cobas TaqScreen DPX Test DPX

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1 cobas TaqScreen DPX Test for use on the cobas s 201 system PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. cobas TaqScreen DPX Test DPX 96 Tests P/N: cobas TaqScreen DPX Control Kit DPX CTL 12 Sets P/N: cobas TaqScreen Wash Reagent TS WR 5.1 L P/N: USO PREVISTO Il test cobas TaqScreen DPX, destinato all'uso sul sistema cobas s 201, è un test di amplificazione in vitro degli acidi nucleici per le finalità di quantificazione diretta del DNA del parvovirus B19 (B19V), genotipi 1, 2 e 3, e di rivelazione qualitativa diretta dell'rna del virus dell'epatite A (HAV), genotipi I, II e III, nel plasma umano. Il test cobas TaqScreen DPX è destinato all'uso come "test in processo" per la sola quantificazione del DNA del parvovirus B19 o per la simultanea quantificazione del DNA di parvovirus B19 e rivelazione dell'rna del virus dell'epatite A nel plasma destinato ad ulteriore lavorazione. È possibile utilizzare plasma ottenuto da sangue intero (plasma recuperato) o raccolto per aferesi (plasma di origine). Il plasma ottenuto da tutti i donatori o dai pool in lavorazione può essere sottoposto al test utilizzando i campioni individuali o i pool, che sono costituiti dalle aliquote dei campioni individuali. Questo test non può essere utilizzato sui campioni di sangue del cordone ombelicale. Questo test non può essere utilizzato a scopo diagnostico. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST Il test cobas TaqScreen DPX incorpora molteplici coloranti che consentono la rivelazione simultanea di target individuali senza l'uso di test discriminanti. In base al file di definizione del test (Test Definition File, TDF) installato, con il test cobas TaqScreen DPX è possibile ottenere risultati sia quantitativi per il virus B19V che qualitativi per il virus HAV, oppure solo risultati quantitativi per il virus B19V. Il parvovirus umano B19 (B19V) è un piccolo virus privo di involucro (envelope), con DNA a filamento singolo, appartenente al genere Erythrovirus della famiglia delle Parvoviridae 1. Gli eritrovirus umani sono raggruppati in tre genotipi distinti: genotipo 1 (ceppi B19V), genotipo 2 (ceppi A6) e genotipo 3 (ceppi V9/D91.1) 1. Il virus B19V è diffuso in tutto il mondo e, in base ad alcuni studi sierologici, almeno il 50% degli adulti possiede gli anticorpi IgG anti-b19v, il che indica un'infezione pregressa 2, 3. Il virus è associato a una patologia clinica la cui manifestazione e gravità dipendono dalle condizioni immunologiche ed ematologiche del soggetto 4. Nei soggetti immunocompetenti l'infezione è spesso asintomatica o si manifesta in forme lievi, ad esempio eritema infettivo (quinta malattia) in età pediatrica o artropatia in età adulta. Tuttavia il virus B19V può anche causare patologie gravi, ad esempio crisi aplastiche transitorie in soggetti con disfunzioni ematologiche e idrope, anemia congenita o morte fetale durante la gravidanza 4. La prevalenza di B19V nei donatori di sangue e plasma può variare tra 0,003 e 0,6%, a seconda che il prelievo venga effettuato o meno mentre è in corso un'epidemia 5, 6. Pur trasmettendosi preferibilmente per via aerea, l'infezione da B19V può anche essere veicolata dai derivati del plasma per effetto delle dimensioni dei pool, dell'incidenza delle infezioni acute e asintomatiche da B19V, dei livelli elevati di virus in una donazione viremica (fino a UI/ml) e della resistenza del virus B19V alla maggior parte dei trattamenti di inattivazione/rimozione virale più comuni, ad esempio il trattamento con solvente/detergente (S/D) e la pastorizzazione 7. La presenza del DNA di B19V nei pool di plasma e nei plasmaderivati è stata segnalata 8-10 e ampiamente documentata nella letteratura scientifica che si è occupata della trasmissione del virus B19V a causa della somministrazione di plasmaderivati, in particolare dei fattori della coagulazione 7, La sezione Revisione del documento si trova in fondo a questo documento. 1

2 Il virus dell'epatite A (HAV) è un piccolo virus a RNA privo di involucro (envelope), appartenente al gruppo degli Hepatovirus della famiglia Picornaviridae 14. L'HAV ha una diffusione globale e si trasmette per via oralefecale, principalmente attraverso il contatto personale ravvicinato. Nei Paesi in via di sviluppo, dove le epidemie sono frequenti, l'infezione viene contratta nei primi anni di vita e gran parte della popolazione adulta è dunque protetta dagli anticorpi anti-hav 15. Nei Paesi industrializzati si è invece assistito ad un graduale declino del tasso di incidenza del virus, che ha determinato un avanzamento dell'infezione verso l'età adulta 16. Negli esseri umani le infezioni da HAV possono manifestarsi in modo altamente variabile, da infezioni totalmente asintomatiche (soprattutto in età pediatrica) ad epatiti fulminanti con possibile esito mortale in alcuni casi. Nell'Europa del Nord, in Giappone, in Canada e negli USA la prevalenza nella popolazione generale è molto bassa (circa 0,01%), pertanto l'insorgenza dell'infezione è in genere associata ai gruppi considerati a rischio, ad esempio i viaggiatori che si recano nelle regioni endemiche 17. L'HAV può essere raggruppato in diversi genotipi (I - VI). Negli esseri umani sono stati osservati i genotipi I, II e III 18, 19. Sebbene l'hav infettivo possa trovarsi nel sangue nel periodo finestra sierologico 20, il rischio di trasmissione dell'hav mediante trasfusione è molto basso. Ciononostante, come il virus B19V anche il virus HAV non viene facilmente inattivato con un trattamento S/D o la pastorizzazione e sono stati segnalati casi di trasmissione di HAV attraverso i plasmaderivati, in prevalenza i fattori della coagulazione La tecnologia NAT consente di verificare la contaminazione dei pool di plasma con B19V e HAV, pertanto a partire dal 2000 alcuni produttori di plasma hanno iniziato ad eseguire i test NAT per ricercare il DNA di B19V e l'rna di HAV nel plasma destinato ad ulteriore lavorazione. Questi test avevano lo scopo di ridurre il carico di B19V nei pool di plasma e di eliminare tutte le unità contaminate dall'hav. I test di questo tipo sono definiti "test in processo". Dopo aver preso atto della presenza delle IgG anti-b19v nei pool di plasma e delle trasmissioni segnalate di B19V attraverso prodotti contenenti > 10 4 UI/ml di DNA di B19V 7, la FDA e le autorità omologhe dell'ue hanno ritenuto opportuno suggerire un limite di < 10 4 UI/ml di DNA di B19V per i pool di plasma, per quanto riguarda sia il plasma destinato ad ulteriore lavorazione nella produzione delle immunoglobuline anti-d, sia il plasma che viene sottoposto a trattamento per l'inattivazione virale 24, 25, 26. Al momento i test per l'hav sui pool di plasma non sono regolamentati a livello legislativo, tuttavia in base alle disposizioni dell'ue, se vengono eseguiti i test NAT per l'hav sui pool di plasma come parte integrante dei "test in processo", il test utilizzato deve avere la capacità di rivelare un controllo contenente 100 UI/ml di RNA di HAV 26. Il test cobas TaqScreen DPX è un test duplex per la rivelazione simultanea del B19V e dell'hav in campioni individuali o in pool di campioni di plasma di origine umana. Grazie all'uso della tecnologia con coloranti multipli, è possibile identificare ogni target virale senza eseguire ulteriori test discriminanti. Il test fornisce inoltre un valore quantitativo (espresso in UI/ml) per il target B19V attraverso l'uso di uno standard di quantificazione (Quantitation Standard, QS) con tracciabilità diretta allo standard internazionale B19V dell'oms 27. Lo standard QS con un Controllo Interno (Internal Control, IC) per il target HAV viene co-estratto e co-amplificato insieme ad ogni campione. Il test cobas TaqScreen DPX si basa su una tecnica generica per la preparazione degli acidi nucleici sullo strumento COBAS AmpliPrep. Il DNA di B19V, l'rna del virus HAV, lo standard QS e il controllo IC vengono amplificati e rivelati in una provetta singola eseguendo l'analisi PCR realtime automatizzata sull'analizzatore COBAS TaqMan. È possibile ottenere la discriminazione del target virale, dello standard QS e del controllo IC grazie all'uso di sonde fluorescenti che vengono rivelate in canali separati dell'analizzatore COBAS TaqMan. Nel test è incorporato l'enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi), che riduce la potenziale contaminazione con materiale amplificato in precedenza (amplicone). PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test cobas TaqScreen DPX per l'utilizzo sul sistema cobas s 201 si basa su 4 procedure principali: 1. Creazione automatizzata dei pool di campioni e pipettamento dei controlli con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (opzionale) 2. Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep 3. Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici e rivelazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS TaqMan 4. Gestione automatizzata dei dati con il software PDM (Pooling and Data Management) 2

