta di reagente MGP per WNV) WNV CS2 (Cassetta di reagente di lisi per WNV) WNV CS3 (Cassetta di multi-reagente per WNV) WNV CS4 (Cassetta di reagente test-specifico per WNV) cobas TaqScreen West Nile Virus Control Kit Kit di controlli cobas TaqScreen WNV (P/N: ) WNV (+) C (Controllo positivo WNV) WNV ( ) C [Controllo negativo WNV (plasma umano)] cobas TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (Reagente di lavaggio cobas TaqScreen) WNV WNV CTL TS WR 96 test 6 set 5,1 litri Nota: per rivelare l'rna di WNV nei campioni cadaverici, è necessario utilizzare il seguente kit (in dotazione) oltre ai kit sopraelencati: cobas TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit. cobas TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit Kit di diluenti cobas TaqScreen per campioni cadaverici (P/N: ) CADV SPEC DIL (Diluente cobas TaqScreen per campioni cadaverici) CADV SPEC DIL 96 test IT 6 Doc Rev. 2.0

7 ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE (ACQUISTABILI PRESSO ROCHE) Questo test deve essere eseguito sul sistema cobas s 201. Il sistema cobas s 201 deve essere installato da un rappresentante dell'assistenza Tecnica Roche Diagnostics e utilizzato in una configurazione completa. I singoli componenti del sistema cobas s 201 non possono essere utilizzati come dispositivi indipendenti dal sistema, né possono essere sostituiti con altri componenti. Il sistema cobas s 201 utilizza i componenti elencati di seguito. Per ulteriori informazioni fare riferimento alla scheda informativa del prodotto. Strumentazione e software per il sistema cobas s Configurazione C o Configurazione C MR1 (Maintenance Release 1) Hamilton MICROLAB STAR e/o STARlet IVD Pipettor Strumento COBAS AmpliPrep Analizzatore COBAS TaqMan (con aggiornamento EX48) Stazione dati e software AMPLILINK v3.1.2 o v3.2.1 Roche PDM Data Manager Server, stazione di lavoro e software Data Manager v o v Manuale operativo del sistema cobas s Configurazione C o Configurazione C (MR1) Elenco dei problemi noti per il sistema cobas s Configurazione C o Configurazione C (MR1) Rack e materiale di consumo Rack per campioni COBAS AmpliPrep (SK24) (P/N: ) Rack per SPU COBAS AmpliPrep (P/N: ) Rack per reagenti COBAS AmpliPrep (P/N: ) Unità di trattamento campioni (SPU) (P/N: ) Provette per campioni iniziali (provette campione) con clip dei codici a barre (P/N: ) Rack per puntali K (P/N: ) Confezione di provette K da 12 x 96 (P/N: ) K-carrier COBAS TaqMan (P/N: ) Puntali CO-RE a volume elevato (1000 μl), filtro (P/N: ) Piastre a pozzetti profondi con etichette per codice a barre (P/N: ) Coperture per piastre a pozzetti profondi (P/N: ) Rack portacampioni per 24 provette (P/N: ) Rack portacampioni per 32 provette (P/N: ) Rack portapuntali (P/N: ) Rack per piastre a pozzetti profondi (P/N: ) Carrier portarack SK24 (P/N: ) Spray disinfettante Microcide SQ o HAMILTON (P/N: ) Guanti monouso, senza talco IT 7 Doc Rev. 2.0

8 REAGENTI cobas TaqScreen West Nile Virus Test (P/N: ) WNV CS1 MGP (Particelle di vetro magnetizzate) Particelle di vetro magnetizzate 93% Isopropanolo Xi 93% (p/p) Isopropanolo WNV 96 test 2 x 48 test 2 x 7,0 ml Irritante F 93% (p/p) Isopropanolo Facilmente infiammabile WNV CS2 LYS (Reagente di lisi) Diidrato di citrato di sodio 42,5% Tiocianato di guanidina < 14% Polidocanolo 0,9% Ditiotreitolo Xn 42,5% (p/p) Tiocianato di guanidina 2 x 48 test 2 x 78 ml Nocivo N < 14% (p/p) Polidocanolo Pericoloso per l'ambiente WNV CS3 Pase (Soluzione Proteinasi) Tampone TRIS < 0,05% EDTA Cloruro di calcio Acetato di calcio 7,8% Proteinasi 2 x 48 test 2 x 3,8 ml Glicerolo Xn 7,8% (p/p) Proteinasi Nocivo IT 8 Doc Rev. 2.0

