COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2

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1 COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 48 Tests P/N: High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: USO PREVISTO Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 per utilizzo con il sistema High Pure System (HPS), è un test di amplificazione dell'acido nucleico in vitro per la quantificazione dei genotipi da 1 a 6 dell'rna del virus dell'epatite C (HCV) nel siero o plasma umano, mediante il kit High Pure System Viral Nucleic Acid per la preparazione manuale dei campioni e l'analizzatore COBAS TaqMan 48 per l'amplificazione e la rilevazione automatiche. Questo test è destinato all'uso, assieme alla documentazione clinica e ad altri marker di laboratorio, come ausilio per la valutazione della risposta virale al trattamento antivirale misurata in base alle variazioni dei livelli dell'rna dell'hcv nel siero o nel plasma. Recenti dati inducono a ritenere che le variazioni precoci nei livelli dell'rna dell'hcv nel siero o nel plasma possano essere indici predittivi di una risposta a lungo termine alla terapia con interferone 1. Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 non è concepito per essere usato come test di screening per la presenza dell'hcv in sangue o in emoderivati o come test diagnostico di conferma della presenza di infezione da HCV. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST Il virus dell'epatite C (HCV) è considerato il principale agente eziologico nel 90 95% dei casi di epatite post-trasfusionale di tipo non A e non B 2-4. L'HCV è un virus con RNA a singolo filamento positivo, con un genoma di circa nucleotidi codificanti 3000 aminoacidi. Essendo un virus ematogeno, l'hcv può essere trasmesso dal sangue e dagli emoderivati. L'adozione diffusa di misure di screening anti-hcv del sangue ha considerevolmente abbassato il rischio di epatite associata a trasfusioni. L'incidenza dell'infezione da HCV aumenta se è associata ad abuso di stupefacenti per via endovenosa e, in misura minore, ad altre esposizioni percutanee 4. La prevalenza globale dell'infezione da HCV, determinata con test immunosierologici, varia dall'1,0% in Europa al 5,3% in Africa 5. La presenza di anticorpi anti-hcv in pazienti infettati da HCV ha consentito lo sviluppo di dosaggi immunosierologici specifici per tali anticorpi. La presenza di anticorpi anti-hcv rappresenta tuttavia una misura di esposizione pregressa a infezione da HCV, ma non è da considerarsi un marker di infezione in atto. Inoltre non è neppure disponibile la rilevazione diretta mediante metodiche di coltura del virus. La misurazione dei livelli di alanina aminotransferasi (ALT) è considerata un indicatore surrogato di infezione da HCV, ma non è una misura diretta di viremia. Il grado di aumento di ALT non può essere direttamente correlato al livello di infezione da HCV. L'aumento di ALT può infatti essere dovuto a svariate cause di flogosi epatica quali, a titolo puramente esemplificativo, l'epatite virale. Per contro, la rilevazione e quantificazione dell'rna di HCV mediante amplificazione dell'acido nucleico con la reazione a catena della polimerasi (PCR) offre la misura della viremia attiva 6-8. Utilizzando la tecnica PCR è possibile rilevare sia la viremia HCV prima della sieroconversione immunologica 9-10, sia le variazioni nella carica virale nei pazienti classificati come HCV-positivi con infezione cronica e sottoposti a terapia con interferone 1. La sezione Revisione del documento si trova in fondo a questo documento IT 1 Doc Rev. 5.0

2 PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 prevede tre fasi principali: (1) preparazione manuale dei campioni per l'estrazione dell'rna di HCV; (2) trascrizione inversa automatica dell'rna target per generare il DNA complementare (cdna); (3) amplificazione mediante PCR del cdna target utilizzando primer complementari specifici per HCV e simultanea rilevazione di sonde oligonucleotidiche scisse, marcate con doppi traccianti fluorescenti, che permettono la quantificazione del prodotto amplificato dell'hcv target (amplicon). Il reagente Master Mix contiene coppie di primer e sonde specifiche sia per l'rna di HCV, sia per l'rna dello standard di quantificazione dell'hcv. L'identificazione del DNA amplificato avviene per mezzo di sonde oligonucleotidiche a doppia marcatura (una specifica per il target e una specifica per lo standard di quantificazione), in modo da garantire l'identificazione indipendente dell'amplicon di HCV e dell'amplicon dello standard di quantificazione dell'hcv. La quantificazione dell'rna virale di HCV avviene con l'ausilio dello standard di quantificazione dell'hcv. Lo standard di quantificazione dell'hcv è un costrutto Armored RNA non infettivo contenente le sequenze di HCV con siti di legame dei primer identici a quelli dell'rna dell'hcv target, oltre a una regione esclusiva di legame della sonda che consente di distinguere l'amplicon dello standard di quantificazione dell'hcv dall'amplicon dell'hcv target. Lo standard di quantificazione dell'hcv è incorporato in ogni singolo campione e controllo con un numero di copie noto e viene sottoposto a tutte le fasi di preparazione del campione, trascrizione inversa, amplificazione mediante PCR e rilevazione insieme all'hcv target. L'analizzatore COBAS TaqMan 48 calcola il titolo dell'rna di HCV nei campioni di analisi comparando il segnale HCV al segnale dello standard di quantificazione dell'hcv per ogni campione e controllo. Lo standard di quantificazione dell'hcv compensa gli effetti di inibizione e controlla i processi di preparazione e amplificazione per consentire la quantificazione accurata dell'rna di HCV in ogni campione. Selezione del target La selezione della sequenza di RNA target per l'hcv dipende dall'identificazione, nell'ambito del genoma dell'hcv, di quelle regioni in cui la conservazione della sequenza è massima tra i vari genotipi dell'hcv 11,12. Tra i vari genotipi noti dell'hcv, la regione con la massima conservazione delle sequenze di RNA è la regione 5' non tradotta del genoma dell'hcv 13. Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 utilizza primer per la trascrizione inversa e l'amplificazione mediante PCR che definiscono una sequenza appartenente alla regione 5' non tradotta, ovvero alla regione meglio conservata del genoma dell'hcv. Preparazione dei campioni Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 analizza i campioni di plasma e siero trattati con EDTA e isola l'rna di HCV attraverso una preparazione manuale generica dei campioni basata sul legame dell'acido nucleico con fibre di vetro. Le particelle del virus HCV vengono lisate tramite incubazione a temperatura elevata con un tampone di lisi/legame caotropico e proteasi, che rilascia acidi nucleici e protegge l'rna di HCV liberato dalle RNasi nel plasma e nel siero. Insieme al reagente di lisi, viene introdotta in ogni campione una quantità nota di molecole di RNA dello standard di quantificazione dell'hcv. La miscela di lisi viene quindi addizionata di isopropanolo e successivamente centrifugata in una colonna con un inserto in fibra di vetro. Durante la centrifugazione, l'rna di HCV e l'rna dello standard di quantificazione dell'hcv si legano alla superficie del filtro in fibra di vetro. Le sostanze non legate, ad esempio sali, proteine e altre impurità cellulari, vengono rimosse mediante centrifugazione. Gli acidi nucleici adsorbiti vengono lavati ed eluiti con una soluzione acquosa. Gli articoli monouso consentono il trattamento parallelo di 12 campioni o relativi multipli. Il campione trattato, contenente RNA di HCV e RNA dello standard di quantificazione dell'hcv, viene aggiunto alla miscela di amplificazione/ rilevazione. L'RNA dell'hcv target e l'rna dello standard di quantificazione dell'hcv vengono quindi amplificati e rilevati sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 per mezzo dei reagenti di amplificazione e rilevazione forniti con il kit di analisi IT 2 Doc Rev. 5.0