3 Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD automatizza il pipettamento dei campioni individuali dei donatori, la creazione di pool costituiti da più campioni dei donatori e il pipettamento dei controlli del test. Il sistema cobas s 201 risolve i pool reattivi scomponendo i risultati dei singoli campioni che costituiscono il pool. Il sistema cobas s 201 è progettato in modo specifico per il trattamento dei campioni in batch. Il batch è un gruppo di campioni e controlli da sottoporre tutti insieme alle procedure di pipettamento, estrazione, amplificazione e rivelazione. Al termine del pipettamento di un batch con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, l'intero rack per campioni viene trasferito sullo strumento COBAS AmpliPrep per la fase successiva della procedura. Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep Vengono trattati simultaneamente gli acidi nucleici dei campioni, le molecole aggiunte del controllo interno (IC) di Armored RNA di HAV e le molecole dello standard di quantificazione (QS) del DNA di B19V incapsulate in lambda (che agiscono come controlli per la preparazione dei campioni e per il processo di amplificazione/rivelazione/quantificazione). Il test cobas TaqScreen DPX contiene i reagenti necessari per completare una sequenza di cinque fasi sullo strumento COBAS AmpliPrep. La soluzione di proteinasi, coinvolta nella digestione enzimatica delle proteine, consente di indurre la lisi, inattivare le nucleasi e facilitare il rilascio dell'rna e del DNA dalle particelle virali. L'aggiunta del reagente di lisi nel campione induce la lisi virale e l'inattivazione delle nucleasi attraverso la denaturazione delle proteine. L'RNA e il DNA vengono rilasciati e simultaneamente protetti dalle nucleasi. Gli acidi nucleici rilasciati si legano alla superficie di silice delle biglie magnetiche (Magnetic Glass Particles, MGP) aggiunte. Ciò avviene prevalentemente a causa della carica positiva netta sulla superficie delle biglie magnetiche e della carica negativa netta degli acidi nucleici, dovuta alla concentrazione dei sali caotropici e alla forza ionica della reazione di lisi. Il reagente di lavaggio rimuove le sostanze non legate e le impurità, come le proteine denaturate, i detriti cellulari e i potenziali inibitori della PCR (ad esempio l'emoglobina), riducendo la concentrazione salina. Gli acidi nucleici purificati vengono rilasciati dalle biglie magnetiche a una temperatura elevata con il tampone di eluizione. Amplificazione automatizzata e rivelazione dell'acido nucleico con l'analizzatore COBAS TaqMan Dopo la fase di preparazione automatizzata dei campioni, durante la quale gli acidi nucleici purificati vengono isolati dal plasma umano, viene utilizzato il reagente Master Mix (MMX) cobas TaqScreen DPX per eseguire l'amplificazione/rivelazione dell'rna di HAV e dell'rna del controllo interno (IC) e l'amplificazione/ quantificazione del DNA di B19V e del DNA dello standard di quantificazione (QS). Dopo l'attivazione tramite l'aggiunta di acetato di manganese, il reagente Master Mix cobas TaqScreen DPX consente la trascrizione inversa (per i target RNA), quindi l'amplificazione PCR delle regioni altamente conservate dell'rna di HAV, dell'rna del controllo IC, del DNA di B19V e del DNA dello standard QS grazie all'uso di primer specifici. Gli ampliconi vengono rivelati tramite l'ibridazione delle sonde oligonucleotidiche specifiche. L'amplificazione, l'ibridazione e la rivelazione avvengono simultaneamente. Trascrizione inversa e amplificazione PCR Le reazioni di trascrizione inversa e amplificazione sono rese possibili da un enzima ricombinante termostabile, denominato DNA Polimerasi Z05. In presenza di manganese (Mn 2+ ), l'enzima DNA Polimerasi Z05 induce le attività di trascrittasi inversa e di polimerasi del DNA. Sia la trascrizione inversa che l'amplificazione PCR possono dunque avere luogo nella stessa miscela di reazione. Durante l'amplificazione PCR, l'elevata temperatura intermittente durante i cicli induce la denaturazione del target e dell'amplicone IC/QS, con la conseguente formazione di un DNA a filamento singolo. La Polimerasi DNA Z05 estende i primer appaiati lungo gli stampi target, producendo una molecola di DNA a filamento doppio (amplicone). Questo processo viene ripetuto per molti cicli e, ad ogni ciclo, la quantità di amplicone raddoppia. L'amplificazione interessa soltanto la regione dei genomi target che è compresa tra i primer, mentre non vengono amplificati i genomi interi. Prevenzione della contaminazione per carry-over È possibile prevenire la contaminazione dell'amplicone dovuta all'effetto carry-over utilizzando l'enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) e il trifosfato di deossiuridina (dutp). La deossiuridina non è presente nel DNA in natura, ma è sempre presente nell'amplicone perché uno dei dntp utilizzati nel reagente Master Mix è una miscela composta da trifosfato di deossiuridina e trifosfato di timidina, pertanto solo l'amplicone contiene deossiuridina. L'enzima AmpErase riconosce i filamenti di DNA che contengono deossiuridina 28 e ne catalizza la distruzione aprendo la catena di deossiribosio in posizione C1, rendendo così il DNA non amplificabile. Non sono interessati il DNA contenente deossitimidina e l'rna contenente ribouridina 29, 30. Nella fase iniziale della trascrizione inversa, l'enzima AmpErase catalizza la segmentazione dell'amplicone del carry-over al livello dei residui di deossiuridina. Dopo l'esposizione a temperature superiori ai 55 C, l'enzima AmpErase è inattivo per un periodo di tempo prolungato, durante il quale non distrugge l'amplicone target che si è appena formato. 3

