PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. 72 Tests P/N: CMV Test. 5.1 Liters P/N: Wash Reagent USO PREVISTO

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1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP 72 Tests P/N: CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent USO PREVISTO Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV è un test di amplificazione dell'acido nucleico in vitro che consente di quantificare il DNA di citomegalovirus nel plasma umano in EDTA utilizzando lo strumento COBAS AmpliPrep per la preparazione automatizzata dei campioni e l'analizzatore COBAS TaqMan o COBAS TaqMan 48 per l'amplificazione e la rilevazione automatizzate. Il test quantifica il DNA di CMV su un intervallo compreso tra 150 e copie/ml. Una copia di DNA di CMV (in base alla definizione del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) equivale a 0,91 Unità Internazionali (UI) [1,1 cp/ui] con riferimento al Primo Standard Internazionale dell OMS per il citomegalovirus umano per le tecniche di amplificazione dell acido nucleico (NIBSC 09/162) 40. Il test è da utilizzarsi in pazienti a rischio di infezione da CMV insieme ai dati clinici e ai risultati di altri test di laboratorio per la diagnosi e la gestione dell'infezione da CMV. Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV non è destinato all'uso come test di screening per la presenza del virus CMV nel sangue o negli emoderivati o come test diagnostico per confermare la presenza di un'infezione da CMV. I risultati ottenuti con il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV devono essere interpretati nel contesto di tutti gli altri riscontri clinici e di laboratorio. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST Il citomegalovirus umano (HCMV o CMV) è un patogeno virale umano appartenente alla famiglia degli Herpesvirus, presente sia nelle società industriali sviluppate che nei gruppi aborigeni isolati. 1,2 Le vie di trasmissione più comuni sono sangue, secrezioni orofaringee, urina, perdite cervicali e vaginali, liquido spermatico, latte materno, lacrime e feci. 3-9 Le infezioni primarie da CMV in soggetti immunocompetenti sono generalmente asintomatiche e spesso determinano infezioni latenti non diagnosticate. I principali siti di infezione sembrano essere le cellule mononucleate di sangue periferico (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) e le cellule endoteliali. Il virus CMV si mantiene in uno stadio latente nei monociti/macrofagi negli esseri umani. 2 I soggetti con un'infezione latente possono, ad intermittenza, riversare il virus nei propri fluidi corporei e di conseguenza contagiare altri soggetti. Nei soggetti immunocompromessi, tra cui neonati, trapiantati e malati di AIDS, sussiste un rischio elevato di sviluppare infezioni da CMV gravi che possono indurre un'alta percentuale di morbilità e mortalità. 10 Manifestazioni cliniche gravi della patologia da CMV sono: sindrome da CMV, retinite, gastroenterite, epatite, encefalite, esofagite, enterocolite, pancreatite e polmonite Per la diagnosi di infezione disseminata e malattia attiva di organo terminale causate dal citomegalovirus umano vengono utilizzate le seguenti tecniche di laboratorio: isolamento del virus tramite coltura da leucociti di sangue periferico (peripheral blood leukocyte, PBL), biopsia istologica, metodi sierologici, misurazione dell'antigene pp65 e rilevazione del DNA di CMV tramite reazione a catena della polimerasi (PCR). 14 I metodi basati sui test in coltura hanno un basso valore predittivo, possono impiegare da 48 ore a 3 settimane e hanno una possibilità d'uso limitata, in particolare per i pazienti immunocompromessi. Il test dell'antigenemia pp65 è laborioso e prevede che il sangue sia trattato entro sei ore dal prelievo, alla luce del fatto che l'antigenemia tende a diminuire durante la conservazione. 15,22 Il test pp65 è inoltre di difficile esecuzione su soggetti gravemente neutropenici. I risultati positivi al DNA di CMV nel plasma ottenuti con la tecnica PCR dimostrano una buona correlazione con la positività delle colture di cellule PBL e con l'aumento del rischio di sviluppare la patologia sistemica da CMV. Con una serie di studi è stata dimostrata l'associazione tra carica virale del CMV e rischio di sviluppare la patologia da CMV La carica virale elevata definisce chiaramente il rischio di sviluppare la patologia da CMV e da questo si evince l'importanza del ruolo svolto dal titolo virale nella patogenesi della malattia. 18,27,30,31 Studi condotti su trapiantati di organi e malati di AIDS hanno dimostrato che la rilevazione del DNA di CMV tramite PCR è altamente predittiva del successivo decorso ed esito clinico della malattia. 17,23-26 Valutazioni quantitative dei livelli di DNA di CMV hanno dimostrato come cariche virali elevate e un aumento della carica virale nel corso del tempo siano associati a prognosi cliniche più sfavorevoli per una serie di condizioni di rischio correlate al virus CMV. 18,27,28 Inoltre i test PCR quantitativi consentono il monitoraggio dell'efficacia della terapia antivirale e la valutazione 26,29,30, 32 indiretta della resistenza virale. La sezione Revisione del documento è disponibile in calce al documento IT 1 Doc Rev. 4.0

