PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.

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1 cobas TaqScreen MPX Test for use on the cobas s 201 system PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. cobas TaqScreen MPX Test MPX 96 Tests P/N: cobas TaqScreen MPX Control Kit MPX CTL 6 Sets P/N: cobas TaqScreen Wash Reagent TS WR 5.1 L P/N: USO PREVISTO cobas TaqScreen MPX Test per utilizzo con il sistema cobas s 201 è un test qualitativo in vitro per l identificazione diretta dell RNA del virus dell immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) del gruppo M, dell RNA del virus dell immunodeficienza umana di tipo 1 del gruppo O, dell RNA del virus dell immunodeficienza umana di tipo 2 (HIV-2), dell RNA del virus dell epatite C (HCV) e del DNA del virus dell epatite B (HBV) nel plasma umano. Il test viene utilizzato per lo screening dei donatori al fine di identificare l RNA dei virus HIV-1 gruppo M, HIV-1 gruppo O, HIV-2, HCV e il DNA del virus HBV nei campioni di plasma appartenenti a singoli donatori di sangue, compresi i donatori di sangue intero e di componenti ematici e altri donatori in vita. Il test viene inoltre utilizzato per lo screening dei singoli donatori di organi e tessuti se i campioni sono prelevati mentre il cuore del donatore batte ancora. È necessario eseguire lo screening del plasma di tutti i donatori come campioni singoli. Nel caso di donazioni di sangue intero e componenti ematici, è possibile analizzare i campioni di plasma uno a uno oppure in pool costituiti da aliquote identiche dei singoli campioni, eseguendo contestualmente i test sierologici per l HIV, l HCV e l HBV. Questo test non può essere utilizzato a sostegno della diagnosi. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST Una delle principali preoccupazioni per quanto riguarda le trasfusioni di sangue e componenti ematici è la possibilità di un eventuale trasmissione di infezioni virali, con particolare riferimento ai virus dell immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) e di tipo 2 (HIV-2), dell epatite C (HCV) e dell epatite B (HBV). In genere questi agenti infettivi si trasmettono in seguito all esposizione a sangue contaminato o a prodotti ematici e plasma contaminati, all esposizione a determinati tessuti o fluidi corporei, per via sessuale o per via parentale (da madre infetta a feto). Il virus HIV-1 è il più diffuso a livello mondiale, con una prevalenza globale dell 1,1% (0,56% in Nord America e 0,25% in Europa Occidentale). Entro 3-6 settimane dall inizio dell infezione, i soggetti infetti da HIV-1 sono interessati da sintomi influenzali che producono un breve malessere, inizialmente acuto, associato a livelli elevati di viremia nel sangue periferico. 1 Esistono due gruppi genetici principali del virus HIV-1: il gruppo M ( Main, ovvero principale) e il gruppo O ( Outlier, ovvero erratico). Il gruppo M è di gran lunga prevalente e si divide in 10 sottotipi rintracciabili a livello globale. 2 A differenza dell infezione da HIV-1, diffusa in tutto il mondo, l infezione da HIV-2 è circoscritta e interessa l area dell Africa Occidentale, in quanto colpisce prevalentemente le popolazioni che migrano da quest area geografica o la o attraversano. 2 Rispetto all HIV-1, l HIV-2 è un virus che si trasmette meno facilmente per via sessuale, probabilmente perché i livelli virali si mantengono più bassi nello stadio primario e nello stadio avanzato dell infezione. Anche lo sviluppo dello stadio avanzato della malattia (un periodo di accresciuta carica virale) è più lento nel caso dell HIV-2 rispetto all HIV-1. Queste caratteristiche possono spiegare in parte perché l HIV-2 si sia diffuso in maniera più circoscritta a livello mondiale rispetto all HIV-1. 3 Il virus HCV è ritenuto il principale agente eziologico responsabile del 90% 95% dei casi di epatite post-trasfusione di tipo non A e non B. 4,5 Sebbene l HCV si sia diffuso a livello globale, l incidenza di questo virus non è nota con precisione in quanto l infezione si presenta in genere in forma asintomatica. La prevalenza osservata varia comunque tra lo 0,5 e il 2,0% in Europa Occidentale, fino a una punta massima del 20% in Egitto. Il virus HBV è uno dei principali agenti eziologici delle epatiti acute e croniche, delle cirrosi epatiche e dei carcinomi epatocellulari. 6,7,8 I portatori cronici del virus sono circa 350 milioni, localizzati in gran parte nelle aree ad alta prevalenza. 9 A livello mondiale, la prevalenza dell HBV è compresa in un intervallo da < 2% in Europa Occidentale e USA a > 8% in Asia e Africa. 10 1