4 31, 32 Rivelazione dei prodotti della PCR Il reagente MMX cobas TaqScreen DPX contiene sonde di rivelazione che sono specifiche per gli acidi nucleici di HAV, IC, B19V o QS. Ogni sonda di rivelazione è marcata con 1) uno dei quattro fluorocromi che agiscono da reporter e 2) un altro fluorocromo che funge da quencher. Ogni specifico fluorocromo reporter è associato al rispettivo target e viene misurato a una lunghezza d'onda precisa. Per tutte le sonde viene utilizzato un solo tipo di fluorocromo quencher. Questo sistema assicura la rivelazione di tutti i target amplificati a lunghezze d'onda differenti. Prima che l'amplificazione PCR abbia inizio, le sonde sono intatte e la fluorescenza del fluorocromo reporter è soppressa dall'azione del colorante quencher, in virtù del trasferimento di energia tipo Förster. Durante l'amplificazione PCR, le sonde si ibridizzano a specifiche sequenze di DNA a filamento singolo e si segmentano per effetto dell'attività della 5'-3' nucleasi della DNA polimerasi Z05, nello stesso momento in cui avviene l'amplificazione. Una volta che i fluorocromi reporter e quencher vengono separati per effetto di questa segmentazione, l'attività di fluorescenza del reporter viene rivelata. Con ogni ciclo di PCR vengono generate quantità maggiori di sonde segmentate e il segnale cumulativo del fluorocromo reporter aumenta parallelamente. È possibile ottenere la rivelazione real-time dei prodotti della PCR misurando la fluorescenza dei fluorocromi reporter rilasciati, che individualmente rappresentano i target virali, il controllo IC e lo standard QS. Gestione automatizzata dei dati con il software PDM Il software Roche PDM consente all'operatore di esaminare i risultati e creare i report. Il software Roche PDM classifica i risultati dei test cobas TaqScreen DPX come non reattivi, reattivi o non validi per quanto riguarda il target HAV e < cutoff, cutoff o non valido per quanto riguarda il target B19V. Oltre che per recuperare ed esaminare i risultati della PCR, il software Roche PDM può essere utilizzato dall'operatore per stampare i report, cercare i risultati, accettare i risultati dei donatori e trasmettere i dati a un sistema LIS (opzionale). MATERIALI FORNITI DA ROCHE I kit necessari che vengono forniti per la rivelazione dell'rna del virus HAV e la quantificazione del DNA di B19V nei campioni di plasma sono tre: 1) cobas TaqScreen DPX Test 2) cobas TaqScreen DPX Control Kit e 3) cobas TaqScreen Wash Reagent. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale. cobas TaqScreen DPX Test (P/N: ) DPX CS1 (Cassetta di reagente MGP per DPX) DPX CS2 (Cassetta di reagente di lisi per DPX) DPX CS3 (Cassetta multireagente per DPX) DPX CS4 (Cassetta di reagente test-specifico per DPX) cobas TaqScreen DPX Control Kit Kit di controlli cobas TaqScreen DPX (P/N: ) DPX D(+)C (Controllo doppio HAV-positivo e B19V-basso positivo) DPX H(+)C (Controllo B19V-positivo alto) DPX ( ) C (Controllo negativo cobas TaqScreen DPX) DPX DPX CTL 96 test 12 set 4

5 cobas TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (Reagente di lavaggio cobas TaqScreen) ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE (ACQUISTABILI PRESSO ROCHE) TS WR 5,1 l Questo test deve essere obbligatoriamente eseguito sul sistema cobas s 201. Il sistema cobas s 201 deve essere obbligatoriamente installato e utilizzato come una configurazione completa. I singoli componenti del sistema cobas s 201 non possono essere utilizzati separatamente uno dall'altro, né possono essere sostituiti con altri componenti. Il sistema cobas s 201 utilizza i componenti elencati di seguito. Strumentazione e software per il sistema cobas s 201 Pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (opzionale), workstation e software Pooling Manager Strumento COBAS AmpliPrep Analizzatore COBAS TaqMan Stazione dati e software AMPLILINK Server Roche PDM Data Manager, workstation e software Data Manager File di definizione del test DPX per il test cobas TaqScreen DPX File di definizione del test Parvovirus B19 (B19V) per il test cobas TaqScreen DPX Manuale operativo del sistema cobas s Configurazione D Rack e materiali di consumo Rack per campioni COBAS AmpliPrep (SK24) (P/N: ) Rack per SPU COBAS AmpliPrep (P/N: ) Rack per reagenti COBAS AmpliPrep (P/N: ) Unità di trattamento campioni (Sample Processing Units, SPU) (P/N: ) Provette per campioni iniziali (provette S) con clip dei codici a barre (P/N: ) Rack per puntali K (P/N: ) Confezione di provette K da 12 x 96 (P/N: ) Carrier K per COBAS TaqMan (P/N: ) Puntali CO-RE a volume elevato (1000 μl), filtro (P/N: ) Piastre a pozzetti profondi con etichette del codice a barre (P/N: ) Coperchi per piastre a pozzetti profondi (P/N: ) Rack portacampioni per 24 provette di analisi (P/N: ) Rack portacampioni per 32 provette di analisi (P/N: ) Rack portapuntali (P/N: ) Rack per piastre a pozzetti profondi (P/N: ) Vassoio per rack SK24 (P/N: ) Kit spray disinfettante Hamilton (P/N: ) Kit detergente Hamilton MICROLAB (P/N: ) Guanti monouso, senza talco 5

6 REAGENTI cobas TaqScreen DPX Test (P/N: ) DPX CS1 MGP (Biglie magnetiche) Biglie magnetiche 93% Isopropanolo Xi 93% (p/p) Isopropanolo DPX 96 test 2 x 48 test 2 x 7,0 ml Irritante F 93% (p/p) Isopropanolo Facilmente infiammabile DPX CS2 LYS (Reagente di lisi) Diidrato di citrato di sodio 42,5% Tiocianato di guanidina < 14% Polidocanolo 0,9% Ditiotreitolo Xn 42,5% (p/p) Tiocianato di guanidina 2 x 48 test 2 x 78 ml Nocivo DPX CS3 Pase (Soluzione proteinasi) Tampone TRIS < 0,05% EDTA Cloruro di calcio Acetato di calcio 7,8% Proteinasi Glicerolo Xn 7,8% (p/p) Proteinasi 2 x 48 test 2 x 3,8 ml Nocivo EB (Tampone di eluizione) Tampone TRIS 0,2% Conservante Metilparaben 2 x 7,0 ml 6

7 DPX CS4 DPX MMX-R1 (Master Mix DPX Reagente 1) Acetato di potassio Acetato di manganese Glicerolo 14,4% Dimetil sulfoxide 0,08% Sodio azide Acido acetico DPX MMX-R2 (Master Mix DPX Reagente 2) Tampone tricina Acetato di potassio Idrossido di potassio 4,1% Dimetil sulfoxide Glicerolo Tween 20 < 0,09% datp, dgtp, dctp, dutp, dttp < 0,01% Primer upstream e downstream per B19V e HAV < 0,01% Sonde fluorescenti per B19V e HAV < 0,01% Sonde fluorescenti per QS di B19V e IC di HAV < 0,01% Aptamero oligonucleotidico < 0,01% DNA Polimerasi Z05 (batterica) < 0,01% Enzima AmpErase [uracil-n-glicosilasi] (batterico) 0,08% Sodio azide DPX IC/QS (Controllo Interno e standard di quantificazione DPX) Tampone TRIS 0,002% Poly ra RNA (sintetico) EDTA 0,05% Sodio azide < 0,001% RNA di IC sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago MS2 < 0,001% DNA di QS B19V sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago Lambda 2 x 48 test 2 x 3,0 ml 2 x 2,5 ml 2 x 13 ml cobas TaqScreen DPX Control Kit Kit di controlli cobas TaqScreen DPX (P/N: ) DPX CTL 12 set DPX D(+)C (Controllo positivo doppio DPX) < 0,001% RNA di HAV sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago MS2 < 0,001% DNA di B19V sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago Lambda Plasma umano negativo, non reattivo (in base ai test su licenza della FDA USA) a: IgG B19V e IgM Ab, HBsAg, HBV core Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab e RNA di HIV-1. Non reattivo in base ai test NAT per RNA di HAV; e DNA di B19V 5 UI/ml in base ai metodi PCR. 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2-metil-3(2H)-isotiazolone 12 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. 7