3 Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR Trascrizione inversa Le reazioni di trascrizione inversa, amplificazione mediante PCR e rilevazione sono rese possibili dall'enzima ricombinante termostabile DNA polimerasi Thermus specie Z05 (Z05). In presenza di manganese (Mn 2+ ) e in condizioni adeguate di tampone, lo Z05 presenta attività sia di trascrittasi inversa che di polimerasi del DNA 14,15. Per questo motivo la trascrizione inversa, l'amplificazione mediante PCR e la rilevazione possono avere luogo nella stessa miscela di reazione. I campioni trattati vengono aggiunti alla miscela di amplificazione nelle provette di amplificazione (provette K), dove hanno luogo sia la trascrizione inversa che l'amplificazione mediante PCR. La miscela di reazione viene riscaldata per consentire a un primer a valle di appaiarsi specificamente all'rna dell'hcv target e all'rna dello standard di quantificazione dell'hcv. In presenza di Mn 2+ e di un eccesso di deossinucleotidi trifosfati (dntp), ad esempio trifosfati di deossiadenosina, deossiguanosina, deossicitidina e deossiuridina, la polimerasi Z05 estende il primer appaiato formando un filamento di DNA complementare (cdna) all'rna target. Amplificazione del target Dopo la trascrizione inversa dell'rna dell'hcv target e dell'rna dello standard di quantificazione dell'hcv, la miscela di reazione viene riscaldata per denaturare l'ibrido RNA:cDNA ed esporre le sequenze target dei primer. A mano a mano che la miscela si raffredda, i primer a monte si appaiano specificamente al filamento cdna, la polimerasi Z05 estende il primer e un secondo filamento di DNA viene sintetizzato. Si completa così il primo ciclo di PCR, che produce una copia di DNA a doppio filamento della regione target dell'rna di HCV e dell'rna dello standard di quantificazione dell'hcv. La miscela di reazione viene riscaldata un'altra volta per consentire la separazione del DNA a doppio filamento ottenuto e l'esposizione delle sequenze target dei primer. A mano a mano che la miscela si raffredda, i primer si appaiano al DNA target. In presenza di Mn 2+ e di un eccesso di dntp, la polimerasi Z05 estende i primer appaiati lungo i template target, producendo una molecola di DNA a doppio filamento denominata "amplicon". L'analizzatore COBAS TaqMan 48 ripete automaticamente questo procedimento per un numero di cicli predefinito, raddoppiando ad ogni ciclo la quantità di DNA amplicon. Il numero di cicli necessari è preimpostato nell'analizzatore COBAS TaqMan 48. L'amplificazione interessa esclusivamente la regione del genoma HCV compresa tra i primer, non l'intero genoma HCV. Amplificazione selettiva Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 consente di ottenere l'amplificazione selettiva dell'acido nucleico target nei campioni grazie all'azione dell'enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) e del trifosfato di deossiuridina (dutp). L'enzima AmpErase riconosce e catalizza la distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina 16, ma non del DNA contenente deossitimidina. La deossiuridina non è presente nel DNA naturale, ma è sempre presente nell'amplicon in quanto il trifosfato di deossiuridina è uno dei dntp contenuti nel reagente Master Mix, di conseguenza soltanto l'amplicon contiene deossiuridina. La deossiuridina rende l'amplicon contaminante sensibile alla distruzione da parte dell'enzima AmpErase prima dell'amplificazione dell'rna target. L'enzima AmpErase distrugge anche i prodotti non specifici formati dopo l'attivazione iniziale del Master Mix da parte del manganese, migliorando così la sensibilità e la specificità. L'enzima AmpErase contenuto nel reagente Master Mix catalizza la segmentazione del DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosio nella posizione C1. Quando viene riscaldata nella prima fase del ciclo termico, la catena del DNA dell'amplicon si spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'enzima AmpErase è inattivo a temperature superiori ai 55 C (quindi durante tutte le fasi del ciclo termico), di conseguenza non distrugge l'amplicon target che si è formato durante l'amplificazione IT 3 Doc Rev. 5.0