2 I test di screening sierologico hanno ridotto significativamente, ma non eradicato completamente, il rischio di trasmissione di infezioni virali attraverso le emotrasfusioni. I primi test sulle donazioni di sangue intero e plasma finalizzati all identificazione del virus HBV risalgono agli anni 70, quando vennero introdotti i primi test sull HBsAg. Oltre allo screening dell HBV, oggi le donazioni di sangue e plasma sono sottoposte a test di routine finalizzati all identificazione sia dei virus HIV-1 e HIV-2 tramite screening con immunodosaggi enzimatici (EIA), sia degli anticorpi contro il virus HCV. Da una forte richiesta generale di definire quanto prima standard più elevati per lo screening degli agenti infettivi nei prodotti delle emotrasfusioni è scaturita la tecnologia NAT (Nucleic Acid Test, test degli acidi nucleici). Studi specifici dimostrano che i test degli acidi nucleici virali (HIV-1 RNA, HCV RNA 4,12-15 e HBV DNA ) riducono ulteriormente il rischio di trasmissione degli agenti infettivi quando le donazioni di sangue avvengono nel periodo finestra della sieroconversione. La durata media di questo periodo finestra è di 22 giorni, ma può raggiungere anche 6 mesi nel caso dell HIV Con l introduzione dei test NAT in minipool, il periodo finestra dell infezione da HIV-1 si è ridotto in modo significativo, al punto che il rischio di trasmissione del virus HIV-1 è attualmente di 1 caso su 2 milioni di donazioni, secondo le stime Analogamente, l introduzione dei test HCV RNA NAT hanno portato a una riduzione di circa 60 giorni del periodo finestra relativo alla negatività all anticorpo Attualmente si stima che il rischio di infezione è di 1 o 2 casi circa su 1 milione di donazioni. Lo screening HBV DNA NAT non viene eseguito di routine, eppure potrebbe abbassare ulteriormente il rischio di trasmissione dell HBV attraverso le trasfusioni. 14,18,19,21 Per migliorare l efficienza dei test con bersagli multipli, è stata sviluppata una tecnica basata sulla reazione polimerasica a catena (PCR) multiplex (MPX) finalizzata all identificazione simultanea di più virus. Grazie alla tecnica PCR MPX è possibile conseguire l amplificazione e la rivelazione di più sequenze bersaglio utilizzando più coppie di primer e sonde in un unica provetta di reazione. Il test multiplex di tipo qualitativo cobas TaqScreen MPX Test consente lo screening e l'identificazione simultanea dell'rna dei virus HIV-1 (gruppi M e O), dell'rna dei virus HIV-2, dell'rna dei virus HCV e del DNA del virus HBV in donazioni di campioni infetti di plasma singoli e in pool. Per lo svolgimento dell analisi cobas TaqScreen MPX Test è prevista la preparazione degli acidi nucleici sullo strumento COBAS AmpliPrep secondo una tecnica generica. L RNA dei virus HIV-1 (gruppi M e O), l RNA dei virus HIV-2, l RNA dei virus HCV e il DNA del virus HBV vengono sottoposti alle procedure di amplificazione e rivelazione tramite PCR real-time automatizzata sull analizzatore COBAS TaqMan. Nel test è incluso un controllo interno per il monitoraggio della performance di ogni singolo test e dell'enzima AmpErase (uracil- N-glicosilasi), in modo da ridurre la contaminazione potenziale dovuta a materiale amplificato in precedenza (amplicon). Il cobas TaqScreen MPX Test non consente di determinare quale tipo di virus sia presente in un campione. Per identificare i virus HIV-1 (gruppo M), HCV e HBV è possibile utilizzare i seguenti test di discriminazione: COBAS AmpliScreen HIV-1 Test, v1.5, COBAS AmpliScreen HCV Test, v2.0 e COBAS AmpliScreen HBV Test. Non sono disponibili presso Roche test di discriminazione per i virus HIV-1 (gruppo O) e HIV-2. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il cobas TaqScreen MPX Test utilizzato sui sistemi cobas s 201 si basa su 4 processi principali: 1. Creazione automatica dei pool di campioni e pipettamento dei controlli con il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor 2. Preparazione automatica dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep 3. Amplificazione automatica dell acido nucleico e rivelazione automatica real-time dei prodotti della PCR con l analizzatore COBAS TaqMan 4. Gestione automatizzata dei dati con il software PDM (Pooling and Data Management) Creazione automatica dei pool e pipettamento di campioni con il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor Il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor consente di automatizzare il pipettamento di campioni di singoli donatori, la creazione di pool di campioni di più donatori, il trasferimento delle aliquote su piastre a pozzetti profondi e il pipettamento dei controlli del test. Il sistema cobas s 201 risolve i pool reattivi nei risultati dei campioni dei singoli componenti. Il sistema cobas s 201 è progettato per l'elaborazione in batch dei campioni. Un batch è un insieme di campioni e controlli che vengono sottoposti insieme alle procedure di pipettamento, estrazione, amplificazione e rivelazione. Al termine del pipettamento di un batch con il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor, l'intero rack per campioni viene trasferito sullo strumento COBAS AmpliPrep per la fase successiva. 2