8 DPX H(+)C (Controllo positivo alto DPX) < 0,001% DNA di B19V sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago Lambda Plasma umano negativo, non reattivo (in base ai test su licenza della FDA USA) a: IgG B19V e IgM Ab, HBsAg, HBV core Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab e RNA di HIV-1. Non reattivo in base ai test NAT per RNA di HAV; e DNA di B19V 5 UI/ml in base ai metodi PCR. 0,1% conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2-metil-3(2H)-isotiazolone 12 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. DPX ( ) C (Controllo negativo cobas TaqScreen DPX) Tampone fosfato di sodio EDTA 0,002% Poly ra RNA (sintetico) Colorante amaranto 0,1% conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone 12 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. cobas TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (Reagente di lavaggio cobas TaqScreen) Diidrato di citrato di sodio 0,1% Conservante Metilparaben TS WR 5,1 litri REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE A. La temperatura ambiente è definita tra 15 e 30 C. B. Non congelare i reagenti e i controlli. C. Conservare i reagenti DPX CS1, DPX CS2, DPX CS3 e DPX CS4 tra 2 e 8 C. I reagenti in confezione integra sono stabili fino alla data di scadenza indicata. D. Dopo l'apertura i reagenti sono stabili per 30 giorni tra 2 e 8 C o fino alla data di scadenza indicata, se precedente. E. I reagenti possono essere utilizzati per un massimo di 6 sedute e per un massimo di 48 ore cumulative sullo strumento COBAS AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8 C tra le sedute. Il software AMPLILINK tiene traccia delle ore di utilizzo delle cassette di reagente sullo strumento COBAS AmpliPrep e impedisce l'uso delle cassette che hanno raggiunto 48 ore cumulative. F. Il software AMPLILINK non tiene traccia del numero di sedute dello strumento che sono state eseguite con le cassette. È compito dell'operatore smaltire le cassette dei reagenti dopo averle utilizzate per 6 sedute dello strumento. G. Conservare i controlli DPX D(+)C, DPX H(+)C e DPX ( ) C tra 2 e 8 C. I controlli sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, è necessario smaltire le parti inutilizzate. 8

9 H. Conservare il reagente TS WR tra 15 e 30 C. In confezione integra, il reagente TS WR è stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente è stabile per 30 giorni tra 15 e 30 C o fino alla data di scadenza, se precedente. PRECAUZIONI PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. A. I campioni potrebbero essere infettivi. Osservare le precauzioni universali durante lo svolgimento del test. 33,34 Questa procedura dovrebbe essere eseguita esclusivamente da personale qualificato ed esperto nell'uso del test cobas TaqScreen DPX e nella manipolazione di materiali infettivi. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro del laboratorio con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio 0,5% e acqua deionizzata o distillata (candeggina diluita). Successivamente pulire la superficie con etanolo 70%. B. ATTENZIONE: i controlli DPX D(+)C e DPX H(+)C contengono plasma umano derivato da sangue umano. Il plasma utilizzato è stato sottoposto ai test NAT opportuni, che ne hanno accertato la non reattività per quanto riguarda gli anticorpi IgG e IgM anti-b19v, HBsAg, HBV core Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab e la non reattività per quanto riguarda l'rna di HIV-1. Il plasma utilizzato è stato inoltre sottoposto ai test cobas TaqScreen DPX, che hanno confermato la non reattività all'rna di HAV e hanno verificato un contenuto di DNA di B19V 5 UI/ml. Allo stato attuale, tuttavia, nessun metodo di analisi garantisce con assoluta certezza che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Tutti i materiali derivati da sangue umano devono essere considerati come potenzialmente infettivi e manipolati nel rispetto delle precauzioni universali. In caso di fuoriuscita accidentale, disinfettare immediatamente l'area con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% (candeggina diluita) o seguire le procedure di laboratorio opportune. C. Osservare le precauzioni di routine del laboratorio. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro designate. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo avere manipolato i campioni e i reagenti del kit, lavarsi accuratamente le mani. D. I reagenti DPX MMX-R1, DPX MMX-R2 e DPX IC/QS contengono sodio azide come conservante. Se le soluzioni contenenti sodio azide devono essere smaltite attraverso l'impianto di scarico, è necessario diluire e sciacquare con abbondante acqua corrente, in modo da evitare l'accumulo di depositi nelle tubature metalliche in grado di dare luogo a reazioni esplosive. E. È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa procedura. F. È consigliabile utilizzare pipette sterili e puntali per pipette privi di nucleasi, di tipo monouso. Se non si previene adeguatamente la contaminazione crociata durante la manipolazione e il trattamento dei campioni, i risultati generati potrebbero essere falsi positivi. G. Per garantire prestazioni ottimali del test, utilizzare soltanto i materiali di consumo forniti e consigliati. H. Manipolare tutti i materiali contenenti campioni o controlli osservando la Buona Prassi di Laboratorio, in modo da prevenire la contaminazione crociata di campioni e controlli. I. Prima dell'uso ispezionare visivamente le singole cassette di reagente, le provette di controllo e il reagente di lavaggio in modo da escludere eventuali segni di perdite. Se si accertano perdite, non utilizzare il materiale per eseguire i test. J. Smaltire tutti i materiali che sono entrati in contatto con i campioni e i reagenti nel rispetto delle leggi pertinenti a livello nazionale e locale. K. Non utilizzare il kit cobas TaqScreen DPX Test, il kit di controlli cobas TaqScreen DPX o il reagente di lavaggio cobas TaqScreen dopo le rispettive date di scadenza. Non scambiare, mescolare o combinare reagenti appartenenti a kit o a lotti diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS AmpliPrep. L. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale. M. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita accidentale dei reagenti, diluire con acqua prima di asciugare. 9

10 N. Evitare che la soluzione LYS, contenente tiocianato di guanidina, entri in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). Tale miscela può produrre un gas fortemente tossico. O. Per un corretto svolgimento del test, attenersi scrupolosamente alle procedure e alle linee guida fornite. Qualunque deviazione dalle procedure e dalle linee guida approvate potrebbe compromettere le prestazioni del test. P. Evitare di utilizzare campioni eccessivamente emolizzati. Q. La contaminazione dei campioni di plasma con globuli rossi (> 5 %) può inibire il test cobas TaqScreen DPX. R. Non utilizzare mai, in nessuna fase del test, componenti con etichette dei codici a barre danneggiate. PREPARAZIONE DEI CONTROLLI E DEI REAGENTI A. Rimuovere i reagenti del kit di controlli cobas TaqScreen DPX e i reagenti del test cobas TaqScreen DPX dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso, in modo da ridurre al minimo la condensa sul codice a barre. PRELIEVO, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DEI POOL DI CAMPIONI Nota: manipolare tutti i campioni come se fossero agenti infettivi. Campioni A. I campioni raccolti utilizzando EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, citrato 4% e BD Vacutainer PPT (Plasma Preparation Tube) sono idonei all'uso con il test cobas TaqScreen DPX. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore delle provette. B. I campioni raccolti in EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, citrato 4% e PPT possono essere conservati fino a 72 ore tra 2 e 30 C e successivamente per altre 48 ore tra 2 e 8 C prima della plasmaferesi. Per periodi di conservazione superiori ai 5 giorni, è necessario separare il plasma dai globuli rossi e conservarlo tra 2 e 8 C fino a 9 giorni. Figura 1 Stabilità del sangue intero 30 Sangue intero (2 C - 30 C) Temperatura ( C) Sangue intero (2 C - 8 C) Plasma (2 C - 8 C) Giorni C. Il plasma in aferesi conservato con EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A o citrato di sodio al 4% può essere conservato fino a 10 giorni a 2-30 C e fino a 46 giorni a 2-8 C. 10