2 L'uso della carica virale di CMV è raccomandato nelle attuali linee guida per il trattamento dei trapiantati di organi solidi (per monitorare i pazienti che rischiano di sviluppare la patologia da CMV e che necessitano di un'adeguata profilassi) e a scopo terapeutico per il monitoraggio dei pazienti con malattia attiva da CMV. 21,22 È inoltre raccomandato come uno dei criteri diagnostici per l'identificazione della patologia da CMV nei trapiantati di cellule staminali ematopoietiche. 33 PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV è un test di amplificazione dell'acido nucleico che consente di quantificare il DNA di citomegalovirus (CMV) nel plasma umano. Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV si basa su due procedure principali: (1) preparazione dei campioni per isolare il DNA di CMV e (2) amplificazione PCR del DNA target e simultanea rilevazione della sonda oligonucleotidica con doppio marcatore fluorescente scissa specifica per il target. Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV consente la preparazione automatizzata dei campioni seguita dall'amplificazione PCR e dalla rilevazione del DNA di CMV target e del DNA dello standard di quantificazione (QS) di CMV. Il reagente Master Mix contiene primer e sonde specifiche per il DNA di CMV e per il DNA dello standard di quantificazione (QS) di CMV. La rilevazione del DNA amplificato viene eseguita utilizzando sonde oligonucleotidiche con doppio marcatore fluorescente, una target-specifica e una QS-specifica, che permettono di identificare in modo indipendente l'amplicone di CMV (target) e l'amplicone dello standard di quantificazione (QS di CMV). La quantificazione del DNA virale di CMV viene eseguita con lo standard di quantificazione (QS di CMV), che compensa gli effetti dell'inibizione e controlla i processi di preparazione e amplificazione garantendo una quantificazione più accurata del DNA di CMV in ogni campione. Il QS di CMV è un costrutto di DNA non infettivo che contiene siti di legame dei primer identici a quelli del DNA di CMV target, oltre ad una regione esclusiva di legame della sonda che consente di distinguere l'amplicone di QS di CMV dall'amplicone di CMV target. Il QS di CMV viene aggiunto in ogni campione ad un numero di copie noto e viene sottoposto alle successive fasi di preparazione del campione, amplificazione PCR e simultanea rilevazione delle sonde oligonucleotidiche con doppio marcatore fluorescente scisse. L'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 calcola la concentrazione del DNA di CMV nei campioni di analisi confrontando il segnale di CMV al segnale del QS di CMV per ogni campione e controllo. Selezione del target Per estrarre il DNA di CMV e il DNA del QS di CMV viene usata una preparazione generica del campione basata sulla silice, mentre per l'amplificazione del DNA di CMV e del DNA del QS di CMV vengono utilizzati come primer di amplificazione degli oligonucleotidi specifici. Le due sonde oligonucleotidiche a doppia marcatura (una target-specifica e una QS-specifica) consentono di identificare in modo indipendente l'amplicone di CMV e l'amplicone del QS di CMV. Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV utilizza due primer di amplificazione per la PCR. Una sonda a doppia marcatura che emette un segnale ibridizza ad uno dei due filamenti e viene scissa dalla DNA polimerasi Z05 durante l'estensione dei primer. Preparazione dei campioni Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV utilizza la preparazione automatizzata dei campioni sullo strumento COBAS AmpliPrep basata su una tecnica di cattura generica con la silice. La procedura prevede il trattamento di 500 μl di plasma. Le particelle del virus CMV vengono lisate tramite incubazione ad una temperatura elevata con una soluzione tampone proteasica e di lisi/legame caotropico che rilascia gli acidi nucleici e protegge il DNA di CMV liberato dalle DNasi nel plasma. La proteasi ed un numero noto di molecole di DNA del QS di CMV vengono introdotti in ogni campione, insieme al reagente di lisi e alle biglie magnetiche. La miscela viene quindi incubata e il DNA di CMV e il DNA del QS di CMV si legano alla superficie delle biglie magnetiche. Le sostanze che non formano legami, ad esempio i sali, le proteine e le altre impurità cellulari, vengono eliminate lavando via le biglie magnetiche. Dopo avere separato le biglie magnetiche ed avere completato le fasi di lavaggio, gli acidi nucleici adsorbiti vengono eluiti ad una temperatura elevata con una soluzione acquosa. Il campione trattato, contenente il DNA di CMV e il DNA del QS di CMV, viene aggiunto alla miscela di amplificazione e trasferito sull'analizzatore COBAS TaqMan oppure sull'analizzatore COBAS TaqMan 48. Amplificazione PCR La reazione di amplificazione PCR è ottenuta tramite polimerasi del DNA dell'enzima ricombinante termostabile Thermus specie Z05 (DNA polimerasi Z05). In presenza di magnesio (Mg 2+ ) e in condizioni tampone appropriate, l'enzima Z05 manifesta attività di polimerasi del DNA. 34 Ciò fa sì che possano avvenire simultaneamente l'amplificazione PCR e la rilevazione real-time dell'amplicone. I campioni trattati vengono aggiunti alla miscela di amplificazione nelle provette di amplificazione (provette K) in cui ha luogo la reazione a catena della polimerasi (PCR). In presenza di Mg 2+ e di deossinucleotidi trifosfati (dntp) in eccesso, tra i quali trifosfati di deossiadenosina, deossiguanosina, deossicitidina, deossiuridina e deossitimidina, la polimerasi Z05 estende i primer appaiati formando filamenti di DNA IT 2 Doc Rev. 4.0

3 Amplificazione del target Il termociclatore presente nell'analizzatore COBAS TaqMan o nell'analizzatore COBAS TaqMan 48 riscalda la miscela della reazione per denaturare il DNA a doppio filamento e per esporre le sequenze target-specifiche dei primer. A mano a mano che la miscela si raffredda, ha luogo l'annealing (appaiamento) dei primer con il DNA target. In presenza di Mg 2+ e di dntp in eccesso, la polimerasi Z05 estende i primer appaiati lungo il templato target, producendo una molecola di DNA a doppio filamento denominata "amplicone". L'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 ripete automaticamente questa procedura per un determinato numero di cicli, raddoppiando ad ogni ciclo la quantità di DNA amplicone. Il numero di cicli necessari è pre-programmato nell'analizzatore COBAS TaqMan o nell'analizzatore COBAS TaqMan 48. L'amplificazione avviene esclusivamente nella regione del genoma CMV compresa tra i primer; non viene amplificato l'intero genoma CMV. Amplificazione selettiva L'amplificazione selettiva dell'acido nucleico target dal campione è ottenuta nel test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV grazie all'uso dell'enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) e del trifosfato di deossiuridina (dutp). L'enzima AmpErase riconosce e catalizza la distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina 35, ma non del DNA contenente deossitimidina. La deossiuridina non è presente nel DNA naturale, ma è sempre presente nell'amplicone perché il trifosfato di deossiuridina è uno dei dntp usati nel reagente Master Mix e, di conseguenza, soltanto l'amplicone contiene deossiuridina. La deossiuridina rende l'amplicone contaminante suscettibile alla distruzione da parte dell'enzima AmpErase prima dell'amplificazione del DNA target. Inoltre qualsiasi prodotto non specifico che si sia formato dopo l'attivazione iniziale del reagente Master Mix ad opera del magnesio viene distrutto dall'enzima AmpErase. L'enzima AmpErase, che è contenuto nel reagente Master Mix, catalizza la scissione del DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosio nella posizione C1. Quando viene riscaldata nella prima fase del ciclo termico, la catena di DNA dell'amplicone si spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'enzima AmpErase rimane inattivo per un periodo di tempo prolungato dopo essere stato esposto a temperature superiori a 55 C, quindi durante le fasi del ciclo termico, e di conseguenza non distrugge l'amplicone target che si è formato durante l'amplificazione. Rilevazione dei prodotti della PCR in un test COBAS TaqMan Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV utilizza la tecnologia PCR real-time 36,37. L'uso di sonde fluorescenti a doppia marcatura permette di rilevare in tempo reale l'accumulo dei prodotti della PCR monitorando l'intensità di emissione dei fluorocromi reporter liberati durante il processo di amplificazione. Le sonde sono costituite da oligonucleotidi CMV-specifici e QS di CMV-specifici, marcati con un fluorocromo reporter e un fluorocromo quencher. Nel test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV, le sonde CMV e QS di CMV sono marcate con fluorocromi reporter differenti. Quando le sonde sono integre, la fluorescenza del fluorocromo reporter viene soppressa dalla vicinanza del fluorocromo quencher per effetto del trasferimento di energia di tipo Förster. Durante la reazione polimerasica a catena (PCR), la sonda ibridizza ad una sequenza target e viene scissa dall'attività della 5' 3' nucleasi della DNA polimerasi Z05 termostabile. Non appena i fluorocromi reporter e quencher vengono liberati e si separano, cessa l'attività di soppressione (quenching) mentre si intensifica l'attività fluorescente del fluorocromo reporter. L'amplificazione del DNA di CMV e del DNA del QS di CMV viene misurata in modo indipendente a lunghezze d'onda diverse. Questo processo viene ripetuto per il numero di cicli stabilito, aumentando ad ogni ciclo l'intensità delle emissioni dei singoli fluorocromi reporter, consentendo l'identificazione indipendente del DNA di CMV e del DNA del QS di CMV. Il ciclo PCR in cui una curva di crescita innesca una crescita esponenziale è correlato alla quantità di materiale di partenza all'inizio della reazione PCR. Principi fondamentali della quantificazione con il test COBAS TaqMan Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV genera risultati quantitativi per una gamma dinamica molto ampia, poiché il monitoraggio dell'amplicone avviene durante la fase esponenziale dell'amplificazione. Più è alto il titolo CMV di un campione, prima verrà superato il livello baseline di fluorescenza dal fluorocromo reporter delle sonde CMV (Figura 1). Dal momento che la quantità di DNA del QS di CMV è costante in tutti i campioni, la fluorescenza del fluorocromo reporter della sonda QS di CMV dovrà comparire ad un ciclo simile per tutti i campioni (Figura 2). Nei campioni in cui è influenzata la fluorescenza dello standard di quantificazione, la concentrazione viene corretta di conseguenza. La comparsa dei segnali fluorescenti specifici viene documentata come valore di soglia critico (Ct). La definizione del valore Ct è: il numero di ciclo frazionario in cui la fluorescenza del fluorocromo reporter supera una soglia predeterminata (Livello di fluorescenza assegnato) e viene registrato l'inizio di una fase di crescita esponenziale di questo segnale (Figura 3). Un valore Ct più alto indica un titolo più basso del materiale target CMV iniziale. Un aumento di 2 volte nel titolo è correlato ad una diminuzione di 1 Ct per il DNA di CMV target, mentre un aumento di 10 volte nel titolo è correlato ad una diminuzione di 3,3 Ct. La Figura 1 mostra esempi di curve di crescita del target per una serie di diluizioni su un intervallo 5-log 10. A mano a mano che la concentrazione del virus aumenta, le curve di crescita sono anticipate ai cicli precedenti. La curva di crescita più a sinistra corrisponde quindi al livello più elevato di titolo virale, mentre la curva di crescita più a destra corrisponde al livello più basso di titolo virale IT 3 Doc Rev. 4.0