3 Preparazione automatica dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep Gli acidi nucleici dei bersagli e le molecole del Controllo Interno (CI) dell Armored RNA aggiunte (come controllo del processo di preparazione e amplificazione/rivelazione dei campioni) vengono analizzati simultaneamente. Il cobas TaqScreen MPX Test contiene reagenti sufficienti per completare cinque fasi in sequenza sullo strumento COBAS AmpliPrep. La soluzione di proteasi digerisce le proteine per indurre la lisi, inattivare le nucleasi e facilitare il rilascio di RNA e DNA dalle particelle virali. L aggiunta del Reagente di lisi nel campione induce la lisi virale e l inattivazione delle nucleasi attraverso la denaturazione delle proteine. L RNA e il DNA vengono rilasciati e allo stesso tempo vengono protetti dalle nucleasi. Gli acidi nucleici rilasciati si legano alla superficie di silice delle particelle magnetiche di vetro aggiunte. Ciò è dovuto principalmente alla presenza di una carica netta positiva sulla superficie delle particelle di vetro e di una carica netta negativa degli acidi nucleici sotto la concentrazione dei sali caotropici e la forza ionica della reazione di lisi. Il reagente di lavaggio rimuove le sostanze non legate e le impurità, come le proteine denaturate, i detriti cellulari e i potenziali inibitori della PCR (ad es. l emoglobina ecc.), riducendo la concentrazione salina. Gli acidi nucleici purificati vengono rilasciati dalla particelle magnetiche di vetro a una temperatura elevata con il Tampone di eluizione. Amplificazione automatica dell acido nucleico con l analizzatore COBAS TaqMan Dopo l isolamento degli acidi nucleici purificati dal plasma umano durante la preparazione automatizzata del campione, la soluzione cobas TaqScreen MPX Master Mix (MMX) viene utilizzata per l amplificazione e la rivelazione dell RNA dei virus HIV-1 (gruppi M e O), HIV-2 e HCV, del DNA del virus HBV e dell RNA del Controllo Interno (CI). Dopo l attivazione mediante aggiunta di acetato di manganese, la soluzione cobas TaqScreen MPX Master Mix permette la trascrizione inversa (per i bersagli RNA) e quindi l amplificazione PCR delle regioni altamente conservate dell RNA dell HIV-1 (gruppi M e O), dell HIV-2 e dell HCV, del DNA dell HBV e dell RNA del Controllo Interno utilizzando primer specifici. Le contestuale rivelazione dell acido nucleico amplificato è ottenuta grazie alla generazione di segnali fluorescenti dalla degradazione 5'-nucleolitica delle sonde specifiche dei virus HIV-1 (gruppi M e O), HIV-2, HCV, HBV e CI, presenti anche nella soluzione Master Mix. Vengono impiegati due coloranti fluorescenti: un colorante marca la sonda specifica CI, mentre il secondo marca tutte le sonde specifiche dei bersagli consentendo l identificazione combinata in multiplex dei bersagli virali e l identificazione autonoma del CI. Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR Le reazioni di trascrizione inversa e di amplificazione vengono svolte con un enzima ricombinante termostabile, denominato DNA Polimerasi Z05. In presenza di manganese (Mn 2+ ), la DNA Polimerasi Z05 induce le attività di trascrittasi inversa e di polimerasi del DNA. Ciò consente la trascrizione inversa e l amplificazione mediante PCR nella stessa miscela di reazione. L amplificazione mediante PCR è ottenuta utilizzando la DNA polimerasi Z05, che estende i primer appaiati lungo gli stampi bersaglio producendo una molecola di DNA bersaglio a doppio filamento (amplicon). Questo processo viene ripetuto per vari cicli e la quantità di DNA amplicon raddoppia ad ogni ciclo. L amplificazione ha luogo solamente nella regione dei genomi bersaglio compresa tra i primer e non riguarda i genomi interi. Amplificazione selettiva Il cobas TaqScreen MPX Test produce l amplificazione selettiva dell acido nucleico bersaglio dei campioni attraverso l azione dell enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) e del trifosfato di deossiuridina (dutp). L enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) riconosce e catalizza la reazione di distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina, 22 ma non del DNA contenente deossitimidina o dell RNA contenente (ribo)uridina. 23,24 La desossiuridina non è presente nel DNA naturale, ma è sempre presente nell'amplicon perché il trifosfato di desossiuridina è utilizzato con il trifosfato di timidina come uno dei dntp nel reagente Master Mix. È per questo motivo che solo l'amplicon contiene deossiuridina. La deossiuridina rende l amplicon contaminante suscettibile alla distruzione da parte dell enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) prima dell amplificazione del DNA bersaglio. Inoltre, qualsiasi prodotto non specifico che si sia formato dopo l attivazione iniziale del Master Mix tramite manganese viene distrutto dall enzima AmpErase (uracil- N-glicosilasi). L enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) contenuto nel reagente Master Mix catalizza la segmentazione del DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosio nella posizione C1. Quando viene riscaldata nella prima fase del ciclo termico, la catena di DNA dell amplicon si spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) rimane inattivo per un periodo di tempo prolungato dopo essere stato esposto a temperature superiori a 55ºC e di conseguenza non distrugge l amplicon bersaglio che si è formato dopo la reazione PCR. 3

4 Rivelazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l analizzatore COBAS TaqMan Nel corso dell amplificazione PCR, l elevata temperatura intermittente durante il ciclo induce la denaturazione dell amplicon bersaglio e dell amplicon CI, formando un DNA a filamento singolo. Le sonde oligonucleotidiche specifiche per la rivelazione ibridizzano alla forma a filamento singolo del DNA amplificato. L amplificazione, l ibridizzazione e la rivelazione si verificano simultaneamente. Rivelazione dei prodotti della PCR 25,26 La soluzione cobas TaqScreen MPX MMX contiene sonde di rivelazione specifiche per gli acidi nucleici dei virus HIV-1 (gruppo M e O), HIV-2, HCV, HBV e del Controllo Interno (CI). Ogni sonda di rivelazione è marcata con 1) uno dei due coloranti fluorescenti che agiscono da reporter e 2) un altro colorante che funge da quencher. Alle sonde virus-specifiche è associato un particolare colorante reporter, che viene misurato a una determinata lunghezza d onda. Alla sonda CI-specifica è associato un secondo colorante reporter, che viene misurato a una lunghezza d onda diversa. Per tutte le sonde viene utilizzato un unico tipo di colorante quencher. Questo sistema rende possibile la rivelazione di tutti i virus bersaglio amplificati a una lunghezza d onda e contestualmente la rivelazione dell acido nucleico del CI a un altra lunghezza d onda. Prima dell inizio dell amplificazione mediante PCR, le sonde sono intatte e la fluorescenza del colorante reporter è annullata dal colorante quencher in virtù del trasferimento di energia del tipo Förster. Durante l amplificazione mediante PCR, le sonde ibridizzano a specifiche sequenze di DNA a filamento singolo e sono segmentate dall attività della 5'-3' nucleasi della DNA polimerasi Z05 nello stesso momento in cui ha luogo l amplificazione. Una volta che i coloranti reporter e quencher si separano per effetto di questa segmentazione, l attività di fluorescenza del colorante reporter si rivela. Ad ogni ciclo di PCR si assiste a un progressivo aumento delle sonde segmentate che vengono generate e al contestuale aumento del segnale cumulativo del colorante reporter. Le rivelazione real-time dei prodotti della PCR è ottenuta misurando la fluorescenza dei coloranti reporter rilasciati che rappresentano i virus bersaglio e il CI separatamente. Gestione dei dati automatizzata mediante PDM Il programma Roche PDM Data Manager consente all'utente di rivedere e stampare i risultati. Il programma Roche PDM Data Manager classifica i risultati di tutti i test come non reattivi, reattivi o non validi. Oltre che per recuperare ed esaminare i risultati della PCR, il software Roche PDM Data Manager può essere utilizzato dall operatore per stampare referti, eseguire ricerche dei risultati, accettare i risultati dei donatori e, facoltativamente, trasmettere i risultati a un sistema LIS. MATERIALI FORNITI DA ROCHE Per la rivelazione dell RNA dei virus HIV-1 (gruppi M e O), HIV-2 e HCV e del DNA del virus HBV nei campioni di plasma vengono forniti i tre kit seguenti: 1) cobas TaqScreen MPX Test, 2) cobas TaqScreen MPX Control Kit e 3) cobas TaqScreen Wash Reagent. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l ufficio Roche locale. cobas TaqScreen MPX Test MPX 96 test (P/N: ) MPX CS1 (Cassetta reagenti con particelle di vetro magnetiche MPX) MPX CS2 (Cassetta reagente di lisi MPX) MPX CS3 (Cassetta multireagente MPX) MPX CS4 (Cassetta reagente specifico per test MPX) cobas TaqScreen MPX Control Kit Kit dei controlli cobas TaqScreen MPX (P/N: ) HIV-1 M (+) C (Controllo positivo HIV-1 M) HIV-1 O (+) C (Controllo positivo HIV-1 O) MPX CTL 6 set 4