9 WNV EB (Tampone di eluizione WNV) Tampone TRIS 0,002% Poly ra RNA (sintetico) EDTA 0,09% Sodio azide 2 x 7,0 ml WNV CS4 WNV MMX (Master Mix WNV) Tampone tricina Acetato di potassio Glicerolo < 18% Dimetilsolfossido < 0,07% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,002% Primer a monte e a valle per WNV < 0,002% Sonda a marcatura fluorescente WNV-specifica < 0,002% Sonda a marcatura fluorescente IC-specifica < 0,002% Aptamero oligonucleotidico < 0,05% DNA Polimerasi Z05 (batterica) < 0,1% Enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) (batterico) 0,08% Sodio azide WNV Mn 2+ (Soluzione di manganese WNV) < 0,6% Manganese acetato Acido acetico glaciale 0,09% Sodio azide WNV IC (Controllo Interno WNV) Tampone TRIS 0,002% Poly ra RNA (sintetico) EDTA 0,05% Sodio azide < 0,001% RNA di controllo interno sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 cobas TaqScreen West Nile Virus Control Kit Kit di controlli cobas TaqScreen WNV (P/N: ) WNV CTL 2 x 48 test 2 x 2,5 ml 2 x 19,8 ml 2 x 3,6 ml 6 set WNV (+) C (Controllo positivo WNV) Tampone TRIS 0,002% Poly ra RNA (sintetico) EDTA 0,05% Sodio azide < 0,001% RNA di WNV sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 6 x 1,1 ml IT 9 Doc Rev. 2.0

10 WNV ( ) C [Controllo negativo WNV (plasma umano)] Plasma umano negativo, confermato non reattivo da test brevettati per la determinazione dell'anticorpo anti-hcv, dell'anticorpo anti-hiv-1/2 e dell'antigene HBsAg; RNA di WNV non rilevabile mediante i metodi PCR 0,1% Conservante ProClin x 1,6 ml Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone Irritante R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. cobas TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (Reagente di lavaggio cobas TaqScreen) Diidrato di citrato di sodio 0,1% Conservante Metilparaben TS WR 5,1 litri cobas TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit Kit di diluenti cobas TaqScreen per campioni cadaverici (P/N: ) CADV SPEC DIL (Diluente cobas TaqScreen per campioni cadaverici) EDTA CADV SPEC DIL 96 test 4 x 100 ml REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE A. La temperatura tra 15 e 30 C è definita temperatura ambiente. B. Non congelare i reagenti e i controlli. C. Conservare i reagenti WNV CS1, WNV CS2, WNV CS3 e WNV CS4 tra 2 e 8 C. Se inutilizzati, questi reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata. D. Dopo l'uso, i reagenti restano stabili per 30 giorni a 2-8 C oppure fino alla data di scadenza indicata, se precedente. E. I reagenti possono essere utilizzati al massimo per 6 sedute, complessivamente per 40 ore, sullo strumento COBAS AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8 C tra una seduta e la successiva. Il software AMPLILINK controlla le ore di utilizzo cumulativo delle cassette di reagente nello strumento COBAS AmpliPrep e impedisce l'uso delle cassette una volta raggiunte le 40 ore cumulative. F. I reagenti sono stabili per un totale di 24 ore continuative sullo strumento COBAS AmpliPrep. Il software AMPLILINK non tiene conto delle ore di presenza continuativa delle cassette di reagente sullo strumento, né del numero totale di sedute dello strumento in occasione delle quali sono state utilizzate le cassette. È compito dell'utente gettare via le cassette di reagente una volta raggiunto il limite massimo di 24 ore continuative o di 6 sedute dello strumento. G. Conservare i reagenti WNV (+) C e WNV ( ) C a 2-8 C. I controlli restano stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura è necessario gettare via le parti inutilizzate. H. Conservare il reagente TS WR a C. Se non è aperto, il reagente TS WR resta stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente resta stabile per 30 giorni a C o fino alla data di scadenza, se precedente IT 10 Doc Rev. 2.0

11 I. Conservare il diluente CADV SPEC DIL a C. Il diluente è stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura è necessario gettare via il diluente inutilizzato rimasto nel contenitore. PRECAUZIONI PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. A. I campioni potrebbero essere infettivi. Adottare le Precauzioni Universali durante lo svolgimento del test 8,9. La procedura dovrebbe essere affidata esclusivamente a personale con esperienza nella manipolazione di materiali infettivi e nell'uso del test cobas TaqScreen West Nile Virus. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro del laboratorio con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. Successivamente pulire la superficie con etanolo al 70%. B. ATTENZIONE: il reagente WNV ( ) C contiene plasma umano derivato da sangue umano. Il materiale d'origine è stato analizzato e confermato non reattivo all'anticorpo anti-hiv-1/2, all'anticorpo anti-hcv e all'antigene HBsAg. L'analisi di plasma umano negativo mediante i metodi PCR ha evidenziato l'assenza di RNA di WNV rilevabile. Allo stato attuale, tuttavia, nessun metodo di analisi garantisce con assoluta certezza che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Tutti i materiali derivati da sangue umano devono essere considerati potenzialmente infettivi e quindi manipolati adottando le Precauzioni Universali. In caso di fuoriuscite, disinfettare immediatamente l'area con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% (candeggina diluita) oppure seguire le procedure di laboratorio opportune. C. Rispettare le precauzioni di routine del laboratorio. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro designate. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo avere manipolato i campioni e i reagenti del kit, lavarsi accuratamente le mani. D. I reagenti WNV EB, WNV MMX, WNV Mn 2+, WNV IC e WNV (+) C contengono sodio azide come conservante. Non utilizzare tubi di metallo per il trasferimento dei reagenti. Se le soluzioni contenenti sodio azide devono essere smaltite attraverso l'impianto di scarico, è necessario diluire e sciacquare con abbondante acqua corrente, onde evitare che nelle tubature metalliche si accumulino depositi in grado di dare luogo a reazioni esplosive. E. È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa procedura. F. Si consiglia di utilizzare pipette sterili e puntali per pipette privi di nucleasi, di tipo monouso. Potrebbero verificarsi risultati falsi positivi se non si previene la contaminazione crociata durante la manipolazione e l'analisi dei campioni. G. Per garantire una performance ottimale del test, utilizzare soltanto i materiali di consumo forniti e consigliati. H. Manipolare tutti i materiali contenenti campioni o controlli secondo la Buona Prassi di Laboratorio, onde evitare la contaminazione crociata di campioni o controlli. I. Prima dell'uso, ispezionare visivamente le singole cassette di reagente, le provette di controllo e il Reagente di lavaggio per verificare che non vi siano segni di perdite. In presenza di perdite, non utilizzare il materiale per il test. J. Smaltire tutti i reagenti che sono entrati in contatto con i campioni e i reagenti nel rispetto delle normative locali e nazionali in materia. K. I seguenti prodotti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza indicata: il test cobas TaqScreen West Nile Virus, il kit di controlli cobas TaqScreen West Nile Virus, il reagente di lavaggio cobas TaqScreen o il kit di diluenti cobas TaqScreen per campioni cadaverici. Non scambiare, mescolare o combinare reagenti appartenenti a kit o a lotti diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS AmpliPrep. L. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale IT 11 Doc Rev. 2.0

12 M. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita dei reagenti, diluire il liquido con acqua prima di asciugare. Evitare che il reagente LYS, che contiene tiocianato di guanidina, entri in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). L'eventuale miscela di queste soluzioni può produrre gas fortemente tossici. N. Per assicurare il corretto svolgimento del test, attenersi scrupolosamente alle procedure e alle linee guida fornite. Qualunque deviazione dalle procedure e dalle linee guida approvate potrebbe compromettere la performance del test. O. L'uso di campioni eccessivamente emolizzati da donatori viventi dovrebbe essere evitato. P. La contaminazione dei campioni di plasma con globuli rossi (> 5%) potrebbe inibire il funzionamento del test cobas TaqScreen West Nile Virus. Q. Non utilizzare mai, in nessuna fase del test, componenti con etichette dei codici a barre danneggiate. R. Nei test dei campioni cadaverici, i colori tra il giallo paglierino e il rosa sono classificati come moderatamente emolizzati (Moderately Hemolyzed, MH), mentre i colori tra il rosso, il rosso scuro e il marrone sono classificati come altamente emolizzati (Highly Hemolyzed, HM). PREPARAZIONE DEI REAGENTI A. Prima dell'uso, equilibrare i reagenti e i controlli cobas TaqScreen WNV a temperatura ambiente per 30 minuti. RACCOLTA, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI Nota: manipolare tutti i campioni come se fossero agenti infettivi. Campioni di donatori viventi A. È possibile utilizzare campioni di plasma raccolti in EDTA, CPD, CPDA1, CP2D, ACDA e citrato di sodio al 4% con il test cobas TaqScreen West Nile Virus. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore delle provette. La stabilità dei campioni risente delle temperature elevate. B. Per conservare il sangue raccolto con gli anticoagulanti K2 EDTA e K3 EDTA sono disponibili due alternative. Alternativa n 1: prima della plasmaferesi, è possibile conservare il sangue fino a 24 ore a 2-30 C, poi per altre 24 ore a 2-25 C e infine per altre 72 ore a 2-8 C. Per conservare il campione per più di cinque giorni, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8 C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a -20 C. Temperatura ( C) C Anticoagulante EDTA Condizione n 1 25 C 2-8 C Sangue intero Plasma Giorni post-prelievo IT 12 Doc Rev. 2.0

13 Alternativa n 2: prima della plasmaferesi, è possibile conservare il sangue fino a 72 ore a 2-25 C, poi per altre 48 ore a 2-8 C. Per conservare il campione per più di cinque giorni, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8 C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a -20 C. Il plasma conservato in K2 EDTA e K3 EDTA può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo Temperatura ( C) Anticoagulante EDTA Condizione n 2 25 C 2-8 C Sangue intero Plasma Giorni post-prelievo C. Il sangue raccolto con gli anticoagulanti CPD, CPDA1 e CP2D può essere conservato fino a 24 ore a 2-30 C prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8 C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a -20 C. Per periodi di conservazione più lunghi, è possibile conservare il plasma separato dai globuli rossi a -70 C per un massimo di 30 mesi. Il plasma con CPD, CPDA1 e CP2D può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo. Anticoagulanti CPD, CPDA1, CP2D C Temperatura ( C) C Sangue Whole Blood intero Plasma Giorni post-prelievo D. Il plasma in aferesi con gli anticoagulanti ACDA o citrato di sodio al 4% può essere conservato per 24 ore a 2-30 C dopo il prelievo. Il plasma in aferesi può essere conservato fino a 30 giorni a -20 C. Il plasma in aferesi con ACDA o citrato di sodio al 4% può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo IT 13 Doc Rev. 2.0

14 E. Le seguenti linee guida relative ai volumi di plasma si basano sul pipettamento da provette di plastica o vetro da 13 x 100 mm, eseguito con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. I volumi indicati, che si riferiscono al plasma oltre ai globuli rossi stratificati, dovranno essere utilizzati per l'analisi cobas TaqScreen West Nile Virus Test. Tipo di pool Volume minimo di plasma Pool primario di 6 * 3 ml Pool primario di 1 * 3 ml Pool ripetuto da provetta 1,5 ml Pool di risoluzione da provetta 2 ml *Include la creazione di una piastra a pozzetti profondi F. Non congelare il sangue intero. G. È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Si sconsiglia di utilizzare campioni eparinizzati. H. Le piastre a pozzetti profondi con la loro copertura possono essere conservate a 2-8 C per sette giorni a partire dalla data della plasmaferesi. In alternativa, le piastre a pozzetti profondi con la loro copertura possono essere conservate a -18 C per periodi più lunghi. I. Non sono stati osservati effetti negativi sulla performance del test quando i campioni di plasma sono stati sottoposti a tre (3) cicli di congelamento/scongelamento. J. Prima dell'uso, equilibrare a temperatura ambiente i campioni individuali o i pool di campioni dei donatori. K. Se i campioni devono essere trasportati, impacchettare ed etichettare le provette nel rispetto delle normative nazionali e internazionali per il trasporto di campioni e agenti eziologici. 