11 D. Le linee guida seguenti per i volumi di plasma si riferiscono al pipettamento da provette di plastica o vetro da 13 x 100 mm eseguito con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. I volumi indicati si riferiscono al plasma sopra ai globuli rossi depositati e devono essere rispettati durante lo svolgimento del test cobas TaqScreen DPX. Tabella 1 Indicazioni dei volumi per lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor Tipo di pool Volume minimo di plasma Pool primario * 3 ml Pool ripetuto 1,5 ml Pool di risoluzione 2 ml *Include la creazione di una piastra a pozzetti profondi (piastra di archiviazione) E. Non congelare il sangue intero. F. Le piastre a pozzetti profondi con il coperchio possono essere conservate a 2-30 C fino a 3 giorni, a -18 C fino a 150 giorni e a 2-8 C fino a 30 giorni. Non sono stati osservati effetti negativi sulle prestazioni del test sottoponendo i campioni di plasma a 3 cicli di congelamento/scongelamento. G. Il plasma con EDTA, CPD, CPD-A, CP2D, ACD-A e citrato di sodio al 4% può essere conservato fino a 12 mesi a -18 C e fino a 15 giorni a 2-8 C. Non sono stati osservati effetti negativi sulle prestazioni del test sottoponendo i campioni di plasma a 3 cicli di congelamento/scongelamento. H. Rimuovere i campioni dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso, in modo da ridurre al minimo la condensa sul codice a barre. I. Eventuali condizioni alternative per la raccolta e la conservazione dei campioni dovranno essere validate dall'utente. Se i campioni devono essere trasportati, utilizzare imballaggi ed etichette conformi alle leggi nazionali e internazionali per il trasporto di campioni e agenti eziologici. 35 PIPETTAMENTO E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI A. Il sistema cobas s 201 utilizza il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD per tutte le attività di pipettamento e creazione dei pool di campioni. Il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD esegue le attività di scansione dei codici a barre e di creazione dei pool di campioni. B. È possibile configurare il sistema cobas s 201 senza uno strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, ma in questo caso è necessario inserire manualmente gli ID dei codici a barre. Per istruzioni dettagliate, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. C. Se il test cobas TaqScreen DPX identifica pool reattivi all'hav o valore di cutoff per B19V, viene utilizzato lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor per pipettare i campioni dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette campione originali, in modo da poter eseguire i test secondari. NOTE SULLA PROCEDURA A. Attrezzatura 1. Preparare il sistema cobas s 201 per l'uso in base alle istruzioni fornite nel Manuale operativo del sistema cobas s Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati per garantire il corretto funzionamento degli strumenti. B. Reagenti 1. Rimuovere i reagenti del kit di controlli cobas TaqScreen DPX e i reagenti del test cobas TaqScreen DPX dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso, in modo da ridurre al minimo la condensa sul codice a barre. Il reagente di lavaggio cobas TaqScreen deve raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso. Per informazioni sulle condizioni di conservazione dei reagenti, vedere la sezione "Requisiti per la manipolazione e la conservazione". 11

12 2. Ogni kit cobas TaqScreen DPX Test contiene materiale sufficiente per un totale di 96 test, preferibilmente suddivisi in sedute in batch fino a 24 test per ogni rack SK24. In ogni batch o rack SK24 è necessario includere un controllo negativo e un controllo positivo. I controlli vengono sottoposti allo stesso trattamento dei campioni con il test cobas TaqScreen DPX. 3. Tutti i controlli sono esclusivamente monouso. 4. Il sistema impedirà l'uso di eventuali reagenti provenienti da lotti diversi, di reagenti rimasti sullo strumento per un numero di ore superiore al consentito, o di reagenti scaduti o di cassette miste appartenenti a un set di quattro cassette già utilizzato nel sistema. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS AmpliPrep. C. Trattamento dei campioni 1. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli. 2. Fare attenzione a non contaminare i campioni e il materiale di controllo negativo con il materiale di controllo positivo. ISTRUZIONI PER L'USO Il sistema cobas s 201 si basa su quattro procedure principali: pipettamento dei campioni e dei controlli con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD; preparazione dei campioni sullo strumento COBAS AmpliPrep con il test cobas TaqScreen DPX; amplificazione/rivelazione sull'analizzatore COBAS TaqMan ; gestione dei dati. Ogni kit cobas TaqScreen DPX Test contiene otto cassette: due cassette DPX CS1 con biglie magnetiche; due cassette DPX CS2 con reagente di lisi; due cassette DPX CS3 con proteasi e tampone di eluizione; infine due cassette DPX CS4 con IC, MMX Reagente 1 e MMX Reagente 2. Questo kit di test deve essere utilizzato insieme al kit di controlli cobas TaqScreen DPX e al reagente di lavaggio cobas TaqScreen. Nota: non aprire le cassette. Nota: non creare pool di reagenti provenienti da lotti diversi o da flaconi diversi dello stesso lotto. Nota: non mescolare cassette appartenenti a lotti diversi sullo strumento COBAS AmpliPrep. Nota: non separare le provette di controllo dai rispettivi adattatori (supporti di plastica per provette di controllo). Nota: il software PDM verifica che un batch venga eseguito su un solo strumento COBAS AmpliPrep e un solo analizzatore COBAS TaqMan collegati alla stessa stazione dati AMPLILINK. Nota: non suddividere i batch tra più strumenti COBAS AmpliPrep o analizzatori COBAS TaqMan. Eseguire tutti gli interventi di manutenzione necessari, come descritto nel Manuale operativo del sistema cobas s 201. Per istruzioni dettagliate sull'uso, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. A. Pipettamento dei controlli e dei campioni con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Nota: evitare di contaminare i guanti durante la preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: miscelare i controlli per inversione almeno 3 volte, evitando la formazione di bolle d'aria (come descritto più avanti). Miscelare per inversione significa capovolgere il controllo a testa in giù e riportarlo a testa in su ogni volta. Durante ogni inversione mantenere il controllo in ognuna delle posizioni per almeno 2 secondi: in altre parole, capovolgere il controllo a testa in giù e mantenerlo in questa posizione per 2 secondi, quindi riportare il controllo a testa in su e mantenerlo in questa posizione per 2 secondi. Nota: i target virali nei controlli, nei campioni di pool e nei campioni sono stabili nel sistema (fino a 30 C) per almeno 18 ore prima della loro estrazione sullo strumento COBAS AmpliPrep. 12