5 HIV-2 (+) C (Controllo positivo HIV-2) HCV (+) C (Controllo positivo HCV) HBV (+) C (Controllo positivo HBV) TS ( ) C [Controllo negativo cobas TaqScreen (plasma umano)] cobas TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (Reagente di lavaggio cobas TaqScreen) TS WR 5,1 litri ALTRI MATERIALI NECESSARI MA VENDUTI SEPARATAMENTE (ACQUISTABILI PRESSO ROCHE) Questo test deve essere eseguito sul sistema cobas s 201. Il sistema cobas s 201 deve essere installato e utilizzato in una configurazione completa. I singoli componenti del sistema cobas s 201 non possono essere utilizzati come dispositivi indipendenti dal sistema, né possono essere sostituiti con altri componenti. Il sistema cobas s 201 utilizza i componenti elencati di seguito. Strumentazione e software del sistema cobas s 201 Dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor, stazione di lavoro e software per la gestione dei pool Strumento COBAS AmpliPrep Analizzatore COBAS TaqMan Stazione dati e software AMPLILINK Roche PDM Data Manager Server, stazione di lavoro e software per la gestione dei dati Rack e materiale di consumo Rack per campioni COBAS AmpliPrep (SK24) (P/N: ) Rack per SPU COBAS AmpliPrep (P/N: ) Rack per reagenti COBAS AmpliPrep (P/N: ) Unità di trattamento campioni (SPU) (P/N: ) Provette per campioni iniziali (provette S) con fermagli a codice a barre (P/N: ) Rack per puntali K (P/N: ) Confezione di provette K 12x96 (P/N: ) Carrier K per COBAS TaqMan (P/N: ) Puntali CO-RE a volume elevato (1000 μl), filtro (P/N: ) Piastre a pozzetti profondi con etichette per codice a barre (P/N: ) Copertura per piastre a pozzetti profondi (P/N: ) Rack portacampioni per 24 provette (P/N: ) Rack portacampioni per 32 provette (P/N: ) Rack portapuntali (P/N: ) Rack per piastre a pozzetti profondi (P/N: ) Supporto per rack SK24 (P/N: ) Spray disinfettante Microcide SQ o HAMILTON (P/N: ) Guanti monouso, senza talco 5

6 REAGENTI cobas TaqScreen MPX Test MPX 96 test (P/N: ) MPX CS1 MGP (Particelle di vetro magnetiche) Particelle di vetro magnetiche 93% Isopropanolo Xi 93% (p/p) Isopropanolo + 2 x 48 test 2 x 7,0 ml F Irritante 93% (p/p) Isopropanolo Facilmente infiammabile MPX CS2 LYS (Reagente di lisi) Diidrato di citrato di sodio 42,5% Tiocianato di guanidina < 14% Polidocanolo 0,9% Ditiotreitolo Xn 42,5% (p/p) Tiocianato di guanidina + 2 x 48 test 2 x 78 ml Nocivo MPX CS3 Pase (Soluzione di proteinasi) Tampone TRIS < 0,05% EDTA Cloruro di calcio Acetato di calcio 7,8% Proteinasi + Glicerolo Xn 7,8% (p/p) Proteinasi 2 x 48 test 2 x 3,8 ml Nocivo EB (Tampone di eluizione) Tampone di base TRIS 0,2% Conservante Metilparaben MPX CS4 MPX MMX-R1 (Reagente Master Mix MPX 1) Tampone TRIS Acetato di potassio Acetato di manganese Glicerolo Betaina 0,08% Sodio azide 2 x 7,0 ml 2 x 48 test 2 x 3,0 ml 6

7 MPX MMX-R2 (Reagente Master Mix MPX 2) Tampone tricina Cloruro di potassio Idrossido di potassio < 21% Dimetil sulfoxide Glicerolo EDTA Tween 20 Igepal CA630 < 0,09% datp, dgtp, dctp, dutp, dttp < 0,01% primer a monte e a valle per HIV-1 gruppo M, HIV-1 gruppo O, HIV-2, HCV, HBV < 0,01% sonde a marcatura fluorescente specifiche per HIV-1, HIV-2, HCV, HBV < 0,01% sonda a marcatura fluorescente specifica per Controllo Interno (CI) < 0,01% aptamero oligonucleotidico < 0,07% DNA polimerasi Z05 (batterica) < 0,4% enzima AmpErase [uracil-n-glicosilasi] (batterico) 0,08% Sodio azide MPX IC (Controllo Interno MPX) Tampone TRIS 0,002% Poly ra RNA (sintetico) EDTA 0,05% Sodio azide < 0,001% RNA di Controllo Interno sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 2 x 2,5 ml 2 x 15 ml cobas TaqScreen MPX Control Kit Kit dei controlli cobas TaqScreen MPX (P/N: ) MPX CTL 6 set HIV-1 M (+) C (Controllo Positivo HIV-1 M) < 0,001% RNA sintetico, non infettivo del virus HIV-1 (gruppo M), incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 Plasma umano negativo, definito non reattivo in base a test brevettati per la determinazione dell anticorpo anti-hcv, dell anticorpo anti- HIV-1/2 e dell HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA e HBV DNA non rilevabili mediante PCR 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone + 6 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. HIV-1 O (+) C (Controllo Positivo HIV-1 O) < 0,001% RNA sintetico, non infettivo del virus HIV-1 (gruppo O), incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 Plasma umano negativo, definito non reattivo in base a test brevettati per la determinazione dell anticorpo anti-hcv, dell anticorpo anti- HIV-1/2 e dell HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA e HBV DNA non rilevabili mediante PCR 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone + 6 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. 7