10 L. Potrebbero essere generati risultati falsi positivi se non si previene adeguatamente la contaminazione crociata durante la manipolazione e l'analisi dei campioni. Campioni cadaverici A. Con il test cobas TaqScreen WNV è possibile utilizzare campioni cadaverici di sangue raccolti in provette con anticoagulante EDTA o in provette per siero. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore delle provette. La stabilità dei campioni risente delle temperature elevate. B. Il sangue cadaverico raccolto in anticoagulante EDTA può essere conservato fino a 24 ore a 2-25 C prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8 C per altri sette giorni, quindi altri 30 giorni a -18 C. Il plasma cadaverico in EDTA può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo. C. Il sangue cadaverico raccolto sotto forma di siero può essere conservato fino a 24 ore a 2-8 C (e di queste, 4 ore possono essere a 2-25 C) prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla separazione del siero dal coagulo mediante centrifugazione a x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il campione di siero può essere conservato a 2-8 C fino a tre giorni. In alternativa, qualora il siero sia separato dal coagulo, i campioni cadaverici di siero moderatamente emolizzati possono essere conservati a -18 C fino a 15 giorni, mentre i campioni cadaverici di siero altamente emolizzati possono essere conservati a -18 C fino a 8 giorni. I campioni cadaverici di siero possono essere congelati e scongelati per tre (3) volte al massimo. D. I campioni cadaverici diluiti con rapporto 1:5 nel diluente cobas TaqScreen per campioni cadaverici possono essere conservati fino a 7 giorni a 2-8 C e, dopo la rimiscelazione (pipettando su e giù quattro (4) volte in ogni provetta), possono essere analizzati con il test cobas TaqScreen WNV. E. Per l'eventuale trasporto, impacchettare ed etichettare i campioni nel rispetto delle normative nazionali e internazionali per il trasporto dei campioni e degli agenti eziologici. 10 F. Potrebbero essere generati risultati falsi positivi se non si previene adeguatamente la contaminazione crociata durante la manipolazione e il trattamento dei campioni IT 14 Doc Rev. 2.0

15 CREAZIONE DI POOL E PIPETTAMENTO DEI CAMPIONI 1. Il sistema cobas s 201 utilizza lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor per tutte le attività di pipettamento e creazione dei pool di campioni. Lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor acquisisce i codici a barre dei campioni e crea i poll utilizzando aliquote dei campioni di identico volume. 2. Se vengono individuati pool reattivi dal test cobas TaqScreen West Nile Virus, lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor viene utilizzato per pipettare i singoli campioni dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette con i campioni di origine ed eseguire i test di risoluzione. NOTE SULLA PROCEDURA A. Attrezzatura 1. Preparare il sistema cobas s 201 seguendo le istruzioni contenute nel Manuale operativo del sistema cobas s Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati per garantire il corretto funzionamento degli strumenti. B. Reagenti 1. Prima dell'uso, equilibrare per 30 minuti a temperatura ambiente i reagenti del test cobas TaqScreen West Nile Virus, il kit di controlli cobas TaqScreen West Nile Virus e il reagente di lavaggio cobas TaqScreen. Per informazioni sulle condizioni di conservazione dei reagenti, vedere la sezione Requisiti per la manipolazione e la conservazione. 2. Ogni kit cobas TaqScreen West Nile Virus Test contiene materiale sufficiente per eseguire 96 test, preferibilmente suddivisi in batch da 24 test ciascuno per ogni rack SK24. Con ogni batch o rack SK24 è necessario analizzare anche un replicato del controllo negativo [WNV ( ) C] e un replicato del controllo positivo [WNV (+) C]. 