13 1. Eseguire le procedure di avviamento del pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, quindi dare inizio alla procedura guidata Roche PDM Pooling Wizard e seguire le istruzioni visualizzate. 2. Fare attenzione a non danneggiare il codice a barre identificativo sulle provette dei campioni e sugli adattatori delle provette di controllo. Se il codice a barre è danneggiato, il sistema non è in grado di identificare i campioni e i controlli. 3. Rimuovere il tappo dalle provette di controllo e caricare i campioni, i materiali di consumo e i controlli sul pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo il caricamento dei campioni, dei materiali di consumo e dei controlli, sullo strumento ha inizio il trasferimento dei controlli e dei campioni nelle provette S. 4. Al termine del pipettamento è possibile leggere gli allarmi e stampare il report (o i report) di pooling. Ispezionare i pool e i pozzetti delle piastre a pozzetti profondi. Considerare i pool e/o i pozzetti non validi se appaiono contaminati con globuli rossi o se i volumi non sono uniformi. 5. Ritappare le provette S e trasferire il rack (o i rack) SK24 sullo strumento COBAS AmpliPrep per l'estrazione degli acidi nucleici. 6. Coprire e mettere da parte le piastre a pozzetti profondi (se sono state create durante la seduta di pipettamento). 7. Rimuovere e conservare le provette dei donatori. Per informazioni sulle condizioni di conservazione, fare riferimento alla sezione Prelievo, conservazione e creazione dei pool di campioni. 8. Rimuovere e gettare via le provette di controllo (esclusivamente monouso). 9. Gli ordini dei test vengono creati e trasmessi automaticamente a tutte le stazioni dati AMPLILINK collegate alla rete. B. Preparazione e caricamento dei reagenti per il test cobas TaqScreen DPX Nota: fare attenzione a non danneggiare le etichette delle cassette. Il lettore di codici a barre dello strumento COBAS AmpliPrep acquisisce automaticamente il codice a barre di ogni cassetta quando i rack per reagenti vengono caricati sullo strumento. 1. Prima di iniziare è necessario caricare un numero di cassette sufficiente per tutti i campioni che dovranno essere trattati, in modo da garantire il funzionamento ininterrotto dello strumento COBAS AmpliPrep. Ogni cassetta contiene reagenti sufficienti per 48 test. Per informazioni sul caricamento di tutti i reagenti necessari in modo da evitare interruzioni, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s Inserire la cassetta DPX CS1 in un rack per reagenti, verificando che il codice a barre della cassetta sia allineato al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. Le cassette DPX CS1 devono essere caricate tutte insieme su un rack per reagenti diverso da quello delle altre cassette. 3. Caricare il rack per reagenti contenente la cassetta DPX CS1 nella posizione A del rack, farlo scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS AmpliPrep, quindi attendere che la spia LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack fino in fondo, verso la parte posteriore dello strumento. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento. 4. Caricare sul rack (o sui rack) per reagenti un set di cassette DPX CS2, DPX CS3 e DPX CS4 per ogni cassetta DPX CS1, verificando che i codici a barre delle cassette siano allineati al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. 5. Caricare il rack (o i rack) per reagenti nella posizione B, C, D o E, fare scorrere il rack fino al perno di arresto sullo strumento COBAS AmpliPrep, quindi attendere che la spia LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack fino in fondo, verso la parte posteriore dello strumento. 6. La spia LED sulla barra di stato dello strumento COBAS AmpliPrep diventa verde solo dopo che tutti i componenti del kit richiesti sono stati caricati e identificati dal sistema. 13

14 C. Estrazione degli acidi nucleici dai campioni e dai controlli pipettati Nota: eseguire questa procedura su una superficie di lavoro pulita. 1. Rimuovere il rivestimento dall'involucro delle unità SPU, lasciando intatto il nastro e il coperchio di plastica. 2. Dopo aver rivolto verso l'operatore il bordo più largo del rack per SPU, inserire l'involucro con le unità SPU in modo che sia a livello con il lato destro del rack per SPU. 3. Rimuovere il nastro e il coperchio di plastica dalle unità SPU, dopo averle inserite nel rack. Assicurarsi che tutte le unità SPU siano inserite perfettamente nel rack e siano a livello. Eventuali unità SPU sollevate potrebbero bloccare lo strumento. Non esercitare pressioni sull'ago campione nell'unità SPU. 4. Far scorrere i rack per SPU caricati nelle posizioni J, K o L dello strumento COBAS AmpliPrep finché non sono completamente inseriti e identificati. Lo strumento può ospitare al massimo 72 unità SPU alla volta. Caricare il numero di unità SPU necessario per la seduta o di più, secondo necessità. 5. Rimuovere il cellophane dalle confezioni originali dei rack per provette K e per puntali K, facendo attenzione a non capovolgere i rack. Verificare che tutti siano inseriti perfettamente. 6. Far scorrere almeno il numero richiesto di rack per provette K e per puntali K nelle posizioni M, N, O o P dello strumento COBAS AmpliPrep. 7. Caricare i rack SK24 con i campioni pipettati dal pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD e i controlli nelle posizioni F, G o H dello strumento COBAS AmpliPrep. Spingere il rack fino a bloccarlo. Controllare lo stato del sistema nella finestra Sample e assicurarsi che tutti i campioni presenti nei rack siano stati identificati. 8. Nel software AMPLILINK verificare che i reagenti e i materiali di consumo caricati siano sufficienti per completare la preparazione del numero di campioni desiderato. 9. Premere Start nella workstation AMPLILINK per avviare la procedura di preparazione dei campioni sullo strumento COBAS AmpliPrep. 10. Eventuali provette K e puntali K inutilizzati potranno essere monitorati sullo strumento COBAS AmpliPrep e utilizzati all'occorrenza per la seduta successiva, se non vengono rimossi. D. Amplificazione e rivelazione 1. Per le configurazioni senza una Docking Station, trasferire il rack SK24 contenente i campioni trattati e il Master Mix sull'analizzatore COBAS TaqMan, in modo da avviare automaticamente l'amplificazione e la rivelazione. Per ogni campione, il software AMPLILINK tiene traccia dell'ora in cui viene aggiunto il reagente Master Mix e considera non valido il campione se l'amplificazione non è stata avviata entro il tempo previsto nel file di definizione del test corrispondente (120 minuti). Per semplificare il flusso di lavoro, trasferire il rack SK24 sull'analizzatore COBAS TaqMan entro 1 ora dal completamento della preparazione dei campioni presenti sul rack. 2. Al termine dell'amplificazione/rivelazione sull'analizzatore COBAS TaqMan, i campioni analizzati vengono automaticamente smaltiti nel contenitore di scarico. 3. I risultati vengono accettati e trasferiti automaticamente al software PDM. E. Revisione e rilascio dei risultati 1. Avviare la workstation Roche PDM. 2. Recuperare i batch non valutati nella scheda "Review Batches" della workstation Data Manager. 3. Rivedere gli allarmi evidenziando un batch e facendo clic su "Next". 4. Rivedere i risultati dei controlli nella scheda "Controls Review". Per informazioni sui criteri di validità dei controlli, fare riferimento alla sezione Controllo di qualità. 14

15 5. Rivedere i risultati dei pool nella scheda "Alarms Review" relativa al batch selezionato. Se necessario, l'utente può assegnare manualmente lo stato di non valido ai pool che sono risultati non reattivi all'hav e < cutoff per B19V. I campioni dei donatori appartenenti a un pool non valido devono essere sottoposti nuovamente al test. 6. Rivedere e rilasciare i donatori nella scheda "Donor Review" relativa al batch selezionato. 7. Stampare i report e, se pertinente, inviarli al sistema LIS (Laboratory Information System). CONTROLLO DI QUALITÀ 1. In ogni batch è necessario includere un controllo negativo (DPX ( ) C) e uno ciascuno dei due controlli positivi (DPX D(+)C e DPX H(+)C). 2. Stato del batch: lo stato del batch è "Complete, Valid" quando i controlli del batch sono validi. Se uno qualsiasi dei controlli non è valido, l'intero batch non è valido. Il software PDM assegna automaticamente lo stato di non validità ai risultati sulla base degli errori dei controlli. a. Controllo negativo La validità del controllo negativo viene verificata in base al test eseguito. Test DPX (HAV e B19V): per essere considerato valido, il controllo negativo (DPX ( ) C) deve generare un risultato interpretato di non reattività sia all'hav che al virus B19V e i rispettivi IC e QS devono essere validi. Se il risultato interpretato per il controllo negativo non è valido, l'intero batch non è valido e deve essere ripetuto. Solo test B19V: per essere considerato valido, il controllo negativo (DPX ( ) C) deve generare un risultato interpretato di non reattività al virus B19V e il rispettivo QS deve essere valido. Se il risultato interpretato per il controllo negativo non è valido, l'intero batch non è valido e deve essere ripetuto. b. Controllo positivo doppio DPX La validità del controllo positivo doppio DPX viene verificata in base al test eseguito. Test DPX (HAV e B19V): per essere considerato valido, il controllo positivo doppio (DPX D(+)C) deve generare un risultato interpretato di reattività all'hav, una concentrazione del virus B19V compresa tra 1,20 x 10 2 e 1,20 x 10 3 UI/ml e i rispettivi IC e QS devono essere validi. Se il risultato interpretato per l'hav non è valido o la concentrazione del virus B19V non rientra nel range di accettabilità, l'intero batch non è valido e deve essere ripetuto. Solo test B19: per essere considerato valido, il controllo positivo doppio (DPX D(+)C) deve generare un risultato interpretato con una concentrazione del virus B19V compresa tra 1,20 x 10 2 e 1,20 x 10 3 UI/ml e il rispettivo QS deve essere valido. Se il risultato interpretato per la concentrazione del virus B19V non rientra nel range di accettabilità, l'intero batch non è valido e deve essere ripetuto. c. Controllo positivo alto DPX Per la validità del controllo positivo alto DPX (DPX H(+)C), è necessario che la concentrazione del virus B19V sia compresa tra 2,40 x 10 5 e 2,40 x 10 6 UI/ml e che il rispettivo QS sia valido. Se la concentrazione del virus B19V non rientra nel range di accettabilità, l'intero batch non è valido e deve essere ripetuto. 3. IC per campioni di donatori a. Il campione di un donatore può generare un risultato valido di non reattività al test ( ) solo se il rispettivo IC è valido; in caso contrario, il risultato di non reattività non è valido e il campione del donatore deve essere sottoposto nuovamente al test. b. Un risultato valido di reattività all'hav per il campione di un donatore può essere associato a un risultato IC valido o non valido. 4. QS per campioni di donatori a. Il campione di un donatore può generare un risultato valido per il virus B19V solo se il rispettivo QS è valido; in caso contrario, il risultato non è valido e il campione del donatore deve essere sottoposto nuovamente al test. 15