8 HIV-2 (+) C (Controllo Positivo HIV-2) < 0,001% RNA sintetico, non infettivo del virus HIV-2, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 Plasma umano negativo, definito non reattivo in base a test brevettati per la determinazione dell anticorpo anti-hcv, dell anticorpo anti- HIV-1/2 e dell HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA e HBV DNA non rilevabili mediante PCR 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone + 6 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. HCV (+) C (Controllo Positivo HCV) < 0,001% RNA sintetico, non infettivo del virus HCV, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 Plasma umano negativo, definito non reattivo in base a test brevettati per la determinazione dell anticorpo anti-hcv, dell anticorpo anti- HIV-1/2 e dell HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA e HBV DNA non rilevabili mediante PCR 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone + 6 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. HBV (+) C (Controllo Positivo HBV) < 0,001% DNA sintetico, non infettivo del virus HBV, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga Lambda Plasma umano negativo, definito non reattivo in base a test brevettati per la determinazione dell anticorpo anti-hcv, dell anticorpo anti- HIV-1/2 e dell HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA e HBV DNA non rilevabili mediante PCR 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone + 6 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. TS ( ) C (Controllo Negativo cobas TaqScreen) Plasma umano negativo, definito non reattivo in base a test brevettati per la determinazione dell anticorpo anti-hcv, dell anticorpo anti- HIV-1/2 e dell HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA e HBV DNA non rilevabili mediante PCR 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone + 6 x 1,6 ml Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. 8

9 cobas TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (Reagente di lavaggio cobas TaqScreen) Diidrato di citrato di sodio 0,1% conservante Metilparaben TS WR 5,1 litri REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE A. La temperatura tra 15 e 30 C è definita temperatura ambiente. B. Non congelare i reagenti e i controlli. C. Conservare i reagenti MPX CS1, MPX CS2, MPX CS3 e MPX CS4 tra 2 e 8 C. Se inutilizzati, questi reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata. D. Una volta aperti, i reagenti sono stabili per 30 giorni tra 2 e 8 C o fino alla data di scadenza indicata, se precedente. E. I reagenti possono essere utilizzati per un massimo di 6 sedute dello strumento, per un massimo di 40 ore cumulative sullo strumento COBAS AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati tra 2 e 8 C quando non sono utilizzati. F. I reagenti sono stabili per un totale di 24 ore continuative sullo strumento COBAS AmpliPrep. G. Conservare i controlli HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C, HBV (+) C e TS ( ) C tra 2 e 8 C. I controlli sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l apertura è necessario gettare via le parti inutilizzate. H. Conservare il Reagente di lavaggio TS WR tra 15 e 30 C. Dopo l apertura, il Reagente di lavaggio TS WR è stabile fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperto, questo reagente è stabile per 30 giorni tra 15 e 30 C o fino alla data di scadenza, se precedente. PRECAUZIONI PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. A. I campioni potrebbero essere infetti. Rispettare le precauzioni di carattere generale durante lo svolgimento del test. 27,28 Questa procedura dovrebbe essere eseguita esclusivamente da personale con esperienza nell uso del cobas TaqScreen MPX Test e nella manipolazione dei materiali infettivi. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro del laboratorio con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio (candeggina) allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. Successivamente pulire la superficie con etanolo 70%. B. ATTENZIONE: i controlli HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C, HBV (+) C e TS ( ) C contengono plasma umano derivato da sangue umano. Il materiale d origine è stato testato e riscontrato non reattivo alla presenza dell anticorpo anti-hiv-1/2, dell anticorpo anti-hcv e dell HBsAg. Il materiale d origine è stato testato utilizzando il cobas TaqScreen MPX Test. L analisi di plasma umano negativo mediante PCR ha dimostrato l assenza di RNA dell HIV-1 (gruppi M e O), di RNA dell HIV-2, di RNA dell HCV e di DNA dell HBV. Nessun metodo di analisi noto può garantire con certezza assoluta che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Tutti i materiali derivati da sangue umano devono essere considerati potenzialmente infettivi e devono essere manipolati nel rispetto delle Precauzioni generali. In caso di fuoriuscite, disinfettare immediatamente l area con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% (candeggina diluita) o seguire le procedure di laboratorio pertinenti. C. Rispettare le precauzioni di routine del laboratorio. Non pipettare per bocca. Non mangiare, bere né fumare nelle aree di lavoro designate. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo avere manipolato i campioni e i reagenti del kit, lavarsi accuratamente le mani. D. I reagenti MPX MMX-R1, MPX MMX-R2 e MPX IC contengono sodio azide come conservante. Non utilizzare tubi di metallo per il trasferimento dei reagenti. Se le soluzioni contenenti sodio azide devono essere smaltite attraverso l impianto di scarico, è necessario diluire e sciacquare con abbondante acqua corrente, onde evitare che nelle tubature metalliche si accumulino depositi in grado di dare luogo a reazioni esplosive. E. È dimostrato che l eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa procedura. 9