3. Ogni kit di diluenti cobas TaqScreen per campioni cadaverici contiene materiale sufficiente per un totale di 96 test, preferibilmente suddivisi in sedute in batch fino a 24 test per ogni rack SK24. Con ogni batch o rack SK24 è necessario analizzare anche un replicato del controllo negativo [WNV ( ) C] e un replicato del controllo positivo [WNV (+) C]. Con il test cobas TaqScreen WNV il trattamento dei controlli è lo stesso, sia con i campioni di donatori viventi, sia con i campioni cadaverici. 4. Tutti i controlli sono monouso. 5. Il sistema impedirà l'uso di eventuali reagenti rimasti sullo strumento COBAS AmpliPrep per un numero di ore superiore al consentito (più di 40 ore cumulative e 30 giorni dopo il primo utilizzo), di eventuali reagenti scaduti o di eventuali cassette miste, appartenenti a un set di quattro cassette già utilizzate nel sistema. C. Trattamento dei campioni 1. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli. 2. Fare attenzione ad evitare la contaminazione dei campioni e del controllo negativo [WNV ( ) C] con i controlli positivi IT 15 Doc Rev. 2.0

16 ISTRUZIONI PER L'USO Il sistema cobas s 201 si basa su quattro procedure principali: pipettamento di campioni e controlli con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor; preparazione dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep e il test cobas TaqScreen WNV; amplificazione/rivelazione con l analizzatore COBAS TaqMan ; gestione dei dati. In base alla configurazione del sistema cobas s 201, è possibile utilizzare fino a sei strumenti Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, cinque stazioni di lavoro Data Manager e dieci stazioni dati AMPLILINK. Ogni stazione dati AMPLILINK supporta fino a tre strumenti COBAS AmpliPrep e due analizzatori COBAS TaqMan. Per informazioni più dettagliate sul sistema cobas s 201, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. Ogni kit cobas TaqScreen West Nile Virus Test contiene otto cassette: due cassette di reagente WNV CS1 con particelle di vetro magnetiche (Magnetic Glass Particles, MGP); due cassette di reagente WNV CS2 con il Reagente di lisi; due cassette di reagente WNV CS3 con la Proteasi e il Tampone di eluizione; due cassette di reagente WNV CS4 con controllo interno (IC), Master Mix (MMX) e soluzione di manganese. Questo kit di analisi è destinato all'uso con il kit di controlli cobas TaqScreen WNV e con il reagente di lavaggio cobas TaqScreen, mentre per l'analisi dei campioni cadaverici è necessario utilizzare il kit di diluenti cobas TaqScreen per campioni cadaverici. Nota: non aprire le cassette. Nota: non unire reagenti di lotti diversi o flaconi diversi dello stesso lotto. Nota: non mescolare reagenti (incluse le cassette) provenienti da kit diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS AmpliPrep. Nota: non separare le provette di controllo dai rispettivi adattatori (portaprovette in plastica). Nota: il software PDM verifica che un batch venga eseguito su un solo strumento COBAS AmpliPrep e un solo analizzatore COBAS TaqMan collegati alla stessa stazione dati AMPLILINK. Nota: non suddividere i batch tra più strumenti COBAS AmpliPrep o analizzatori COBAS TaqMan. Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati, come descritto nel Manuale operativo del sistema cobas s 201. Per istruzioni dettagliate per l'uso, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. È importante che l'utente segua attentamente le istruzioni fornite nel Manuale operativo del sistema cobas s 201. A. Pipettamento di controlli e campioni con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor Nota: evitare di contaminare i guanti durante la preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: miscelare i controlli capovolgendoli delicatamente per tre volte, evitando che si formino bolle d'aria. Nota: per l'esecuzione del test sui campioni cadaverici, l'uso delle piastre a pozzetti profondi è disattivato al momento dell'installazione del sistema cobas s 201. A1. Eseguire le procedure di avvio dello strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, quindi avviare la procedura guidata Roche PDM Pooling Wizard e attenersi alle istruzioni visualizzate. A2. Fare attenzione a non danneggiare il codice a barre sulle provette campione e sugli adattatori delle provette di controllo. Se il codice a barre è danneggiato, il sistema non riconosce i campioni e i controlli. A3. Rimuovere il tappo dalle provette di controllo e caricare i campioni, i materiali di consumo e i controlli sul pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo che i campioni, il materiale di consumo e i controlli sono stati caricati, lo strumento trasferisce i controlli e i campioni nelle provette campione. I campioni e i controlli sono stabili per 5 ore al massimo nelle provette aperte e per altre 5 ore nelle provette campione IT 16 Doc Rev. 2.0