4 Identificazione dei prodotti della PCR in un test COBAS TaqMan Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 è basato sulla tecnologia PCR in tempo reale 17,18. Utilizzando sonde fluorescenti a doppia marcatura, è possibile identificare in tempo reale l'accumulo del prodotto della PCR grazie al monitoraggio dell'intensità delle emissioni dei fluorocromi reporter fluorescenti rilasciati durante l'amplificazione. Le sonde sono costituite da oligonucleotidi specifici per l'hcv e per lo standard di quantificazione dell'hcv, marcati con un fluorocromo reporter e un fluorocromo quencher. Nel test COBAS TaqMan HCV, v2.0, le sonde dell'hcv e dello standard di quantificazione dell'hcv sono marcate con due fluorocromi reporter fluorescenti diversi. Quando le sonde fluorescenti a doppia marcatura sono intatte, la fluorescenza del fluorocromo reporter viene soppressa a causa della prossimità del fluorocromo quencher (effetti del trasferimento di energia tipo Förster). Durante la PCR la sonda ibridizza su una sequenza target e viene segmentata dall'attività 5' 3' nucleasica della DNA polimerasi Z05 termostabile. Una volta che i fluorocromi reporter e quencher vengono liberati e si separano, l'effetto di soppressione (quenching) cessa e la fluorescenza del fluorocromo reporter si intensifica. L'amplificazione dell'rna di HCV e dell'rna dello standard di quantificazione dell'hcv viene misurata in modo indipendente, a lunghezze d'onda diverse. Questo procedimento viene ripetuto per un numero di cicli predefinito, in ciascuno dei quali l'intensità di emissione dei singoli fluorocromi reporter aumenta consentendo l'identificazione indipendente dell'rna di HCV e dell'rna dello standard di quantificazione dell'hcv. L'intensità dei segnali è quindi correlata alla quantità di materiale iniziale allorché prende il via la PCR. Principi fondamentali della quantificazione mediante il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 assicura risultati quantitativi accurati su un intervallo dinamico molto ampio, in quanto il monitoraggio dell'amplicon avviene durante la fase esponenziale dell'amplificazione. Più il titolo dell'hcv di un campione è elevato, prima la fluorescenza del fluorocromo reporter della sonda dell'hcv supererà il livello di fluorescenza di riferimento (Figura 1). Dal momento che la quantità di RNA dello standard di quantificazione (Quantitation Standard, QS) dell'hcv è costante tra tutti i campioni, la fluorescenza del fluorocromo reporter della sonda HCV QS deve comparire allo stesso ciclo per tutti i campioni (Figura 2). Nei casi in cui l'amplificazione QS e la rilevazione sono alterate da inibizione o scarso recupero dei campioni, la fluorescenza tarda a comparire, consentendo così un adeguamento proporzionale del titolo calcolato dell'rna di HCV target. La comparsa del segnale fluorescente specifico è considerata il valore di soglia critica (Critical Threshold, Ct). Il valore Ct è definito come il numero del ciclo frazionario in cui la fluorescenza del fluorocromo reporter supera una soglia predefinita (livello di fluorescenza assegnato) e inizia una fase di crescita esponenziale di questo segnale (Figura 3). Un valore Ct più elevato indica un titolo inferiore di RNA di HCV target iniziale. Un aumento del titolo pari a 2 volte è correlato a una diminuzione di 1 Ct per l'rna di HCV target, mentre un aumento del titolo pari a 10 volte è correlato a una diminuzione di 3,3 Ct. La Figura 1 mostra le curve di crescita target per una serie di diluizioni del virus su un intervallo 5-log 10. A mano a mano che la concentrazione del virus aumenta, le curve di crescita si spostano verso i cicli precedenti. Di conseguenza, la curva di crescita all'estrema sinistra corrisponde al livello di titolo virale più elevato, mentre la curva di crescita all'estrema destra corrisponde al livello di titolo virale più basso IT 4 Doc Rev. 5.0

5 Figura 1 45,00 Fluorescenza normalizzata 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Titolo più alto Titolo più basso Numero ciclo La Figura 2 mostra le curve di crescita dello standard di quantificazione per i campioni da una serie di diluizione virale su un invervallo 5-log 10. La quantità di standard di quantificazione aggiunta ad ogni campione è costante per ogni reazione. Il valore Ct dello standard di quantificazione è simile, indipendentemente dal titolo virale. Figura 2 12,00 Fluorescenza normalizzata 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 Valore Ct del QS dell'hcv simile, indipendentemente dal titolo virale Titolo più basso Titolo più alto 0, Numero ciclo La Figura 3 fornisce un esempio del modo in cui i valori di fluorescenza ad ogni ciclo vengono normalizzati per ogni curva di crescita. Il numero del ciclo frazionario (Ct) viene calcolato laddove il segnale di fluorescenza interseca il livello di fluorescenza assegnato. Figura 3 2,80 Fluorescenza normalizzata 2,60 2,40 2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 Livello di fluorescenza assegnato Valore Ct = 17, Numero ciclo IT 5 Doc Rev. 5.0

6 QUANTIFICAZIONE DELL'RNA DELL'HCV Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 quantifica l'rna virale dell'hcv utilizzando una seconda sequenza target (standard di quantificazione HCV), che viene aggiunta a ciascun campione di analisi secondo una concentrazione nota. Lo standard di quantificazione dell'hcv è un costrutto Armored RNA non infettivo, contenente frammenti di sequenze di HCV con regioni di legame dei primer identiche a quelle della sequenza target dell'hcv. Lo standard di quantificazione dell'hcv genera anche un prodotto di amplificazione della stessa composizione di base e lunghezza dell'rna dell'hcv target. La regione di legame della sonda di rilevazione dello standard di quantificazione dell'hcv è stata modificata per differenziare l'amplicon dello standard di quantificazione dell'hcv dall'amplicon dell'hcv target. Durante la fase di appaiamento della PCR sull'analizzatore COBAS TaqMan 48, i campioni vengono illuminati ed eccitati dalla luce filtrata e vengono raccolti i dati della fluorescenza di emissione filtrata. Le letture eseguite per ogni campione vengono quindi corrette per tenere conto delle fluttuazioni strumentali. Queste letture della fluorescenza vengono inviate dallo strumento al software AMPLILINK e memorizzate in un database. Per determinare se i dati relativi all'rna dell'hcv e all'rna dello standard di quantificazione dell'hcv rappresentano set validi, vengono applicati controlli preliminari. Se i dati sono al di fuori dei limiti predefiniti, vengono generati gli appositi avvisi (flag). Una volta completati e superati tutti i controlli preliminari, le letture di fluorescenza vengono elaborate per generare i valori Ct per l'rna dell'hcv e per l'rna dello standard di quantificazione dell'hcv. Per calcolare il valore del titolo per i campioni e i controlli in base ai valori Ct dell'rna dell'hcv e dell'rna dello standard di quantificazione dell'hcv, vengono utilizzate le costanti di calibrazione specifiche per il lotto fornite con il test COBAS TaqMan HCV, v2.0. Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 è conforme al Secondo Standard Internazionale dell'oms per i dosaggi HCV RNA NAT (Codice NIBSC 96/798) 19 e i risultati dei titoli sono espressi in Unità Internazionali (UI/ml). REAGENTI High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 test Kit High Pure System Viral Nucleic Acid (P/N: ) LYS 2 x 25 ml (Tampone di lisi/legame) Tris 52% Guanidina-HCl < 1% Urea 20% Triton X-100 Xn 52% (p/p) Guanidina-HCl + Nocivo CAR (RNA, liofilizzato) PK (Proteinasi K, liofilizzata) 99% Proteinasi K, liofilizzata Xn 99% Proteinasi K, liofilizzata + Nocivo 2 x 2 mg 2 x 100 mg IRB (Tampone di rimozione inibitore) Tris 65% Guanidina-HCl Xn 65% (p/p) Guanidina-HCl + Nocivo 1 x 33 ml IT 6 Doc Rev. 5.0