10 F. Si consiglia di utilizzare pipette sterili e puntali per pipette privi di nucleasi di tipo monouso. È possibile che vengano generati risultati falsi positivi se durante la manipolazione e l analisi dei campioni non si previene la contaminazione crociata. G. Per garantire una performance analitica ottimale, utilizzare soltanto i materiali di consumo forniti o consigliati. H. Manipolare tutti i materiali contenenti campioni o controlli nel rispetto della buona prassi di laboratorio, onde evitare la contaminazione crociata di campioni o controlli. I. Prima dell uso, ispezionare visivamente ogni cassetta di reagente, provetta di controllo e reagente di lavaggio per verificare che non vi siano segni di perdite. Se si notano segni di perdite, non utilizzare il materiale per il test. J. Smaltire tutti i reagenti che sono entrati in contatto con i campioni e i reagenti nel rispetto delle normative locali, regionali e nazionali in materia. K. Non utilizzare i prodotti cobas TaqScreen MPX Test, cobas TaqScreen MPX Control Kit e cobas TaqScreen Wash Reagent dopo la data di scadenza. Non scambiare, miscelare o combinare reagenti appartenenti a kit o a lotti diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS AmpliPrep. L. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l ufficio Roche locale. M. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita dei reagenti, diluire il liquido con acqua prima di asciugare. Evitare che la soluzione LYS, contenente tiocianato di guanidina, entri in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). L eventuale miscela di queste soluzioni può produrre gas fortemente tossici. N. Per assicurare il corretto svolgimento del test, attenersi scrupolosamente alle procedure e alle linee guida fornite. Qualunque scostamento dalle procedure e dalle linee guida potrebbe compromettere la performance del test. O. Evitare di utilizzare campioni eccessivamente emolizzati. P. La contaminazione dei campioni di plasma con globuli rossi (> 2,5%) potrebbe inibire il cobas TaqScreen MPX Test. Q. Non utilizzare componenti con etichette del codice a barre danneggiate in nessuna fase del test. PREPARAZIONE DEI REAGENTI A. Lasciare equilibrare il cobas TaqScreen MPX Control Kit a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell uso. Lasciare equilibrare i reagenti del cobas TaqScreen MPX Test sullo strumento COBAS AmpliPrep per 30 minuti prima dell uso. PRELIEVO, TRASPORTO, CONSERVAZIONE E POOLING DEI CAMPIONI Note: Manipolare tutti i campioni come se fossero agenti infettivi. A. Con il cobas TaqScreen MPX Test è possibile utilizzare campioni di plasma raccolti in EDTA, CPD, CPDA1, CP2D, ACDA e citrato di sodio al 4%. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore delle provette campione. B. Il sangue raccolto in EDTA può essere conservato a 2 30 C per un massimo di 72 ore a partire dall ora del prelievo, più altri due giorni a 2 8 C. Per conservare il sangue oltre i cinque giorni, rimuovere il plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a x g per 20 minuti. Dopo la rimozione, il plasma può essere conservato a 2 8 C per altri sette giorni. In alternativa, il plasma 10

11 può essere conservato a -18 C per periodi più lunghi. Il plasma in EDTA può essere congelato e scongelato un massimo di tre (3) volte C Anticoagulante EDTA Temperatura ( C) Sangue intero 2 8 C Plasma Giorni dopo il prelievo C. Il sangue raccolto in CPD, CPDA1 o CP2D può essere conservato per un massimo di 72 ore a 2-30 C prima della separazione del plasma (plasmaferesi). Dopo la centrifugazione dei campioni in CPD, CPDA1 o CP2D a x g per 20 minuti, il plasma può essere conservato a 2 8 C per altri sette giorni. In alternativa, il plasma separato dai globuli rossi può essere conservato a -18 C per periodi più lunghi. Il plasma in CPD, CPDA1 e CP2D può essere congelato e scongelato un massimo di tre (3) volte C Anticoagulante CPD, CPDA1 o CPD2D Temperatura ( C) C 10 Sangue intero Plasma Giorni dopo il prelievo D. Il plasma separato dai globuli rossi e raccolto negli anticoagulanti ACDA o citrato di sodio al 4% può essere conservato per un massimo di 72 ore a partire dall ora del prelievo a 2 30 C o per periodi più lunghi a -18 C. E. Le seguenti linee guida sui volumi di plasma si basano sul pipettamento da provette in plastica o vetro (13 x 100 mm) effettuato con il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor. I volumi indicati si riferiscono al plasma al di sopra dei globuli rossi stratificati e devono essere utilizzati durante l esecuzione del cobas TaqScreen MPX Test. Tipo di pool Volume minimo di plasma Pool primario * 3 ml Pool ripetuto 1,5 ml Pool di risoluzione 2 ml *Include la creazione di una piastra a pozzetti profondi (piastra di archiviazione) F. Non congelare il sangue intero. G. È dimostrato che l eparina inibisce la PCR. Si sconsiglia di utilizzare campioni eparinizzati. H. Le piastre a pozzetti profondi possono essere conservate coperte a 2-8 C per un massimo di sette giorni a partire dalla data in cui il plasma è stato separato dai globuli rossi. In alternativa, le piastre possono essere conservate a -18 C per periodi più lunghi. 11

12 I. Non sono stati osservati effetti negativi sulla performance del test quando i campioni di plasma sono stati sottoposti a tre cicli di congelamento/scongelamento. J. Lasciare equilibrare a temperatura ambiente i singoli campioni dei donatori o i pool prima dell uso. K. Condizioni di prelievo e di conservazione diverse dovranno essere approvate dall utente. Per l eventuale trasporto, impacchettare ed etichettare i campioni nel rispetto delle normative nazionali e internazionali sul trasporto di campioni e agenti eziologici. 29 L. È possibile che vengano generati risultati falsi positivi se durante la manipolazione e l analisi dei campioni non si previene la contaminazione crociata. POOLING E PIPETTAMENTO DEI CAMPIONI 1. Il sistema cobas s 201 utilizza il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor per tutte le attività di pipettamento e pooling. Per formare i pool, il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor esegue la scansione dei codici a barre e le operazioni di pooling a partire da volumi di campione in aliquote uguali. 2. Se vengono identificati pool reattivi dal cobas TaqScreen MPX Test, viene utilizzato il dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor per pipettare i singoli campioni dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette originali per i test di risoluzione. NOTE SULLA PROCEDURA A. Attrezzatura 1. Preparare il sistema cobas s 201 per l uso attenendosi alle istruzioni riportate nel Manuale Operativo del sistema cobas s Eseguire gli interventi di manutenzione consigliati sugli strumenti per garantirne il corretto funzionamento. B. Reagenti 1. Lasciare equilibrare i reagenti del cobas TaqScreen MPX Test per 30 minuti sullo strumento COBAS AmpliPrep prima dell uso. Il cobas TaqScreen MPX Control Kit e il cobas TaqScreen Wash Reagent devono essere a temperatura ambiente prima dell uso. Per informazioni sulle condizioni di conservazione dei reagenti, vedere la sezione Requisiti per la manipolazione e la conservazione. 2. Ogni kit cobas TaqScreen MPX Test contiene materiale sufficiente per un totale di 96 test. 3. Tutti i controlli sono monouso. 4. Il sistema impedisce di utilizzare reagenti appartenenti a lotti diversi, reagenti che hanno superato il numero di ore consentite sullo strumento, reagenti con cassette scadute o mischiate da un set di quattro cassette utilizzate in precedenza sul sistema. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS AmpliPrep. C. Trattamento dei campioni 1. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli. 2. Prestare attenzione per evitare la contaminazione dei campioni e del controllo TS ( ) con i Controlli Positivi. D. Test di discriminazione 1. Prima di sottoporre un campione a un test di discriminazione, verificare che tale campione sia stato identificato in un pool valido e che abbia prodotto singoli risultati validi con il cobas TaqScreen MPX Test. È possibile analizzare il campione reattivo individualmente utilizzando i test di discriminazione COBAS AmpliScreen HBV Test, COBAS AmpliScreen HCV Test, v2.0 e COBAS AmpliScreen HIV-1 Test, v1.5. Potrebbero essere necessari ulteriori test per differenziare il virus HIV-1 gruppo O e il virus HIV-2. Roche non fornisce test di discriminazione per i virus HIV-1 gruppo O e HIV Per informazioni sulle procedure da seguire con questi test di discriminazione, fare riferimento ai fogli illustrativi dei prodotti COBAS AmpliScreen HBV Test, COBAS AmpliScreen HCV Test, v2.0 e COBAS AmpliScreen HIV-1 Test, v