17 A4. Nel caso di campioni cadaverici individuali, pipettare 2000 μl di diluente CADV SPEC DIL in provette da 13 x 100 mm debitamente etichettate, aggiungere 500 μl di campione cadaverico in ogni singola provetta, quindi miscelare i campioni uno ad uno pipettandoli su e giù per quattro (4) volte. A questo punto è possibile caricare i campioni cadaverici diluiti, il materiale di consumo e i controlli sul pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo che i campioni cadaverici diluiti, i materiali di consumo e i controlli sono stati caricati, lo strumento trasferisce i controlli e i campioni diluiti nelle provette campione. I campioni cadaverici diluiti e i controlli WNV sono stabili fino a 5 ore nelle provette aperte. Nota: per ottenere una diluizione 1:10 del reagente [WNV (+) C], è necessario caricare due provette di controllo [WNV ( ) C] per ogni provetta di controllo [WNV (+) C] utilizzata. A5. Al termine della seduta di pipettamento, visualizzare gli allarmi e stampare i report dei pool. Ispezionare i pool e i pozzetti della piastra a pozzetti profondi. Invalidare i pool e/o i pozzetti se si osserva la contaminazione con globuli rossi o se i volumi non sono uniformi. A6. Tappare le provette campione e trasferire i rack SK24 sullo strumento COBAS AmpliPrep per l'estrazione degli acidi nucleici. Dopo il trasferimento sullo strumento COBAS AmpliPrep, tutti i target virali e i controlli sono stabili per 5 ore nelle provette campione. A7. Tappare e riporre le piastre a pozzetti profondi (se sono state create durante la sessione di pipettamento). Le piastre a pozzetti profondi possono essere conservate fino a 7 giorni a 2-8 C o a -18 C per periodi più lunghi. A8. Rimuovere e conservare le provette dei donatori. Per informazioni sulle condizioni di conservazione, vedere la sezione "Raccolta, conservazione e creazione di pool di campioni". A9. Rimuovere e gettare via le provette di controllo (le provette di controllo sono monouso). B. Preparazione e caricamento dei reagenti del test cobas TaqScreen West Nile Virus Nota: fare attenzione a non danneggiare le etichette delle cassette. Il lettore di codici a barre dello strumento COBAS AmpliPrep acquisisce automaticamente il codice a barre di ogni cassetta mentre vengono caricati i rack per reagenti. B1. Equilibrare i reagenti a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima di trattare il primo campione. Non è necessario preparare i reagenti in altro modo. B2. Prima di iniziare, provvedere a caricare un numero di cassette sufficiente per il trattamento ininterrotto di tutti i campioni inclusi nella seduta sullo strumento COBAS AmpliPrep. Ogni cassetta contiene reagenti sufficienti per 48 test. Per informazioni su come caricare un numero di reagenti sufficiente per evitare di interrompere la seduta, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. B3. Inserire la cassetta WNV CS1 in un rack per reagenti, verificando che il codice a barre della cassetta sia allineato al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. Le cassette WNV CS1 devono essere caricate tutte insieme in un rack per reagenti diverso da quello delle altre cassette. B4. Caricare il rack per reagenti contenente la cassetta WNV CS1 nella posizione per rack A, farlo scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS AmpliPrep, quindi attendere che il LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella posizione finale. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento. B5. Per ogni cassetta WNV CS1 inserire un set di cassette WNV CS2, WNV CS3 e WNV CS4 in un rack per reagenti, verificando che i codici a barre delle cassette siano allineati al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. B6. Caricare il rack per reagenti nella posizione per rack B, C, D o E, farlo scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS AmpliPrep, quindi attendere che il LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella posizione finale. B7. I LED sulla barra di stato dello strumento COBAS AmpliPrep diventeranno verdi quando tutti i componenti del kit necessari saranno stati caricati e riconosciuti dal sistema IT 17 Doc Rev. 2.0