7 WASH (Tampone di lavaggio) Tris NaCl (aggiungere 50 ml di etanolo e 30 ml di acqua deionizzata) ELB (Tampone di eluizione) RS (Set di rack per High Pure System Viral Nucleic Acid) Rack di lisi Rack portaprovette di filtraggio con rack di scarto fissato Rack di eluizione Rack di copertura Manici WR (Rack di scarto per High Pure System Viral Nucleic Acid) COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: ) Reagenti per la preparazione dei campioni e reagenti di controllo HCV QS (Standard di quantificazione dell'hcv COBAS TaqMan ) Tampone di fosfato di sodio EDTA < 0,005% Poly ra RNA (sintetico) < 0,001% Costrutto di Armored RNA, contenente un inserto con sequenze di legame dei primer HCV e una regione esclusiva di legame della sonda (RNA non infettivo in batteriofago MS2) Colorante amaranto 0,1% conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone Irritante R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. + HCV H(+)C, v2.0 [Controllo HCV Alto (+), v2.0] < 0,001% Costrutto di Armored RNA, contenente sequenze HCV (RNA non infettivo in batteriofago MS2) Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la determinazione degli anticorpi anti-hcv, anti-hiv-1/2, dell'antigene HIV p24 e HBsAg; RNA dell'hiv-1, RNA dell'hcv e DNA dell'hbv non rilevabili mediante metodiche PCR 0,1% conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone Irritante R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. + 1 x 20 ml 1 x 30 ml 4 x ciascuno 8 x ciascuno 48 test 2 x 1,0 ml 2 x 1,0 ml IT 7 Doc Rev. 5.0

8 HCV L(+)C, v2.0 [Controllo HCV Basso (+), v2.0] < 0,001% costrutto di Armored RNA, contenente sequenze HCV (RNA non infettivo in batteriofago MS2) Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la determinazione degli anticorpi anti-hcv, anti-hiv-1/2, dell'antigene HIV p24 e HBsAg; RNA dell'hiv-1, RNA dell'hcv e DNA dell'hbv non rilevabili mediante metodiche PCR 0,1% conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone Irritante R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. + CTM ( ) C [Controllo negativo COBAS TaqMan (plasma umano)] Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la determinazione degli anticorpi anti-hcv, anti-hiv-1/2, dell'antigene HIV p24 e HBsAg; RNA dell'hiv-1, RNA dell'hcv e DNA dell'hbv non rilevabili mediante metodiche PCR 0,1% conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone Irritante R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. + 2 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml Reagenti per amplificazione e rilevazione HCV MMX 2 x 24 test (Master Mix HCV COBAS TaqMan ) 2 x 1,4 ml Tampone tricina Idrossido di potassio Acetato di potassio < 20% Dimetil sulfoxide Glicerolo < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% Primer a monte e a valle della regione 5' non tradotta dell'hcv < 0,001% Sonde oligonucleotidiche con marcatura fluorescente specifiche per HCV e per lo standard di quantificazione dell'hcv < 0,05% DNA polimerasi Z05 (batterica) < 0,1% enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) (batterico) 0,09% sodio azide CTM Mn 2+ 2 x 24 test (Soluzione di manganese COBAS TaqMan ) 2 x 1,0 ml < 1,2% Manganese acetato Acido acetico glaciale 0,09% sodio azide IT 8 Doc Rev. 5.0

9 AVVERTENZE E PRECAUZIONI A. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. B. Questo test non è concepito per essere usato come test di screening per la presenza di HCV nel sangue o negli emoderivati o come test diagnostico di conferma della presenza di infezione da HCV. C. I valori assegnati ai coefficienti di calibrazione sono specifici per il lotto e sono specifici per il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 per utilizzo con il sistema High Pure System. Questi valori potrebbero non essere validi se utilizzati con altri metodi di preparazione dei campioni. D. Questo test è concepito per essere utilizzato con plasma umano raccolto nell'anticoagulante EDTA e con siero umano. E. Non pipettare per bocca. F. Non mangiare, bere né fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo avere manipolato i campioni e i reagenti del kit, lavarsi accuratamente le mani. G. Durante il prelievo delle aliquote dai flaconi, evitare la contaminazione microbica o da ribonucleasi dei reagenti. H. Si consiglia di utilizzare pipette sterili e puntali per pipette privi di RNAsi di tipo monouso. I. Non utilizzare pool di reagenti provenienti da lotti diversi o da flaconi diversi dello stesso lotto. J. Non mescolare reagenti provenienti da kit diversi. K. Smaltire i reagenti inutilizzati, i rifiuti e i campioni clinici in conformità alle normative vigenti. L. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza. M. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale. N. Maneggiare i campioni come se fossero infettivi, adottando le procedure di sicurezza in laboratorio descritte nella pubblicazione Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 e nel documento CLSI M29-A3 21. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio (candeggina) allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. Nota: la candeggina liquida disponibile in commercio contiene in genere una concentrazione di ipoclorito di sodio del 5,25%. Diluendo la candeggina con rapporto 1:10 è possibile ottenere una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%. O. ATTENZIONE: i reagenti CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 e HCV H(+)C, v2.0 contengono plasma umano derivato da sangue umano. Il materiale d'origine è stato testato ed è risultato non reattivo alla presenza dell'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg), degli anticorpi anti-hiv-1/2 ed anti-hcv e dell'antigene p24 dell'hiv. L'esame di plasma umano negativo mediante metodi PCR ha dimostrato la presenza di RNA dell'hiv-1, di RNA dell'hcv e di DNA dell'hbv non rilevabili. Nessun metodo di analisi noto può garantire con certezza assoluta che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Tutti i materiali di origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. Maneggiare ireagenti CTM ( ) C; HCV L(+)C, v2.0 e HCV H(+)C, v2.0 come se fossero materiali infettivi, adottando le procedure di sicurezza in laboratorio descritte nella pubblicazione Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 e nel documento CLSI M29-A3 21. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio (candeggina) allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. P. I reagenti HCV MMX e CTM Mn 2+ contengono sodio azide. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo e rame formando azidi metalliche fortemente esplosive. Quando vengono smaltite soluzioni contenenti sodio azide nei lavelli del laboratorio, è necessario sciacquare gli scarichi con abbondanti quantità d'acqua per impedire l'accumulo di azidi. Q. Per manipolare i reagenti indossare camici da laboratorio, guanti monouso e una protezione adeguata per gli occhi. Evitare che i materiali entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua. Se non si interviene, vi è il rischio di ustioni. In caso di fuoriuscita accidentale dei reagenti, diluire con acqua prima di asciugare IT 9 Doc Rev. 5.0