4 Figura 1 Curve di crescita del target per una serie di diluizioni del virus su un intervallo 5-log 10 Fluorescenza normalizzata Titolo più alto Titolo più basso Numero del ciclo La Figura 2 mostra le curve di crescita di esempio dello standard di quantificazione per i campioni da una serie di diluizioni virali su un intervallo 5-log 10. La quantità di QS aggiunta ad ogni campione è costante per ogni reazione. Il valore Ct del QS è simile indipendentemente dal titolo virale. Figura 2 Curve di crescita del QS per una serie di diluizioni del virus su un intervallo 5-log 10 Fluorescenza normalizzata Titolo più basso Titolo più alto Numero del ciclo IT 4 Doc Rev. 4.0

5 La Figura 3 mostra un esempio di come i valori di fluorescenza ad ogni ciclo vengono normalizzati per ogni curva di crescita. Il numero di ciclo frazionario (Ct) viene calcolato nel punto in cui il segnale di fluorescenza interseca il livello di fluorescenza assegnato. Figura 3 Normalizzazione dei valori di fluorescenza ad ogni ciclo per ogni curva di crescita Fluorescenza normalizzata Livello di fluorescenza assegnato Valore Ct = 27,3 Numero del ciclo Quantificazione del DNA di CMV Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV quantifica il DNA virale di CMV utilizzando una seconda sequenza target (standard di quantificazione CMV) che viene aggiunto in ogni campione di analisi ad una concentrazione nota. Il QS di CMV è un costrutto di DNA non infettivo, contenente frammenti di sequenze di CMV con regioni di legame per i primer identiche a quelle della sequenza target di CMV. Il QS di CMV contiene regioni di legame per i primer di CMV e genera un prodotto dell'amplificazione della stessa lunghezza e composizione di base del DNA target di CMV. La regione di legame della sonda di rilevazione del QS di CMV è stata modificata per poter distinguere l'amplicone del QS di CMV dall'amplicone target di CMV. Durante la fase di annealing della reazione PCR sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48, i campioni vengono illuminati ed eccitati dalla luce filtrata e, per ogni campione, vengono raccolti i dati della fluorescenza di emissione filtrata. Le letture provenienti da ogni campione vengono quindi corrette per tenere conto delle fluttuazioni strumentali. Queste letture della fluorescenza vengono trasmesse dallo strumento al software AMPLILINK e memorizzate in un database. I controlli preliminari consentono di stabilire se i dati relativi al DNA di CMV e al DNA del QS di CMV rappresentano serie valide. Se i dati non rientrano nei limiti preimpostati, vengono generati degli avvisi (flag). Una volta eseguiti e superati tutti i controlli preliminari, le letture della fluorescenza vengono elaborate allo scopo di generare i valori Ct per il DNA di CMV e per il DNA del QS di CMV. Le costanti di calibrazione specifiche del lotto fornite con il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV vengono utilizzate per calcolare il valore del titolo per i campioni e i controlli in base ai valori Ct del DNA di CMV e del DNA del QS di CMV. I risultati dei titoli sono espressi in Unità Internazionali/ml (UI/ml) o in copie/ml (cp/ml) IT 5 Doc Rev. 4.0

6 REAGENTI COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMV CS1 (Cassetta reagente MGP) Biglie magnetiche Tampone Tris base 0,09% Sodio azide 0,1% Metilparabene CMV CS2 (Cassetta reagente di lisi CMV) Diidrato di citrato di sodio 42,5% Tiocianato di guanidina 3,6% Polidocanolo 1,8% Ditiotreitolo Xn 42,5% (p/p) Tiocianato di guanidina CMVCAP 72 test 1 x 72 test 1 x 72 test Nocivo R20/21/22-R52/53-R32: Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Altamente tossico per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l'ambiente acquatico. A contatto con acidi libera gas molto tossico. S24/25-S36/37/39-S61: Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. Usare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. Non disperdere nell'ambiente. Riferirsi alle istruzioni speciali/schede informative in materia di sicurezza. CMV CS3 Cassetta multireagente CMV contenente: Pase (Soluzione proteinasi) Tampone Tris < 0,05% EDTA Cloruro di calcio Acetato di calcio 7,8% Proteinasi Glicerolo Xn 7,8% (p/p) Proteinasi 1 x 72 test 1 x 3,8 ml Nocivo R36-R42: Irritante per gli occhi. Può provocare sensibilizzazione per inalazione. S23-S45: Non respirare vapori. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). EB (Tampone di eluizione) Tampone Tris base Idrossido di sodio 0,09% Sodio azide 1 x 8,1 ml IT 6 Doc Rev. 4.0