13 ISTRUZIONI PER L USO Il sistema cobas s 201 si basa su quattro processi principali: Pipettamento di campioni e controlli sul dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor, preparazione dei campioni sullo strumento COBAS AmpliPrep usando il cobas TaqScreen MPX Test, amplificazione/rivelazione sull analizzatore COBAS TaqMan e gestione dei dati. Ogni kit cobas TaqScreen MPX Test contiene otto cassette: due cassette MPX CS1 con particelle di vetro magnetiche, due cassette MPX CS2 con il Reagente di lisi, due cassette MPX CS3 con il Tampone di proteasi e il Tampone di eluizione, due cassette MPX CS4 con Controllo Interno (CI), MMX Reagent 1 e MMX Reagent 2. Questo kit deve essere utilizzato unitamente al cobas TaqScreen MPX Control Kit e al cobas TaqScreen MPX Wash Reagent. Non aprire le cassette. Non utilizzare pool di reagenti provenienti da lotti diversi o da flaconi diversi dello stesso lotto. Non mescolare reagenti (incluse le cassette) provenienti da kit diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS AmpliPrep. Non separare le provette di controllo dai rispettivi adattatori. Eseguire tutti gli interventi di manutenzione richiesti secondo quanto descritto nel Manuale Operativo del sistema cobas s 201. Per istruzioni dettagliate, fare riferimento al Manuale Operativo del sistema cobas s 201. A. Pipettamento di controlli e campioni sul dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor Nota: Evitare di contaminare i guanti durante la preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: Non miscelare in vortex i controlli. 1. Eseguire le procedure iniziali sul dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor, quindi avviare la procedura guidata Roche PDM Pooling Wizard e seguire le istruzioni visualizzate. 2. Prestare attenzione per non danneggiare il codice a barre identificativo sui campioni e sui controlli. 3. Rimuovere il tappo dalle provette dei controlli e caricare campioni, materiali di consumo e controlli sul dispositivo HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor. Dopo il caricamento di campioni, materiali di consumo e controlli, lo strumento trasferisce i controlli e i campioni nelle provette iniziali. 4. Al termine della seduta di pipettamento, rivedere gli allarmi e stampare i referti dei pool. Ispezionare i pool e i pozzetti della piastra a pozzetti profondi. Invalidare i pool e/o i pozzetti se si è verificata una contaminazione con globuli rossi o se i volumi non sono uniformi. 5. Tappare le provette S e trasferire i rack SK24 sullo strumento COBAS AmpliPrep per l estrazione degli acidi nucleici. 6. Tappare e riporre le piastre a pozzetti profondi (se sono state create durante la sessione di pipettamento). Tutti i virus bersaglio rimangono stabili nelle piastre a pozzetti profondi per 7 giorni a 2-8 C o per periodi più lunghi a -18 C. 7. Rimuovere e conservare le provette dei donatori. Per informazioni sulle condizioni di conservazione, fare riferimento alla sezione Prelievo, trasporto e conservazione dei campioni. 8. Rimuovere e gettare le provette di controllo (le provette di controllo sono monouso). B. Preparazione e caricamento dei reagenti per il cobas TaqScreen MPX Test Nota: Prestare attenzione per non danneggiare le etichette delle cassette. Il lettore di codici a barre dello strumento COBAS AmpliPrep legge automaticamente il codice a barre di ogni cassetta durante il caricamento dei rack per reagenti. 1. Lasciare equilibrare i reagenti per 30 minuti sullo strumento COBAS AmpliPrep prima di inviare a trattare il primo campione. Non è necessario eseguire altre preparazioni di reagenti. 2. Prima di iniziare, è necessario caricare tutte le cassette in numero sufficiente per tutti i campioni che verranno preparati durante il funzionamento ininterrotto dello strumento COBAS AmpliPrep. Ogni cassetta contiene reagenti sufficienti per 48 test. Per informazioni sul caricamento dei reagenti in modo da assicurare un funzionamento ininterrotto dello strumento, fare riferimento al Manuale Operativo del sistema cobas s