18 C. Estrazione degli acidi nucleici da campioni e controlli pipettati Nota: eseguire questa procedura su una superficie di lavoro pulita. C1. Rimuovere il rivestimento dall'involucro delle unità SPU, lasciando intatto il nastro e la copertura in plastica. C2. Dopo aver rivolto il bordo più largo del rack per SPU verso l operatore, inserire l'involucro con le unità SPU facendo attenzione che sia a livello con il lato destro del rack per SPU. C3. Rimuovere il nastro e il coperchio di plastica dalle unità SPU, dopo averle inserite nel rack. Assicurarsi che tutte le unità SPU siano perfettamente inserite dentro il rack e siano a livello. Se vi sono unità SPU sollevate, lo strumento potrebbe smettere di funzionare. Non esercitare pressioni sull'ago per campioni nell'unità SPU. C4. Spingere i rack per SPU caricati nelle posizioni I, J o K dello strumento COBAS AmpliPrep finché il rack non sarà perfettamente inserito e identificato. Lo strumento può ospitare un massimo di 72 unità SPU alla volta. Caricare almeno le unità SPU necessarie per completare la seduta, o eventualmente un numero maggiore. C5. Rimuovere il rivestimento in cellophane dalle confezioni originali dei rack per provette K e per puntali K, facendo attenzione a non rovesciare i rack. Controllare che siano tutti inseriti perfettamente. C6. Spingere il numero necessario di rack per provette K e per puntali K nelle posizioni M, N, O o P dello strumento COBAS AmpliPrep. C7. Creare gli ordini dalla stazione di lavoro con il software AMPLILINK. C8. Nelle posizioni F, G o H dello strumento COBAS AmpliPrep caricare i rack SK24 contenenti i campioni e i controlli pipettati con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. Spingere finché i rack non si bloccano. Controllare lo stato del sistema nella finestra Sample, verificando che siano stati identificati tutti i campioni in ogni rack. C9. Nel software AMPLILINK verificare che sia stato caricato un numero sufficiente di reagenti e materiali di consumo per la preparazione dei campioni desiderati. C10. Sulla stazione di lavoro con il software AMPLILINK premere Start, in modo da avviare la procedura di preparazione dei campioni sullo strumento COBAS AmpliPrep. C11. Tutti i puntali K e le provette K inutilizzati resteranno bloccati all'interno dello strumento COBAS AmpliPrep e potranno essere utilizzati nella seduta successiva. D. Amplificazione e rivelazione Nota: la soluzione di lavoro Master Mix con i campioni trattati contenuti nel rack SK24 hanno una stabilità limitata. L'analizzatore COBAS TaqMan deve essere pronto ad accettare i campioni trattati non appena lo strumento COBAS AmpliPrep avrà completato la preparazione dei campioni. D1. Trasferire sull'analizzatore COBAS TaqMan il rack SK24 contenente i campioni trattati. L'analizzatore COBAS TaqMan avvierà automaticamente l'amplificazione e la rivelazione. La seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan deve essere avviata entro 1 ora dal completamento della preparazione dei campioni per il rack SK24. I risultati dei rack SK24 che non verranno trasferiti entro 1 ora non saranno validi. Fanno eccezione i risultati reattivi in un batch valido, che verranno segnalati nel report come reattivi. D2. Al termine dell'amplificazione e della rivelazione con l'analizzatore COBAS TaqMan, i campioni vengono espulsi automaticamente nel contenitore dei rifiuti. D3. Accettare i risultati sulla stazione di lavoro con il software AMPLILINK. D4. I risultati vengono inviati automaticamente al software PDM IT 18 Doc Rev. 2.0