7 CMV CS4 Cassetta di reagente specifico per il test CMV, contenente: CMV QS (Standard di quantificazione CMV) Tampone Tris-HCl EDTA < 0,005% Poli ra RNA (di sintesi) < 0,001% DNA plasmide non infettivo (batterico) contenente sequenze di legame al primer CMV e una regione esclusiva di legame alla sonda 0,05% Sodio azide CMV MMX (Master Mix CMV) Tampone tricina Acetato di potassio Idrossido di potassio < 20% Dimetil sulfoxide Glicerolo < 0,05% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01% Primer a monte e a valle per CMV < 0,01% Aptamero oligonucleotidico < 0,01% Sonde oligonucleotidiche fluorescenti, specifiche per il virus CMV e per lo standard di quantificazione CMV < 0,05% DNA Polimerasi Z05 (batterica) < 0,1% Enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) (batterico) 0,09% Sodio azide MgCl 2 (Soluzione di magnesio CAP/CTM) < 0,6% Cloruro di magnesio 0,09% Sodio azide CMV H(+)C (Controllo positivo alto CMV) < 0,001% Fago lambda contenente DNA di CMV Plasma umano definito non reattivo mediante test autorizzati dalla FDA USA per la determinazione di anticorpi anti-hcv, anticorpi anti-hiv-1/2 e antigene p24 di HIV o RNA di HIV-1, HBsAg; DNA di CMV non rilevabile con la metodica PCR. 1 x 72 test 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml 6 x 0,65 ml 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone Irritante S24-S37: Evitare il contatto con la pelle. Usare guanti adatti. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle IT 7 Doc Rev. 4.0

8 CMV L(+)C (Controllo positivo basso CMV) < 0,001% fago lambda contenente DNA di CMV ad una concentrazione di circa 100 volte inferiore alla concentrazione media del DNA di CMV in CMV H(+)C Plasma umano definito non reattivo mediante test autorizzati dalla FDA USA per la determinazione di anticorpi anti-hcv, anticorpi anti-hiv-1/2 e antigene p24 di HIV o RNA di HIV-1, HBsAg; DNA di CMV non rilevabile con la metodica PCR. 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone 6 x 0,65 ml Irritante S24-S37: Evitare il contatto con la pelle. Usare guanti adatti. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. CMV ( ) C (Controllo negativo CMV) Plasma umano definito non reattivo mediante test autorizzati dalla FDA USA per la determinazione di anticorpi anti-hcv, anticorpi anti-hiv-1/2 e antigene p24 di HIV o RNA di HIV-1, HBsAg; DNA di CMV non rilevabile con la metodica PCR. 0,1% Conservante ProClin 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone 6 x 0,65 ml Irritante S24-S37: Evitare il contatto con la pelle. Usare guanti adatti. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. CMV H(+)C Clip (Clip con codice a barre per controllo positivo alto CMV) CMV L(+)C Clip (Clip con codice a barre per controllo positivo basso CMV) CMV ( ) C Clip (Clip con codice a barre per controllo negativo CMV) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR (Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Diidrato di citrato di sodio < 0,1% N-Metilisotiazolone-HCI PG WR 1 x 6 clip 1 x 6 clip 1 x 6 clip 1 x 5,1 l IT 8 Doc Rev. 4.0

9 AVVERTENZE E PRECAUZIONI A. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. B. Questo test è destinato all'uso con plasma umano raccolto in anticoagulante EDTA. C. Non pipettare con la bocca. D. Non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti monouso protettivi, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi. Dopo avere manipolato i campioni e i reagenti del test, lavarsi accuratamente le mani. E. Evitare la contaminazione dei reagenti con microbi e nucleasi durante l'aliquotazione dalle fiale dei controlli. F. Si consiglia di utilizzare pipette sterili monouso e puntali per pipette privi di DNasi. G. Non combinare controlli di lotti diversi o di flaconi diversi dello stesso lotto. H. Non mescolare cassette di reagenti o controlli appartenenti a kit diversi. I. Non aprire le cassette COBAS AmpliPrep e non scambiare, mescolare, rimuovere o aggiungere flaconi. J. Smaltire i reagenti inutilizzati, i rifiuti e i campioni nel rispetto dei regolamenti locali, regionali e nazionali. K. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza indicata. L. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l ufficio Roche locale. M. Manipolare i campioni e i controlli come se fossero infettivi, adottando le procedure di sicurezza del laboratorio delineate inbiosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 e nel documento M29-A3 del CLSI. 39 Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. Nota: la candeggina liquida per uso domestico contiene in genere una concentrazione di ipoclorito di sodio del 5,25%. Diluendo la normale candeggina per uso domestico con rapporto 1:10 è possibile ottenere una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%. N. ATTENZIONE: i controlli CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C contengono plasma umano derivato da sangue umano. Il materiale di origine è stato analizzato ed è risultato non reattivo all'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg), agli anticorpi anti-hiv-1/2 e anti-hcv e all'antigene p24 o all'rna dell'hiv-1. L'analisi del plasma umano negativo con la metodica PCR non ha evidenziato DNA di CMV rilevabile. Nessun metodo di analisi attualmente disponibile è in grado di garantire con certezza assoluta che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Di conseguenza, tutti i materiali di origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. Manipolare i controlli CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C come se fossero infettivi, adottando le procedure di sicurezza del laboratorio delineate in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 e nel documento M29-A3 del CLSI. 39 Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. O. I reagenti MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 e CMV MMX contengono sodio azide. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo e rame formando azidi metalliche fortemente esplosive. Quando le soluzioni contenenti sodio azide vengono smaltite nei lavelli del laboratorio, è necessario sciacquare gli scarichi con abbondanti quantità d'acqua per impedire l'accumulo di azidi. P. Durante la manipolazione dei reagenti, indossare camici da laboratorio, guanti monouso e protezioni per gli occhi. Evitare il contatto di questi materiali con la cute, gli occhi o le membrane mucose. In caso di contatto accidentale, lavare immediatamente con abbondante acqua. Intervenire tempestivamente per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita accidentale dei reagenti, diluire con acqua prima di asciugare. Q. Non permettere che il reagente CMV CS2 e i rifiuti liquidi prodotti dallo strumento COBAS AmpliPrep, che contengono tiocianato di guanidina, entrino in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). Tali miscele possono produrre gas altamente tossici. R. Durante lo smaltimento delle unità SPU usate dello strumento COBAS AmpliPrep, che contengono tiocianato di guanidina, evitare qualsiasi contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). Tali miscele possono produrre gas altamente tossici IT 9 Doc Rev. 4.0