16 RISULTATI 1. I risultati dei campioni sono validi solo se è valido il batch del quale fanno parte. Per informazioni sui criteri di validità, fare riferimento alla sezione Controllo di qualità. Per ogni campione vengono misurati quattro parametri: uno per il target virale HAV, uno per il target virale B19V, uno per il controllo interno (IC) e uno per lo standard di quantificazione (QS). Solo test B19V: per ogni campione vengono misurati solo due parametri, ovvero target virale B19V e QS. 2. I risultati finali del test sono non reattivo, reattivo oppure non valido per il target HAV; < cutoff, cutoff o non valido per il target B19V. 3. Lo stato finale del donatore per il test cobas TaqScreen DPX viene indicato nel software PDM con le seguenti modalità: Tabella 2 Descrizione dello stato finale del donatore Stato finale del donatore Descrizione Completed È stato determinato il risultato finale per ogni target. Accepted Il donatore completato (Completed) è stato accettato. Completed Unresolved Il limite temporale di vitalità è scaduto prima che il donatore venisse accettato. Accepted Unresolved Il donatore completato e irrisolto (Completed Unresolved) è stato accettato. Test ripetuti per campioni individuali Le provette donatori con un risultato finale di non validità per un target comportano la ripetizione del test indipendentemente da quale sia il risultato finale per l'altro target. L'utente ha tuttavia la possibilità di selezionare l'opzione "Force Unresolve" e completare il flusso di lavoro per il donatore. La funzione "Force Unresolve" assegna lo stato "Accepted Unresolved" ai donatori che non hanno generato un risultato finale di reattività all'hav o un valore cutoff per B19V oppure assegna lo stato "Accepted ai donatori che hanno generato un risultato finale di reattività all'hav o un valore cutoff per B19V. Test di pool secondari Le provette donatori in un pool multicampione con un risultato finale di non validità per un target comportano la ripetizione del test se il risultato finale per l'altro target è di non reattività o di non validità per l'hav o se il valore espresso è < cutoff o non è valido per B19V. Quando un pool multicampione viene indicato come reattivo all'hav o cutoff per B19V, il sistema cobas s 201 assegna a tutti i donatori appartenenti a tale pool una richiesta di esecuzione di test di pool secondari. Questi campioni dei donatori vengono pipettati con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette con i campioni originali) in pool suddivisi, contenenti un numero inferiore di donatori o un solo donatore, dopodiché vengono sottoposti ad altri test cobas TaqScreen DPX nell'ambito di un processo di risoluzione che mira ad identificare i singoli campioni che sono reattivi all'hav o che esprimono un valore cutoff per B19V. Per informazioni specifiche sull'esecuzione dei test di risoluzione, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. Quando un pool multicampione suddiviso viene indicato come non reattivo all'hav ed esprime un valore < cutoff per B19V, i campioni individuali vengono classificati come "Completed", con un risultato finale di non reattività all'hav e un valore < cutoff per B19V. Nota: nell'ambito di un programma globale di garanzia della qualità, l'utente può di propria iniziativa sottoporre i campioni a ulteriori test per determinare la causa dell'iniziale reattività del campione. 16

17 LIMITI DELLA PROCEDURA 1. Questo test è stato valutato solo per l'uso contestualmente al kit cobas TaqScreen DPX Test, al kit di controlli cobas TaqScreen DPX, al reagente di lavaggio cobas TaqScreen e al sistema cobas s È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa procedura. 3. L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure seguite per il prelievo e il trasporto dei campioni. 4. Per quanto riguarda la preparazione automatizzata dei pool di plasma, soltanto il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD è stato validato per l'uso con il test cobas TaqScreen DPX. Attenersi alle istruzioni hardware e alle precauzioni per la sicurezza descritte nel Manuale operativo del sistema cobas s 201 e nel manuale per l'utente del pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. 5. L'identificazione dell RNA di HAV e la quantificazione del DNA di B19V dipendono dal numero di particelle virali presenti nei campioni e possono essere influenzate dai metodi di prelievo dei campioni, da fattori legati al paziente (ad esempio, età e presenza di sintomi) e/o dallo stadio dell'infezione e dalle dimensioni del pool. 6. Anche se rare, eventuali mutazioni nelle regioni altamente conservate dei genomi virali coperte dai primer e/o dalle sonde del test cobas TaqScreen DPX possono dare luogo alla mancata identificazione dell'hav o all'errata quantificazione del virus B19V. 7. A causa di differenze intrinseche tra le tecnologie, prima di passare da una tecnologia a un'altra è consigliabile condurre studi sulla correlazione tra i metodi nei propri laboratori, allo scopo di qualificare tali differenze. Si consiglia agli utenti di seguire le strategie/procedure interne specifiche. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI Studio clinico di riproducibilità La riproducibilità del test cobas TaqScreen DPX per l'uso con il sistema cobas s 201 è stata valutata con il DNA di B19V e l'rna di HAV in 3 siti esterni. Oltre al sito, sono stati presi in considerazione i seguenti fattori variabili: lotto di reagenti, giorno, seduta e risultati nella stessa seduta. Per valutare il range del saggio è stato utilizzato un pannello costituito da diverse concentrazioni dei 2 virus target. Nella Tabella 3 sono riportati i fattori che influenzano la precisione per il virus B19V. Nella Tabella 4 sono riportati i risultati per i membri del pannello HAV-positivi, suddivisi per lotto, sito, giorno e seduta. Tabella 3 Fattori che influenzano la precisione della quantificazione del DNA di B19V (log 10 UI/ml) Conc. B19V Conc. B19V DS DS totale attesa media di Log 10 (log 10 UI/ml) (log 10 UI/ml) conc. B19V N. di test* Lotto Sito Giorno Seduta Nella stessa seduta 2,60 2, ,009 0,081 0,065 0,035 0,168 0,201 3,00 3, ,042 0,054 0,043 0,000 0,138 0,160 4,00 3, ,023 0,156 0,030 0,022 0,083 0,182 5,00 4, ,026 0,057 0,034 0,039 0,059 0,101 6,00 5, ,072 0,085 0,000 0,051 0,097 0,156 7,00 6, ,057 0,258 0,042 0,076 0,075 0,288 *Numero di test validi. Sono stati programmati almeno 180 test per ogni membro del pannello. I test non validi non sono stati ripetuti. 17