10 REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE Reagenti per la preparazione dei campioni A. Alla ricezione, conservare i reagenti High Pure System Viral Nucleic Acid a C. B. Conservare il tampone di eluizione (ELB) e il tampone di lisi/legame (LYS) a C. Una volta aperti, conservare ELB e LYS a C. Utilizzare i tamponi ELB e LYS aperti entro 28 giorni o sino alla data di scadenza, se precedente. C. Dopo aver aggiunto il tampone di eluizione (ELB) per ricostituire l'rna vettore e la proteinasi K, conservare l'rna vettore (CAR) ricostituito non utilizzato e la proteinasi K (PK) ricostituita non utilizzata a temperature comprese tra 15 e 25ºC. Una volta ricostituiti, usare l'rna vettore e la proteinasi K entro 28 giorni o sino alla data di scadenza, se precedente. D. Dopo avere aggiunto etanolo al tampone di rimozione inibitore (IRB), conservare quest'ultimo e il tampone di lavaggio (WASH) a 15 25ºC. Queste soluzioni di lavoro sono stabili per 28 giorni o fino alla data di scadenza, se precedente. E. Utilizzare la soluzione di lavoro di lisi/legame [tampone di lisi/legame con RNA vettore, proteinasi K e HCV QS] subito dopo la preparazione. Gettare via eventuali eccessi. Reagenti per amplificazione e rilevazione A. Non congelare i reagenti e i controlli. B. Conservare i reagenti HCV MMX, CTM ( ) C; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0, HCV QS e CTM Mn 2+ a 2 8ºC. Se non vengono aperti, i reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura per prelevare un'aliquota sufficiente per un batch di 12 campioni, conservare la parte restante dei reagenti HCV MMX, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0, HCV QS e CTM Mn 2+ a 2 8ºC. Una volta aperti, i reagenti HCV MMX, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0, HCV QS e CTM Mn 2+ sono stabili per 28 giorni a 2 8 C o sino alla data di scadenza, se precedente. Dopo l'apertura, la parte non utilizzata del reagente CTM ( ) C deve essere gettata via. C. Conservare la soluzione Master Mix di lavoro (preparata aggiungendo CTM Mn 2+ a HCV MMX) a 2 8ºC al buio. I controlli e i campioni preparati devono essere aggiunti entro 1 ora dalla preparazione del Master Mix di lavoro. D. I controlli e i campioni trattati sono stabili per un massimo di 3 ore a C, per non più di 24 ore a 2 8 C o per 1 settimana se congelati a 20 C. E. L'amplificazione deve iniziare entro 2 ore dall'aggiunta dei campioni e dei controlli trattati alla soluzione di lavoro Master Mix. MATERIALI FORNITI Reagenti per la preparazione dei campioni A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Kit High Pure System Viral Nucleic Acid (P/N: ) LYS (Tampone di lisi/legame) CAR (RNA vettore) PK (Proteinasi K) IRB (Tampone di rimozione inibitore) WASH (Tampone di lavaggio) ELB (Tampone di eluizione) RS (Set di rack per High Pure System Viral Nucleic Acid) WR (Rack di scarico per High Pure System Viral Nucleic Acid) IT 10 Doc Rev. 5.0

11 Reagenti per amplificazione e rilevazione B. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: ) HCV QS (Standard di quantificazione dell'hcv COBAS TaqMan ) HCV H(+)C, v2.0 [Controllo HCV Alto (+), v2.0] HCV L(+)C, v2.0 [Controllo HCV Basso (+), v2.0] CTM ( ) C [Controllo negativo COBAS TaqMan (plasma umano)] HCV MMX (Master Mix HCV COBAS TaqMan ) CTM Mn 2+ (Soluzione di manganese COBAS TaqMan ) MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Strumentazione e software Analizzatore COBAS TaqMan 48 Software AMPLILINK Stazione dati per software AMPLILINK Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS TaqMan 48 per l'uso con il Manuale dell'applicazione del software AMPLILINK, versione serie 3.2 e 3.3 Manuale dell'applicazione del software AMPLILINK, versione serie 3.2 per l'uso con lo strumento COBAS AmpliPrep, l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48 e l'analizzatore COBAS AMPLICOR oppure Manuale dell'applicazione del software AMPLILINK, versione serie 3.3 per l'uso con lo strumento COBAS AmpliPrep, l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48, l'analizzatore COBAS AMPLICOR e lo strumento cobas p 630 Capper per provette K Materiali monouso Confezione di provette K da 12 x 96 Requisiti centrifuga Centrifuga Sigma 4-15C Benchtop o centrifuga con piastra per microtitolazione equivalente, in grado di erogare una forza centrifuga pari a 4600 x g Centrifuga Sigma con rotore mobile P/N: (comprende 2 cestelli P/N: e 2 porta-piastra P/N: 17978) o dispositivo equivalente. ALTRI MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Isopropanolo (> 99%) conforme a specifiche ACS o di livello superiore Etanolo (96 100%) conforme a specifiche ACS o di livello superiore Acqua deionizzata Pipettatori regolabili*: (capacità di 250 µl e 1000 µl) con barriera antiaerosol o puntali privi di RNAsi a spostamento positivo Pipet-Aid: Drummond (P/N: ) o equivalente Bagnomaria regolato a 50ºC (± 2 C) Termoblocco a secco a 70ºC (± 2 C) Pipette sierologiche sterili monouso: 5, 10 e 25 ml Provette coniche sterili in polipropilene da 15 ml e 50 ml: Corning (P/N: e P/N: ) o equivalenti Provette sterili da 2,0 ml per microcentrifuga: Sarstedt (P/N: ) o equivalenti IT 11 Doc Rev. 5.0