10 REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE A. Non congelare i reagenti e i controlli. B. Conservare a 2-8 C i reagenti CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 e CMV CS4. I reagenti inutilizzati sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, questi reagenti sono stabili per 70 giorni a 2-8 C o fino alla data di scadenza indicata, se precedente. I reagenti CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 e CMV CS4 possono essere utilizzati per un massimo di 6 cicli dello strumento, fino ad un massimo di 100 ore cumulative sullo strumento COBAS AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8 C tra un ciclo dello strumento e il successivo. C. Conservare a 2-8 C i controlli CMV H(+)C, CMV L(+)C e CMV ( ) C. I controlli sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, è necessario smaltire le parti inutilizzate. D. Conservare a 2-30 C i clip con il codice a barre [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip e CMV ( ) C Clip]. E. Conservare a 2-30 C il reagente PG WR. Il reagente PG WR è stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente è stabile per 28 giorni a 2-30 C o fino alla data di scadenza, se precedente. MATERIALI FORNITI A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMVCAP CMV CS1 (Cassetta reagente MGP per CMV) CMV CS2 (Cassetta reagente di lisi CMV) CMV CS3 (Cassetta multireagente CMV) CMV CS4 (Cassetta reagente test-specifico CMV) CMV H(+)C (Controllo positivo alto CMV) CMV L(+)C (Controllo positivo basso CMV) CMV ( ) C (Controllo negativo CMV) CMV H(+)C Clip (Clip con codice a barre per controllo positivo alto CMV) CMV L(+)C Clip (Clip con codice a barre per controllo positivo basso CMV) CMV ( ) C Clip (Clip con codice a barre per controllo negativo CMV) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR PG WR (Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) IT 10 Doc Rev. 4.0

11 MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Strumentazione e software Strumento COBAS AmpliPrep Analizzatore COBAS TaqMan o analizzatore COBAS TaqMan 48 Opzionale: Docking Station Opzionale: strumento cobas p 630 Software AMPLILINK, versione serie 3.3 Stazione dati del software AMPLILINK, con stampante. Manuali del software AMPLILINK serie v3.3: Manuale dello strumento - Strumento COBAS AmpliPrep per l'uso con l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48, l'analizzatore COBAS AMPLICOR o lo strumento cobas p 630 e il software AMPLILINK versione serie 3.2 e 3.3 Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS TaqMan (più docking station opzionale) per l'uso con il Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.2 e 3.3 Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS TaqMan 48 per l'uso con il Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.2 e 3.3 Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.3 per l'uso con lo strumento COBAS AmpliPrep, l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48, l'analizzatore COBAS AMPLICOR e lo strumento cobas p 630 Facoltativo: Manuale Operatore dello strumento cobas p 630, versione software 2.2 Materiale di consumo Unità di trattamento dei campioni: SPU Provette per campioni iniziali (provette S) e clip con codice a barre Rack per puntali K Rack per provette K ALTRI MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Rack per campioni (rack SK 24) Rack per reagenti Rack per SPU K-carrier Dispositivo di trasporto dei K-carrier Rack per K-carrier (obbligatori solo per l'analizzatore COBAS TaqMan 48) Pipettatori con puntali muniti di barriera antiaerosol o a spostamento positivo, privi di DNasi (da 1000 μl)* Guanti monouso, senza talco Miscelatore vortex * L accuratezza dei pipettatori deve rientrare nel 3% del volume dichiarato. Laddove specificato, è necessario utilizzare puntali privi di DNasi dotati di barriera antiaerosol o volumetrici, in modo da prevenire la contaminazione crociata del campione e dell amplicone IT 11 Doc Rev. 4.0

12 PRELIEVO, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Nota: Nota: manipolare tutti i campioni e i controlli come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. questo test è stato validato per l'uso con plasma umano raccolto in anticoagulante EDTA. L'uso di altri tipi di campioni per lo svolgimento del test può generare risultati non accurati. A. Prelievo dei campioni Il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV è destinato all'uso con campioni di plasma. Il sangue deve essere raccolto in apposite provette sterili con l'anticoagulante EDTA (tappo viola) e deve essere miscelato in misura sufficiente (fare riferimento alle istruzioni del produttore delle provette). B. Trasporto dei campioni Conservare il sangue intero a 2-25 C per non più di 6 ore. Separare il plasma dal sangue intero entro 6 ore dal prelievo, tramite centrifugazione a x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il plasma in una provetta sterile in polipropilene. Il trasporto del sangue intero o del plasma deve avvenire nel rispetto di tutti i regolamenti locali, regionali e nazionali per il trasporto di agenti eziologici. 41 Il sangue intero deve essere trasportato a 2-25 C e centrifugato entro 6 ore dal prelievo. Il plasma può essere trasportato a 2-8 C oppure congelato a -20 C. C. Conservazione dei campioni I campioni di plasma possono essere conservati a 2-8 C per un massimo di 7 giorni. È stato osservato che i campioni di plasma sono stabili per 6 settimane se congelati a -20 C. Si consiglia di conservare i campioni in aliquote da μl in provette sterili in polipropilene da 2,0 ml, dotate di tappo a vite (ad esempio, Sarstedt ). Nella Figura 4 sono illustrati i dati sulla stabilità dei campioni, ottenuti da studi sulla conservazione svolti con il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Figura 4 Stabilità del virus CMV in plasma con EDTA 3,50 Titolo log10 (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Campione 2-8ºC 0gg 2-8ºC 3gg 2-8ºC 7gg -20ºC 6sett IT 12 Doc Rev. 4.0

13 I campioni di plasma possono essere congelati e scongelati al massimo per 3 volte senza che vi sia una perdita significativa di DNA di CMV. Nella Figura 5 sono illustrati i dati ottenuti da uno studio sui cicli di congelamento/scongelamento svolto con il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Figura 5 Risultati del test CMV dopo un massimo di 3 cicli di congelamento/scongelamento (Cong/Scong) (plasma in EDTA) 3,50 Titolo log10 (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Campione 0x Cong/Scong 1x Cong/Scong 2x Cong/Scong 3x Cong/Scong ISTRUZIONI PER L'USO Nota: per le istruzioni operative dettagliate, una descrizione approfondita delle possibili configurazioni, la stampa dei risultati e l'interpretazione di avvisi (flag), commenti e messaggi di errore, consultare: (1) Manuale dello strumento - Strumento COBAS AmpliPrep per l'uso con l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48, l'analizzatore COBAS AMPLICOR o lo strumento cobas p 630 e il software AMPLILINK versione serie 3.3; (2) Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS TaqMan (più docking station opzionale) per l'uso con il Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.2 e 3.3; (3) Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS TaqMan 48 per l'uso con il Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.2 e 3.3; (4) Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.3 per l'uso con lo strumento COBAS AmpliPrep, l'analizzatore COBAS TaqMan e l'analizzatore COBAS TaqMan 48, l'analizzatore COBAS AMPLICOR e lo strumento cobas p 630; (5) Facoltativo: Manuale Operatore dello strumento cobas p 630, versione software 2.2. Dimensioni dei batch Ogni kit contiene reagenti sufficienti per 72 test, che possono essere suddivisi in batch di test. È necessario che in ogni batch sia incluso almeno uno ciascuno dei controlli CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C (vedere la sezione "Controllo di qualità"). Flusso di lavoro È necessario avviare la seduta sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 entro 120 minuti dal termine della preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: Non congelare e non conservare a 2-8 C i campioni e i controlli trattati IT 13 Doc Rev. 4.0