14 3. Collocare la cassetta MPX CS1 su un rack per reagenti, in modo da garantire che il codice a barre della cassetta sia in linea con il codice a barre del rack visibile sul lato destro del rack. Le cassette MPX CS1 devono essere caricate insieme su un rack per reagenti diverso da quello delle altre cassette. 4. Caricare il rack per reagenti contenente la cassetta MPX CS1 nella posizione A del rack, farlo scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS AmpliPrep, quindi attendere che il LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella sua posizione finale. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento. 5. Per ogni cassetta MPX CS1 collocare un set di cassette MPX CS2, MPX CS3 e MPX CS4 su uno o più rack per reagenti, verificando che i codici a barre delle cassette siano in linea con il codice a barre del rack visibile sul lato destro del rack. 6. Caricare il rack o i rack per reagenti nella posizione B, C, D o E del rack, farlo scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS AmpliPrep, quindi attendere che il LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella sua posizione finale. 7. Il LED sulla barra di stato dello strumento COBAS AmpliPrep diventerà verde solo dopo che tutti i componenti del kit richiesti saranno stati caricati e riconosciuti dal sistema. C. Estrazione degli acidi nucleici da campioni e controlli pipettati Nota: Effettuare la seguente procedura su una superficie di lavoro pulita. 1. Rimuovere il cellophane dall involucro delle unità SPU, lasciando intatto il nastro blu. 2. Mantenendo il bordo più largo del rack SPU rivolto verso l operatore, inserire le unità SPU nella posizione più a destra del rack SPU con il simbolo ROCHE rivolto verso la parte anteriore del rack. 3. Rimuovere il nastro blu e premere fino in fondo tutte le SPU, verificando che siano perfettamente allineate e inserite all interno del rack. Se vi sono SPU sollevate, potrebbero verificarsi problemi di funzionamento dello strumento. Non esercitare pressione sul puntale S nella SPU. 4. Fare scorrere i rack per SPU caricati nelle posizioni I, J o K dello strumento COBAS AmpliPrep finché il rack non sarà completamente inserito e identificato. Lo strumento può ospitare un massimo di 72 SPU alla volta. Caricare il numero di SPU necessarie per la sessione o inserirne di più, se necessario. 5. Rimuovere il cellophane dalle confezioni originali dei rack per provette K e per puntali K, facendo attenzione a non rovesciare i rack. Controllare che siano tutti alloggiati correttamente. 6. Fare scorrere i rack per provette K e per puntali K negli alloggiamenti opportuni, come indicato nel Manuale Operativo del sistema cobas s Creare gli ordini utilizzando il software AMPLILINK sulla stazione di lavoro. 8. Caricare i rack SK24 contenenti i campioni pipettati con lo strumento HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor e i controlli nelle posizioni F, G o H dello strumento COBAS AmpliPrep, quindi fare scorrere i rack finché non si bloccano. Controllare lo stato del sistema nella finestra Sample per verificare che tutti i campioni sui singoli rack siano stati identificati. 9. Controllare nel software AMPLILINK che siano stati caricati reagenti e materiali di consumo sufficienti per la preparazione dei campioni desiderati. 10. Premere Start sulla stazione di lavoro AMPLILINK per avviare la procedura di preparazione dei campioni sullo strumento COBAS AmpliPrep. 11. Tutti i puntali K e le provette K inutilizzati resteranno bloccati all interno dello strumento COBAS AmpliPrep e saranno pronti per essere utilizzati durante la sessione successiva. 14

15 D. Amplificazione e rivelazione 1. Entro un ora dal termine della preparazione dei campioni, trasferire i rack SK24 sull analizzatore COBAS TaqMan. L analizzatore COBAS TaqMan avvierà automaticamente le procedure di amplificazione e rivelazione. I risultati relativi ai rack che non vengono trasferiti sullo strumento entro un ora non possono essere considerati validi. 2. Al termine delle operazioni di amplificazione e rivelazione sull analizzatore COBAS TaqMan, i campioni analizzati vengono inviati automaticamente al contenitore di scarico. 3. Accettare i risultati sulla stazione di lavoro AMPLILINK. 4. I risultati vengono trasferiti automaticamente al software PDM. E. Revisione e approvazione dei risultati 1. Avviare la stazione di lavoro Roche PDM. 2. Cercare l opzione Unevaluated Batches (Batch non valutati) nella scheda Review Batches della stazione di lavoro di gestione dei dati. 3. Rivedere gli allarmi evidenziando un batch e facendo clic su Next. 4. Rivedere i risultati dei controlli nella scheda Controls Review. Per una descrizione dei criteri di validità dei controlli, fare riferimento alla sezione Controllo di qualità. 5. Rivedere la voce Pool Result (Risultato pool) nella scheda Alarms Review relativa al batch selezionato. I pool non reattivi possono essere invalidati manualmente dall utente, se necessario. I campioni dei donatori in un pool non valido devono essere rianalizzati. 6. Rivedere e approvare i donatori nella scheda Donor Review relativa al batch selezionato. 7. Stampare i referti e, se necessario, inviarli al sistema LIS (Laboratory Information System). CONTROLLO DI QUALITÀ 1. Con ogni batch è necessario includere un replicato del Controllo Negativo [TS ( ) C] e un replicato di ciascuno dei cinque Controlli Positivi [HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C e HBV (+) C]. 2. Stato del batch: lo stato del batch diventa Complete, Valid quando i controlli del batch sono validi. Se i controlli di un batch non sono validi, l'intero batch non è valido. a. Controllo negativo Affinché il Controllo Negativo [TS ( ) C] possa essere considerato valido, l interpretazione del risultato deve essere non reattivo e il Controllo Interno associato deve essere valido. Se il Controllo Interno non è valido, l interpretazione del risultato del Controllo Negativo è non valido. Se l interpretazione del risultato del Controllo Negativo è non valido, l intero batch sarà considerato non valido e dovrà essere ripetuto. b. Controlli positivi Affinché i 5 Controlli Positivi HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C e HBV (+) C siano considerati validi, è necessario che per ciascun controllo positivo risulti reattivo e che il Controllo Interno associato sia valido. Se il Controllo Interno non è valido, l'interpretazione del risultato del Controllo Positivo è "non valido". Se l'interpretazione del risultato del Controllo Positivo è "non valido", l'intero batch sarà considerato non valido e dovrà essere ripetuto. 3. Controllo Interno per i campioni dei donatori a. Affinché al campione di un donatore sia associato un risultato non reattivo valido ( ), il Controllo Interno associato deve essere valido; in caso contrario, il risultato non reattivo non sarà valido e l intera procedura del test dovrà essere ripetuta. b. Affinché al campione di un donatore sia associato un risultato reattivo valido (valore Ct), il Controllo Interno associato può essere valido oppure non valido. 15