12 Vortex Rack per provette Guanti monouso, senza talco Termometri calibrati per bagnomaria e termoblocco a secco * L'accuratezza dei pipettatori deve rientrare nel 3% del volume dichiarato. Utilizzare i puntali privi di RNAsi a spostamento positivo o con barriera antiaerosol laddove specificato al fine di evitare la contaminazione crociata di campioni e amplicon. PRELIEVO, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Nota: maneggiare tutti i campioni come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. A. Prelievo dei campioni Il test COBAS TaqMan HCV, v2.0 è concepito per essere utilizzato esclusivamente con campioni di siero o plasma. Prelevare il sangue in provette con separatore di siero BD SST o provette sterili con EDTA (tappo lavanda) come anticoagulante. Conservare il sangue a 2 25 C per non più di 6 ore. Per separare il siero o il plasma dal sangue intero entro 6 ore dal prelievo, seguire le istruzioni del produttore delle provette. Trasferire il siero o il plasma in una provetta sterile di polipropilene. Le Figure 4 e 5 illustrano i dati degli studi sul prelievo dei campioni, che sono stati eseguiti utilizzando il test COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, versione 2.0 (v2.0). Figura 4 Stabilità dell'hcv nel sangue intero - Provette SST (siero) Risultato medio RNA HCV Log 10 RNA HCV (UI/ml) < 1 ora 2 8C 6 ore 2 8C 24 ore 2 8C 48 ore 2 8C 72 ore 2 8C < 1 ora 20 25C 6 ore 20 25C 24 ore 20 25C 48 ore 20 25C 72 ore 20 25C Numero campione Figura 5 Stabilità dell'hcv nel sangue intero - Provette EDTA (plasma EDTA) Risultato medio RNA HCV Log 10 RNA HCV (UI/ml) < 1 ora 2 8C 6 ore 2 8C 24 ore 2 8C 48 ore 2 8C 72 ore 2 8C < 1 ora 20 25C 6 ore 20 25C 24 ore 20 25C 48 ore 20 25C 72 ore 20 25C Numero campione IT 12 Doc Rev. 5.0

13 B. Trasporto dei campioni Il trasporto di sangue intero, siero o plasma deve essere conforme alla normativa riguardante gli agenti eziologici 22. Il sangue intero deve essere trasportato a 2 25 C e trattato entro 6 ore dal prelievo. Il plasma o il siero possono essere trasportati a 2 8 C o congelati a temperature comprese tra 20 C e 80 C. C. Conservazione dei campioni I campioni di siero o plasma possono essere conservati a 2 8 C per un massimo di 3 giorni o congelati a una temperatura di 70 C o inferiore. Si consiglia di conservare i campioni in aliquote di µl in provette sterili da 2,0 ml con tappo a vite in poliprolpilene (ad esempio, Sarstedt P/N ). Le Figure 6 e 7 illustrano i dati degli studi sulla conservazione dei campioni, che sono stati eseguiti utilizzando il test COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0. Figura 6 Stabilità HCV nel siero Risultato medio RNA HCV Log 10 RNA HCV (UI/ml) < 1 ora 2 8C 72 ore 2 8C 120 ore 2 8C 168 ore 2 8C 240 ore 2 8C < 1 ora 20 25C 72 ore 20 25C 120 ore 20 25C 168 ore 20 25C 240 ore 20 25C Numero campione Figura 7 Stabilità dell'hcv nel plasma con EDTA Risultato medio RNA HCV Log 10 RNA HCV (UI/ml) < 1 ora 2 8C 72 ore 2 8C 120 ore 2 8C 168 ore 2 8C 240 ore 2 8C < 1 ora 20 25C 72 ore 20 25C 120 ore 20 25C 168 ore 20 25C 240 ore 20 25C Numero campione I campioni di siero o plasma possono essere congelati e scongelati per un massimo di tre volte senza perdita dell'rna di HCV. La Tabella 1 illustra i dati degli studi sul congelamento-scongelamento, che sono stati eseguiti utilizzando il test COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v IT 13 Doc Rev. 5.0

14 Matrice Tabella 1 Differenze Log 10 nelle concentrazioni di HCV dal ciclo 0 per siero e plasma con EDTA congelati e scongelati per 5 cicli Stabilità N. campione Ciclo congelamento/scongelamento Ciclo 0 Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 5 1 0,00 0,052 0,238 0,179 0,670 0, ,00 0,293 0,228 0,206 0,338 0,175 Siero 3 0,00 0,270 0,023 0,430 0,008 0, ,00 0,071 0,516 0,295 0,564 0, ,00 0,342 0,031 0,344 0,436 0,277 Media siero 0,00 0,077 0,021 0,239 0,400 0, ,00 0,006 0,043 0,143 0,159 0, ,00 0,329 0,375 0,234 0,642 0,265 Plasma in EDTA 13 0,00 0,056 0,248 0,371 0,395 0, ,00 0,186 0,066 0,034 0,241 0, ,00 0,120 0,111 0,055 0,250 0,217 Media plasma in EDTA 0,00 0,065 0,151 0,167 0,237 0,170 ISTRUZIONI PER L'USO Nota: Per le istruzioni operative dettagliate, una descrizione approfondita dei possibili flussi di lavoro, la stampa dei risultati e l'interpretazione di avvisi (flag), commenti e messaggi di errore, consultare il Manuale dello strumento Analizzatore COBAS TaqMan 48 per l'uso con il Manuale dell'applicazione del software AMPLILINK, versione serie 3.2 e 3.3 e uno dei seguenti tra (1) Manuale dell'applicazione del software AMPLILINK, versione serie 3.2 per l'uso con lo strumento COBAS AmpliPrep, l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48 e l'analizzatore COBAS AMPLICOR oppure (2) Manuale dell'applicazione del software AMPLILINK, versione serie 3.3 per l'uso con lo strumento COBAS AmpliPrep, l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48, l'analizzatore COBAS AMPLICOR e lo strumento cobas p 630. Nota: Tutti i reagenti di amplificazione e rilevazione devono raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso. Se sono conservati a 2 8 C, estrarli dal frigorifero almeno 30 minuti prima dell'uso. Nota: Prima dell'uso, lasciare equilibrare il siero e il plasma per minuti a temperatura ambiente. Nota: Utilizzare pipettatori con puntali dotati di barriera antiaerosol o a spostamento positivo laddove specificato. Prestare la massima attenzione per evitare qualsiasi contaminazione. Numero di test per serie: Ciascun kit contiene reagenti sufficienti per quattro serie di 12 test ciascuna, analizzabili separatamente o simultaneamente. È necessario includere un duplicato per ciascun reagente CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 e HCV H(+)C, v2.0 in ogni seduta analitica effettuata su almeno 24 campioni e controlli (consultare la sezione "Controllo di qualità"). I reagenti di amplificazione e rilevazione sono confezionati in flaconi riutilizzabili per 24 test. Per un uso più efficiente dei reagenti, si consiglia di analizzare i campioni e i controlli in multipli di IT 14 Doc Rev. 5.0