14 Preparazione dei campioni e dei controlli Nota: se si utilizzano campioni congelati, lasciare i campioni a temperatura ambiente fino al loro completo scongelamento e agitarli in vortex per 3-5 secondi prima dell'uso. Prelevare i controlli dal luogo in cui sono conservati a 2-8 C e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente prima dell'uso. Configurazione dello strumento COBAS AmpliPrep Parte A. Manutenzione e priming A1. Lo strumento COBAS AmpliPrep è pronto per il funzionamento in modalità stand-by. A2. Accendere la stazione dati del software AMPLILINK (posizione ON). Preparare la stazione dati nel modo seguente: a. Eseguire la connessione al sistema operativo Windows XP. b. Fare doppio clic sull'icona del software AMPLILINK. c. Aprire una sessione del software AMPLILINK specificando l'id utente e la password assegnati. A3. Controllare la quantità di reagente di lavaggio PG WR disponibile nella schermata Status e aggiungere altro reagente, se necessario. A4. Eseguire tutte le attività di manutenzione elencate nella scheda Due. Lo strumento COBAS AmpliPrep eseguirà automaticamente il priming del sistema. Parte B. Caricamento delle cassette di reagenti Nota: prelevare tutte le cassette di reagenti dal luogo in cui sono conservate a 2-8 C, caricarle immediatamente sullo strumento COBAS AmpliPrep e attendere per almeno 30 minuti che raggiungano la temperatura ambiente sullo strumento, prima di avviare il trattamento del primo campione. Evitare che le cassette di reagenti raggiungano la temperatura ambiente all'esterno dello strumento, in quanto potrebbe formarsi della condensa sulle etichette del codice a barre. Non tentare di asciugare l'eventuale condensa strofinando le etichette del codice. B1. Inserire il reagente CMV CS1 sul rack per reagenti. Inserire i reagenti CMV CS2, CMV CS3 e CMV CS4 su un rack per reagenti a parte. B2. Caricare il rack per reagenti che contiene il reagente CMV CS1 nella posizione del rack A dello strumento COBAS AmpliPrep. B3. Caricare il rack per reagenti che contiene i reagenti CMV CS2, CMV CS3 e CMV CS4 nelle posizioni del rack B, C, D o E dello strumento COBAS AmpliPrep. Per ulteriori informazioni, vedere la Tabella 1. Parte C. Caricamento dei materiali monouso Nota: Calcolare il numero necessario di cassette di reagenti COBAS AmpliPrep, unità SPU, provette per campioni iniziali (provette S), puntali K e provette K. Per ogni campione o controllo occorrono un'unità SPU, una provetta S, un puntale K e una provetta K. Per quanto riguarda l'utilizzo dello strumento COBAS AmpliPrep con l'analizzatore COBAS TaqMan o con l'analizzatore COBAS TaqMan 48, sono disponibili diversi flussi di lavoro. Vedere la Tabella 1 per riferimento. A seconda del flusso di lavoro usato, caricare il numero appropriato di rack per cassette di reagenti, rack per provette campione, rack per unità SPU, rack per puntali K, rack per provette K e K-carrier su rack per K-carrier nelle posizioni corrispondenti dello strumento COBAS AmpliPrep (per maggiori informazioni, vedere la Tabella 1). C1. Caricare le unità SPU nei rack per SPU e caricare i rack nelle posizioni J, K o L dello strumento COBAS AmpliPrep. C2. A seconda del flusso di lavoro usato, caricare i rack pieni di provette K nelle posizioni del rack M, N, O o P dello strumento COBAS AmpliPrep. C3. Caricare i rack pieni di puntali K nelle posizioni del rack M, N, O o P dello strumento COBAS AmpliPrep. C4. Per il flusso di lavoro 3 con l'analizzatore COBAS TaqMan 48, caricare i K-carrier sui rack per K-carrier nelle posizioni del rack M, N, O o P dello strumento COBAS AmpliPrep IT 14 Doc Rev. 4.0

15 Tabella 1 Possibili flussi di lavoro per l'uso dello strumento COBAS AmpliPrep con l'analizzatore COBAS TaqMan o con l'analizzatore COBAS TaqMan 48 Flusso di lavoro Modalità di trasferimento verso l'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 Rack, carrier e materiali di consumo Posizione sullo strumento COBAS AmpliPrep Provette K in rack contenenti provette K M P 1 Strumento COBAS AmpliPrep più Docking Station più analizzatore COBAS TaqMan Trasferimento automatico dei K-carrier Puntali K in rack contenenti puntali K Provette S contenenti campioni e controlli nei rack per campioni Unità SPU nei rack per SPU M P F H J L CS1 nel rack per cassette A CS2, CS3, CS4 nel rack per cassette B E Provette K in rack contenenti provette K M P Puntali K in rack contenenti puntali K M P 2 Strumento COBAS AmpliPrep più analizzatore COBAS TaqMan Trasferimento manuale delle provette K tramite i rack per campioni sull'analizzatore COBAS TaqMan Provette S contenenti campioni e controlli nei rack per campioni Unità SPU nei rack per SPU CS1 nel rack per cassette CS2, CS3, CS4 nel rack per cassette F H J L A B E Al termine del trattamento dei campioni: provette K nei rack per campioni (pronti per il trasferimento manuale) Come sopra (F H) Provette K nei rack per campioni F H Puntali K in rack contenenti puntali K M P Provette S contenenti campioni e controlli nei rack per campioni F - H 3 Strumento COBAS AmpliPrep più analizzatore/i COBAS TaqMan 48 Trasferimento manuale del K-carrier tramite i rack per K-carrier sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 Unità SPU nei rack per SPU CS1 nel rack per cassette CS2, CS3, CS4 nel rack per cassette J - L A B - E K-carrier vuoto, con codice a barre, nel rack per K-carrier M P Al termine del trattamento dei campioni: provette K nel K-carrier sul rack per K-carrier Come sopra (M P) IT 15 Doc Rev. 4.0