18 Conc. HAV Tabella 4 Risultati per i membri del pannello HAV-positivi suddivisi per lotto, sito, giorno e seduta Ct DS CV% medio Ct Ct Numero di test positivi/numero totale di risultati validi Lotto Sito Giorno Seduta ID Reattivi/ % ID Reattivi/ % ID Reattivi/ % ID Reattivi/ Validi Validi Validi Validi % 0,5xLOD 37,9 1,35 3,6 1 49/60 81,7 1 40/59 67,8 1 25/35 71,4 1 62/87 71,3 2 40/56 71,4 2 46/60 76,7 2 27/35 77,1 2 67/89 75,3 3 40/60 66,7 3 43/57 75,4 3 23/36 63,9 4 25/34 73,5 5 29/36 80,6 1,0xLOD 37,4 1,26 3,4 1 59/60 98,3 1 56/60 93,3 1 35/36 97,2 1 84/89 94,4 2 56/59 94,9 2 60/60 100,0 2 34/36 94,4 2 89/90 98,9 3 58/60 96,7 3 57/59 96,6 3 34/36 94,4 4 35/35 100,0 5 35/36 97,2 3,0x LOD 35,9 0,87 2,4 1 60/60 100,0 1 60/60 100,0 1 36/36 100,0 1 88/88 100,0 2 58/58 100,0 2 60/60 100,0 2 35/35 100,0 2 90/90 100,0 3 60/60 100,0 3 58/58 100,0 3 36/36 100,0 4 35/35 100,0 5 36/36 100,0 *Cycle threshold, ciclo soglia Lo studio ha generato un falso risultato Reactive su 177 test DPX validi eseguiti sui membri del pannello negativo. Il falso risultato Reactive è causato da un risultato Reactive per B19V inferiore al limite minimo di quantificazione. Nella Tabella 5 è indicata la specificità analitica stimata utilizzando i membri del pannello negativo. Tabella 5 Specificità analitica stimata utilizzando membri del pannello negativo N. di test Risultato reattivo Risultati negativi Specificità (%) IC 95%* (%) ,4 96,9 100,0 Nota: per ottenere un risultato complessivamente negativo, per B19V deve essere generato il risultato Target not Detected e per HAV deve essere generato il risultato Non-Reactive. *intervallo di confidenza esatto al 95% 18

19 Studio clinico dei pool di risoluzione I pool di risoluzione per l'identificazione sia del DNA di B19V che dell'rna di HAV sono stati valutati separatamente per 5 pool su 96 e per 5 pool su 480, utilizzando combinazioni predefinite di campioni positivi e negativi per HAV e B19V. Tutti i campioni positivi e negativi noti sono stati identificati correttamente in entrambi gli studi, dimostrando così una sensibilità del 100% e una specificità del 100%. Nelle Tabelle 6 e 7 sono riportati i dati relativi alla concordanza dei risultati, rispettivamente per il pool di 96 campioni e per il pool di 480 campioni. Tabella 6 Concordanza dei risultati dei pool di risoluzione costituiti da 96 campioni Risultato pool di risoluzione Positivi Negativi Totale Reactive Non-Reactive Totale Tabella 7 Concordanza dei risultati dei pool di risoluzione costituiti da 480 campioni Positivi Negativi Totale Reactive Risultato pool di risoluzione Non-Reactive Totale * *Non è stato possibile risolvere in modo definitivo 3 risultati su 2400 perché il volume era insufficiente. Riproducibilità La riproducibilità del test cobas TaqScreen DPX per il virus HAV è stata determinata eseguendo i test su un pannello di 8 membri, composto da un campione di plasma negativo e 7 campioni di plasma positivi all'hav, con concentrazioni di 0,35, 0,5, 0,71, 1, 1,41, 2,5 e 3,75 UI/ml. I test sono stati eseguiti utilizzando 3 lotti del kit cobas TaqScreen DPX Test nell'arco di due giorni, con 6 set di strumenti e 9 operatori. Tutti i dati validi relativi alla riproducibilità sono stati valutati calcolando la percentuale dei risultati reattivi al test per ogni membro del pannello. I dati sono stati analizzati in base alla data della seduta e al lotto del kit. Questo studio ha evidenziato prestazioni uniformi del test cobas TaqScreen DPX con tutti i lotti di kit (Tabella 8) e in giorni diversi (Tabella 9). Tabella 8 Riproducibilità tra lotti Concentrazione di Risultati reattivi in base al lotto reagenti HAV (UI/ml) Lotto n. 1 Lotto n. 2 Lotto n. 3 3,75 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 2,50 100,0% (63/63) 100,0% (63/63) 100,0% (62/62) 1,41 100,0% (62/62) 100,0% (63/63) 96,8% (61/63) 1,00 93,7% (59/63) 90,5% (57/63) 95,2% (60/63) 0,71 85,7% (54/63) 90,5% (57/63) 81,0% (51/63) 0,50 74,6% (47/63) 74,6% (47/63) 76,2% (48/63) 0,35 63,5% (40/63) 69,8% (44/63) 69,8% (44/63) 0,00 0,0% (0/63) 0,0% (0/63) 0,0% (0/63) 19

20 Tabella 9 Riproducibilità tra giorni Concentrazione di HAV Risultati reattivi in base al giorno (UI/ml) Giorno n. 1 Giorno n. 2 3,75 100,0% (63/63) 100,0% (126/126) 2,50 100,0% (63/63) 100,0% (125/125) 1,41 100,0% (62/62) 98,4% (124/126) 1,00 93,7% (59/63) 92,9% (117/126) 0,71 85,7% (54/63) 85,7% (108/126) 0,50 74,6% (47/63) 75,4% (95/126) 0,35 63,5% (40/63) 69,8% (88/126) 0,00 0,0% (0/63) 0,0% (0/126) Precisione della quantificazione del virus B19V La precisione del test cobas TaqScreen DPX per B19V è stata determinata eseguendo i test su un pannello di 4 membri, composto da campioni di plasma positivi al virus B19V con concentrazioni di 10 3, 10 4, 10 5 e 10 6 UI/ml. Tutti i dati validi sono stati valutati calcolando la deviazione standard dei titoli di virus B19V (log 10 UI/ml) per ogni membro del pannello. I dati di 2 lotti di kit sono stati analizzati sia separatamente che in combinazione. Questo studio ha evidenziato prestazioni uniformi del test cobas TaqScreen DPX con tutti i lotti di kit (Tabella 10). Tabella 10 Deviazione standard dei titoli di virus B19V, log 10 UI/ml (n = 20), con lotti di kit differenti Membri del pannello Lotto reagenti Lotto reagenti B19V (UI/ml) n. 1 n. 2 Lotti n. 1 e n. 2 combinati ,073 0,103 0, ,051 0,083 0, ,071 0,071 0, ,218 0,112 0,176 Complessiva ( ) 0,123 0,094 0,110 Sensibilità analitica Standard internazionali dell'oms I limiti di sensibilità (Limit of Detection, LOD) al 95% del test cobas TaqScreen DPX sia per l'rna di HAV che per il DNA di B19V sono stati determinati utilizzando gli standard internazionali dell'oms per l'hav (codice NIBSC 00/560) 36 e per B19V (codice NIBSC 99/800) 27. Sono state preparate tre serie di diluizioni indipendenti di ogni standard virale, utilizzando plasma umano normale, negativo ai virus. Ogni serie di diluizioni è stata analizzata utilizzando tre lotti differenti del kit cobas TaqScreen DPX Test con 21 repliche per ogni lotto, per un totale di 189 repliche per ogni concentrazione. Nelle Tabelle 11 e 12 vengono illustrate le analisi del tasso di reattività rispettivamente per HAV e B19V. 20