15 Preparazione dei campioni e dei controlli Nota: In caso di utilizzo di campioni di siero o plasma, lasciarli a temperatura ambiente finché non sono completamente scongelati e miscelarli in vortex per 5 10 secondi prima dell'uso. Nota: Prima di procedere, attendere che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente. Prima di iniziare le reazioni di purificazione, preriscaldare i termoblocchi a una temperatura di 70ºC (± 2 C) e il bagnomaria a 50ºC (± 2 C). A. Preparazione dei reagenti Nota: Preparare la soluzione di lavoro di lisi/legame soltanto dopo aver lasciato equilibrare a temperatura ambiente per minuti tutti i campioni e i controlli. 1. Preparare il tampone di rimozione inibitore pipettando 20 ml di etanolo al % nel flacone IRB. Mescolare capovolgendo 5 10 volte. Il tampone di rimozione inibitore così ricostituito è sufficiente per 48 test. 2. Preparare il tampone di lavaggio pipettando 50 ml di etanolo al % e 30 ml di acqua deionizzata nel Tampone di lavaggio (WASH). Mescolare capovolgendo 5 10 volte. Il tampone di lavaggio ricostituito è sufficiente per 48 test. 3. Preriscaldare il tampone di eluizione (ELB) a 70ºC (± 2 C) in una provetta da 2,0 ml con tappo a vite per microcentrifuga. È possibile utilizzare più provette. Il volume di eluizione per campione è di 75 µl. Preriscaldare il volume riportato nella tabella seguente tenendo conto del numero di test. Numero di replicati Reagente Tampone di eluizione (ml) 2,0 4,0 4. Pipettare in una provetta sterile pulita il volume di isopropanolo riportato nella tabella seguente tenendo conto del numero di test. Numero di replicati Reagente Isopropanolo (ml) 5,0 10,0 5. Pipettare 0,5 ml di tampone di eluizione (ELB) nell'rna vettore (CAR). Ritappare, capovolgere il flacone, quindi miscelare in vortex fino a completo dissolvimento dell'rna vettore. L'RNA vettore così ricostituito è sufficiente per 24 test. Il vettore RNA ricostituito inutilizzato può essere conservato a temperature comprese tra 15 e 25 C per un massimo di 28 giorni o sino alla data di scadenza, se precedente. 6. Pipettare 5,0 ml di tampone di eluizione (ELB) nella proteinasi K (PK). Ritappare, capovolgere il flacone, quindi miscelare in vortex fino al completo dissolvimento della proteinasi K. La proteinasi K così ricostituita è sufficiente per 24 test. La proteinasi K ricostituita inutilizzata può essere conservata a temperature comprese tra 15 e 25 C per un massimo di 28 giorni o sino alla data di scadenza, se precedente. 7. Preparare la soluzione di lavoro di lisi/legame come segue, pipettando i volumi riportati nella tabella seguente e tenendo conto del numero di campioni e controlli da trattare: Numero di replicati Reagenti Tampone di lisi/legame (ml) 7,0 14,0 RNA vettore (µl) QS HCV (µl) Proteinasi K (ml) 1,4 2,8 Nota: Il volume di HCV QS è specifico per il test COBAS TaqMan HCV, v IT 15 Doc Rev. 5.0

16 Nota: In caso di utilizzo dell'rna vettore o proteinasi K congelati, scongelarli a temperatura ambiente e capovolgere i flaconi varie volte prima dell'uso. Aggiungere il volume indicato di tampone di lisi/legame in una provetta sterile da 50 ml. Aggiungere il volume indicato di RNA vettore ricostituito nella provetta contenente il tampone di lisi/legame. Miscelare in vortex l'hcv QS per 3 5 secondi e dispensare il volume indicato di HCV QS nella provetta contenente il tampone di lisi/legame e il vettore RNA ricostituito. Tappare la provetta e mescolare capovolgendo volte. NON miscelare in vortex, perché così facendo si creerebbero bolle nella soluzione. Aggiungere il volume indicato di proteinasi K ricostituita nella provetta contenente il tampone di lisi/legame. Tappare la provetta e mescolare capovolgendo volte. NON miscelare in vortex, perché così facendo si creerebbero bolle nella soluzione. Iniziare a dispensare la soluzione di lavoro di lisi/legame subito dopo aver aggiunto e mescolato la proteinasi K e il tampone di lisi/legame. Il tampone di lisi/legame (LYS) inutilizzato può essere conservato a temperature comprese tra 15 e 25 C per un massimo di 28 giorni o sino alla data di scadenza, se precedente. Gettare via la soluzione di lavoro di lisi/legame inutilizzata. B. Preparazione dei campioni e dei controlli Nota: Per questa procedura si raccomanda l'uso di pipettatori regolabili con puntali antiaerosol. Nota: Per le fasi 19 e 22 è possibile utilizzare una pipetta a ripetizione con puntali combinati sterili di dimensioni adeguate. Prestare tuttavia estrema attenzione a evitare spruzzi di reagenti e contaminazione crociata. 1. Pipettare 625 µl di soluzione di lavoro di lisi/legame in ogni pozzetto del rack di lisi (I, trasparente). Abbassare e premere i coperchi in posizione di chiusura. 2. Aprire un pozzetto alla volta e pipettare 500 µl di campione o controllo nel pozzetto appropriato. Dopo aver aggiunto ciascun campione o controllo, abbassare e premere il coperchio finché il meccanismo a scatto non si inserisce e il pozzetto è perfettamente chiuso. 3. Una volta aggiunti tutti i campioni e i controlli, miscelare in vortex il rack di lisi riempito, per circa 10 secondi. Confermare visivamente che tutti i pozzetti sono ben miscelati. 4. Incubare il rack di lisi in un bagnomaria preriscaldato a 50ºC (± 2 C) per 10 minuti. Immergere il rack di lisi in un bagnomaria contenente circa 5 7 cm di acqua. Asciugare il rack di lisi dopo averlo estratta dal bagnomaria. 5. Centrifugare il rack di lisi per secondi, con una regolazione di 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione. È possibile che la centrifuga non raggiunga la velocità impostata. 6. Aprire un pozzetto alla volta e pipettare 250 µl di isopropanolo in ciascun pozzetto. Dopo ciascuna aggiunta, abbassare e premere il coperchio finché il meccanismo a scatto non si inserisce e chiude perfettamente il pozzetto. Nota: Il volume di isopropanolo è specifico per il test COBAS TaqMan HCV, v Mescolare i campioni capovolgendo il rack tre volte e quindi miscelando in vortex per circa 10 secondi. Confermare visivamente che tutti i pozzetti sono ben miscelati. 8. Centrifugare il rack di lisi per secondi, con una regolazione di 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione. È possibile che la centrifuga non raggiunga la velocità impostata. 9. Aprire un pozzetto alla volta, trasferire 750 µl di miscela di controllo o campione nei pozzetti corrispondenti del rack delle provette filtranti (II, giallo) con annesso rack di scarto (bianco). Dopo aver aggiunto ogni miscela di controllo o campione, abbassare e premere il coperchio finché il meccanismo a scatto non si inserisce e il pozzetto è perfettamente chiuso. 10. Una volta aggiunti tutti i campioni o controlli, centrifugare il gruppo del rack delle provette filtranti per 2 minuti a 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione IT 16 Doc Rev. 5.0