16 Parte D. Ordine e caricamento dei campioni Nota: se si utilizza lo strumento cobas p 630 per la preparazione dei campioni, consultare il Manuale Operatore dello strumento cobas p 630. D1. Preparare i rack per campioni nel modo seguente: applicare un clip con codice a barre in ogni posizione del rack per campioni nella quale verrà inserito un campione (provetta S). Applicare uno dei clip con codice a barre specifici per i controlli [CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C] in ogni posizione del rack per campioni nella quale verrà inserito un controllo (provetta S). Sui clip con codice a barre dei controlli dovrebbero essere stampati numeri di lotto identici a quelli stampati sulle fiale dei controlli contenute nel kit. Fare attenzione ad assegnare il controllo corretto alla posizione con il clip corrispondente. Inserire una provetta S in ogni posizione in cui è presente un clip con codice a barre. D2. Nel software AMPLILINK procedere alla creazione degli ordini per ogni campione e ogni controllo (finestra Orders, scheda Sample). Selezionare il file del test appropriato e completare l'operazione salvando. D3. Assegnare gli ordini per i campioni e i controlli alle posizioni del rack riservate ai campioni (finestra Orders, scheda Sample Rack). Il numero del rack per campioni deve corrispondere a quello del rack preparato al passaggio D1. D4. Stampare il report Sample Rack Order per utilizzarlo come foglio di lavoro. D5. Preparare i rack per i campioni e i controlli nell'area del laboratorio riservata a questo scopo. Agitare in vortex ogni campione e controllo [CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C] per 3-5 secondi. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli. D6. Trasferire 500 μl di ogni campione e controllo [CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C] nella provetta S appropriata, dotata di etichetta con codice a barre, utilizzando un micropipettatore con puntale dotato di barriera antiaerosol o a spostamento positivo privo di DNasi. Evitare di trasferire sostanze particellari e/o coaguli di fibrina dal campione originale nella provetta S. I campioni e i controlli devono essere trasferiti nelle posizioni delle provette loro assegnate e il tutto deve essere annotato nel foglio di lavoro descritto al passaggio D4. Sui clip con codice a barre dei controlli dovrebbero essere stampati numeri di lotto identici a quelli stampati sulle fiale dei controlli contenute nel kit. Fare attenzione ad assegnare il controllo corretto alla posizione nella quale è presente il clip con codice a barre appropriato. Evitare di contaminare la parte superiore delle provette S con campioni o controlli. D7. Per i flussi di lavoro 1 e 2, caricare i rack per campioni pieni di provette S nelle posizioni del rack F, G o H dello strumento COBAS AmpliPrep. D8. Per il flusso di lavoro 3 con l'analizzatore COBAS TaqMan 48, caricare i rack per campioni contenenti le provette S e le provette K (una per ogni provetta S, inserita nella posizione a destra delle provette S) nelle posizioni del rack F, G o H dello strumento COBAS AmpliPrep. Parte E. Avvio della seduta sullo strumento COBAS AmpliPrep E1. Avviare lo strumento COBAS AmpliPrep utilizzando il software AMPLILINK. Parte F. Fine della seduta COBAS AmpliPrep e trasferimento dei campioni sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 (solo per i flussi di lavoro 2 e 3) F1. Controllare se sono presenti avvisi (flag) o messaggi di errore. F2. Rimuovere i campioni e i controlli trattati dallo strumento COBAS AmpliPrep sui rack per campioni (nel caso dell'analizzatore COBAS TaqMan senza Docking Station) o sui rack per K-carrier (nel caso dell'analizzatore COBAS TaqMan 48), a seconda del flusso di lavoro usato (per maggiori dettagli, vedere la Parte G). F3. Rimuovere i rifiuti dallo strumento COBAS AmpliPrep. Nota: Al termine della preparazione dei campioni e dei controlli, non esporre alla luce i campioni e i controlli trattati. Amplificazione e rilevazione Configurazione dell'analizzatore COBAS TaqMan o dell'analizzatore COBAS TaqMan 48 È necessario avviare la seduta sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 entro 120 minuti dal termine della preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: Non congelare e non conservare a 2-8 C i campioni e i controlli trattati IT 16 Doc Rev. 4.0

17 Parte G. Caricamento dei campioni trattati G1. A seconda del flusso di lavoro usato, eseguire le procedure appropriate per trasferire le provette K sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48. Flusso di lavoro 1: Trasferimento automatizzato del K-carrier attraverso la docking station fino all'analizzatore COBAS TaqMan. Intervento manuale non richiesto. Flusso di lavoro 2: Trasferimento manuale delle provette K nei rack per campioni verso l'analizzatore COBAS TaqMan. Flusso di lavoro 3: Trasferimento manuale del K-carrier nei rack per K-carrier verso l'analizzatore COBAS TaqMan 48. Trasferimento manuale dei K-carrier all'interno dell'analizzatore COBAS TaqMan 48 attraverso il dispositivo di trasporto dei K-carrier. Parte H. Avvio della seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan o dell'analizzatore COBAS TaqMan 48 H1. Avviare l'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 scegliendo una delle opzioni descritte di seguito, a seconda del flusso di lavoro usato: Flusso di lavoro 1: Flusso di lavoro 2: Flusso di lavoro 3: Nessun intervento richiesto. Avvio automatico dell'analizzatore COBAS TaqMan dopo l'inserimento dei rack per campioni. Riempire il K-carrier con provette K vuote se ne contiene meno di 6. L'operazione è guidata dal software AMPLILINK. Aprire il coperchio del termociclatore, caricare il K-carrier nel termociclatore e chiudere il coperchio. Avviare la seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan 48. Parte I. Termine della seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan o dell'analizzatore COBAS TaqMan 48 I1. Al termine della seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan o COBAS TaqMan 48, è possibile stampare un report dei risultati. Controllare se nel report dei risultati sono presenti avvisi (flag) o messaggi di errore. I campioni con avvisi (flag) e commenti vengono interpretati nel modo descritto nella sezione "Risultati". Archiviare i dati dopo averli accettati. I2. Rimuovere le provette K usate dall'analizzatore COBAS TaqMan o dall'analizzatore COBAS TaqMan 48. RISULTATI L'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 determinano in modo automatico la concentrazione del DNA di CMV per i campioni e i controlli. La concentrazione del DNA di CMV è espressa in copie (cp)/ml. Il fattore di conversione tra copie/ml di DNA di CMV (in base alla definizione del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) e Unità Internazionali (UI)/ml è di 1,1 cp/ui [0,91 UI/cp] con riferimento al Primo Standard dell OMS per il citomegalovirus umano per le tecniche di amplificazione dell acido nucleico (NIBSC 09/162) 40. Questo fattore di conversione tra copie e UI potrebbe variare per altri test del DNA di CMV. Il software AMPLILINK: Determina il valore di soglia del ciclo (Ct) per il DNA di CMV e il DNA del QS di CMV. Determina la concentrazione del DNA di CMV in base ai valori Ct per il DNA di CMV e il DNA del QS di CMV e i coefficienti di calibrazione specifici per il lotto forniti sui codici a barre delle cassette. Determina se il valore espresso in cp/ml calcolato per i controlli CMV L(+)C e CMV H(+)C rientra negli intervalli fissati. Validazione del batch AMPLILINK versione serie 3.3 Controllare nella stampa o nella finestra dei risultati del software AMPLILINK se sono presenti avvisi (flag) o commenti sulla validità del batch. Nel caso di ordini che riguardano i controlli, viene effettuata una verifica per determinare se il valore di cp/ml del controllo rientra nell'intervallo fissato. Se il valore di cp/ml ottenuto dal controllo non rientra nell'intervallo specificato, viene generato un flag per segnalare il fallimento del controllo. Il batch è valido se non sono presenti flag per nessuno dei controlli [CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C]. Il batch non è valido se per i controlli CMV sono presenti uno o più flag tra i seguenti: IT 17 Doc Rev. 4.0