17 11. Aprire un pozzetto alla volta, trasferire la miscela di controllo o di campione rimanente nei pozzetti corrispondenti del rack delle provette filtranti. Dopo aver aggiunto la miscela di ciascun campione o controllo, chiudere perfettamente il coperchio del pozzetto. Smaltire il rack di lisi in modo appropriato. 12. Centrifugare il rack delle provette filtranti per 2 minuti a 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione. 13. Rimuovere il rack delle provette filtranti dal rack di scarico abbassando entrambi i ganci a scatto sul lato superiore del rack delle provette filtranti. Smaltire il rack di scarico in modo appropriato. Sostituire con un nuovo rack di scarico e agganciarvi il rack delle provette filtranti. 14. Aprire tutti i coperchi del rack delle provette filtranti con le pinze e pipettare 400 µl di tampone di rimozione inibitore (IRB) sul lato di ogni pozzetto. Non toccare i lati del pozzetto. Dopo aver dispensato il tampone di rimozione inibitore in tutti i pozzetti, chiudere perfettamente i coperchi. 15. Centrifugare il rack delle provette filtranti per 2 minuti a 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione. 16. Aprire tutti i coperchi con le pinze e pipettare 700 µl di tampone di lavaggio (WASH) sul lato di ogni pozzetto. Non toccare i lati del pozzetto. Dopo aver dispensato il tampone di lavaggio in tutti i pozzetti, chiudere perfettamente i coperchi. 17. Centrifugare il rack delle provette filtranti per 2 minuti a 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione. 18. Rimuovere il rack delle provette filtranti dal rack di scarico abbassando entrambi i ganci a scatto sul lato superiore del rack delle provette filtranti. Smaltire il rack di scarico in modo appropriato. Sostituire con un nuovo rack di scarico e agganciarvi il rack delle provette filtranti. 19. Aprire tutti i coperchi con le pinze e pipettare 700 µl di tampone di lavaggio sul lato di ogni pozzetto. Non toccare i lati del pozzetto. Dopo aver dispensato il tampone di lavaggio in tutti i pozzetti, chiudere perfettamente i coperchi. 20. Centrifugare il rack delle provette filtranti per 3 minuti a 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione. 21. Rimuovere il rack delle provette filtranti dal rack di scarico abbassando entrambi i ganci a scatto sul lato superiore del rack delle provette filtranti. Posizionare il rack delle provette filtranti sul rack di eluizione (IIIA, blu) e agganciarlo al rack di eluizione. Smaltire il rack di scarico in modo appropriato. 22. Aprire tutti i coperchi con le pinze e pipettare 75 µl di tampone di eluizione (ELB) preriscaldato al centro di ogni filtro senza toccare quest'ultimo. Nota: Non aggiungere il tampone di eluizione dispensandolo lungo i lati del pozzetto. Dopo aver dispensato il tampone di eluizione in tutti i pozzetti, chiudere perfettamente i coperchi. Incubare il rack di eluizione a temperatura ambiente per almeno 3 minuti dopo aver aggiunto il tampone di eluizione all'ultimo pozzetto. 23. Centrifugare il rack delle provette filtranti per 3 minuti a 4600 x g nella centrifuga per piastre di microtitolazione. 24. Rimuovere il rack delle provette filtranti dal rack di eluizione abbassando entrambi i ganci a scatto sul lato superiore del rack delle provette filtranti. Smaltire il rack delle provette filtranti in modo appropriato. 25. Posizionare il copri-rack (IIIB, blu) sul rack di eluizione (IIIA, blu). Premere con decisione e fissare i ganci al rack di eluizione. Chiudere tutti i coperchi. 26. I controlli e i campioni trattati sono utilizzati direttamente per la PCR. Per l'amplificazione, utilizzare 50 µl dei controlli e dei campioni trattati. Aggiungere i controlli e i campioni trattati al Master Mix di lavoro entro 3 ore dal completamento della preparazione. Se non è possibile utilizzare i controlli e i campioni trattati entro 3 ore dalla preparazione, conservarli a 2 8ºC per un massimo di 24 ore nel rack di eluizione coperto oppure congelarli a 20ºC per non più di 1 settimana, in provette sterili in polipropilene da 2,0 ml con tappo a vite (ad esempio, P/N: ). L'amplificazione deve avere inizio entro 2 ore dal momento in cui i campioni e i controlli trattati sono stati aggiunti al Master Mix di lavoro IT 17 Doc Rev. 5.0