18 Controllo negativo Flag Risultato Interpretazione NC_INVALID Invalid Un risultato non valido o un risultato valido che non era negativo per il target CMV Controllo positivo basso CMV Flag Risultato Interpretazione LPCINVALID Invalid Un risultato non valido o un controllo al di fuori dell'intervallo Controllo positivo alto CMV Flag Risultato Interpretazione HPCINVALID Invalid Un risultato non valido o un controllo al di fuori dell'intervallo Se il batch non è valido ripetere l'intera procedura, incluse la preparazione, l'amplificazione e la rilevazione dei campioni e dei controlli. Interpretazione dei risultati Se il batch è valido, controllare se sono presenti flag o commenti sulla stampa dei risultati. Interpretare i risultati nel modo seguente: Un batch valido può includere risultati dei campioni sia validi che non validi, a seconda dei flag e/o dei commenti generati per i singoli campioni. I risultati dei campioni devono essere interpretati nel modo seguente: Copie/ml Unità Internazionali/ml Risultato del titolo Target Not Detected <1.50E+02 cp/ml 1.50E+02 cp/ml e 1.00E+07 cp/ml >1.00E+07 cp/ml <1.37E+02 IU/mL 1.37E+02 IU/mL e 9.10E+06 IU/mL >9.10E+06 IU/mL Interpretazione Classificare i risultati come "DNA di CMV non rilevato". I valori di cp/ml calcolati sono al di sotto del limite inferiore di quantificazione del test Classificare i risultati come "DNA di CMV rilevato, meno di 150 cp/ml di DNA di CMV". I risultati calcolati che sono maggiori o uguali a 150 cp/ml di DNA di CMV e minori o uguali a 1.00E+07 cp/ml di DNA di CMV rientrano nell'intervallo lineare del test. I valori di cp/ml calcolati sono al di sopra dell'intervallo del test. Classificare i risultati come "maggiori di 1,00E+07 cp/ml di DNA di CMV". Se si desidera ottenere risultati quantitativi, è necessario diluire il campione originale con plasma umano negativo al virus CMV conservato in EDTA, quindi ripetere il test. Moltiplicare il risultato ottenuto per il fattore di diluizione. I valori di UI/ml calcolati sono al di sotto del limite inferiore di quantificazione del test Classificare i risultati come "DNA di CMV rilevato, meno di 137 UI/ml di DNA di CMV". I risultati calcolati che sono maggiori o uguali a 137 UI/ml di DNA di CMV e minori o uguali a 9.10E+06 UI/ml di DNA di CMV rientrano nell'intervallo lineare del test. I valori di UI/ml calcolati sono al di sopra dell'intervallo del test. Classificare i risultati come "maggiori di 9,10E+06 UI/ml di DNA di CMV". Se si desidera ottenere risultati quantitativi, è necessario diluire il campione originale con plasma umano negativo al virus CMV conservato in EDTA, quindi ripetere il test. Moltiplicare il risultato ottenuto per il fattore di diluizione. Nota: Nota: Nota: i campioni con valori al di sopra dell'intervallo del test che generano un risultato non valido con il flag "QS_INVALID" non devono essere classificati né come >9,10E+06 UI/ml, né come >1,00E+07 cp/ml. È necessario diluire il campione originale con plasma umano negativo al virus CMV conservato in EDTA, quindi ripetere il test. Moltiplicare il risultato ottenuto per il fattore di diluizione. risultato del titolo "Failed". Interpretazione: il campione non è stato trattato in modo corretto. risultato del titolo "Invalid". Interpretazione: il risultato non è valido IT 18 Doc Rev. 4.0

19 CONTROLLO DI QUALITÀ In ogni batch di test è necessario includere uno ciascuno dei seguenti controlli COBAS TaqMan : un controllo negativo, un controllo positivo basso CMV e un controllo positivo alto CMV. Il batch è valido se non sono presenti flag per nessuno dei controlli [CMV ( ) C, CMV L(+)C e CMV H(+)C]. Assicurarsi che il batch sia valido verificando se nella stampa della seduta sono presenti flag e commenti. Controllo negativo Il controllo CMV ( ) C deve generare un risultato "Target Not Detected". Se il controllo CMV ( ) C ha un flag "Invalid", l'intero batch non è valido. Ripetere l'intera procedura, incluse la preparazione, l'amplificazione e la rilevazione dei campioni e dei controlli. Se il controllo CMV ( ) C genera risultati che sono costantemente non validi in più batch, richiedere assistenza tecnica all'ufficio Roche locale. Controlli positivi Gli intervalli dei titoli accettabili per i controlli CMV L(+)C e CMV H(+)C sono riportati nei codici a barre delle cassette dei reagenti del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Per quanto riguarda i controlli CMV L(+)C e CMV H(+)C, i titoli del DNA di CMV espressi in cp/ml devono rientrare negli intervalli accettabili. Se uno o entrambi i controlli positivi generano un flag non valido, l'intero batch non è valido. Ripetere l'intera procedura, incluse la preparazione, l'amplificazione e la rilevazione dei campioni e dei controlli. Se il titolo del DNA di CMV relativo a uno o entrambi i controlli positivi genera risultati che sono costantemente al di fuori degli intervalli accettabili in più batch, richiedere assistenza tecnica all'ufficio Roche locale. PRECAUZIONI PROCEDURALI Com'è auspicabile per qualsiasi procedura di analisi, per lo svolgimento di questo test è necessario attenersi alla buona prassi di laboratorio. LIMITI DELLA PROCEDURA 1. Questo test è stato validato per l'uso esclusivamente con plasma umano raccolto in anticoagulante EDTA. L'uso di altri tipi di campioni per lo svolgimento del test può generare risultati non accurati. 2. L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure di prelievo, trasporto, conservazione e trattamento dei campioni. 3. La presenza dell'enzima AmpErase nel reagente Master Mix del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV riduce il rischio di contaminazione dell'amplicone. La contaminazione con i controlli e i campioni clinici positivi al virus CMV può tuttavia essere evitata soltanto seguendo la buona prassi di laboratorio e rispettando rigorosamente le procedure descritte in questo foglio illustrativo. 4. Questo prodotto deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato nelle tecniche PCR. 5. Questo prodotto può essere utilizzato esclusivamente con lo strumento COBAS AmpliPrep e con gli analizzatori COBAS TaqMan e COBAS TaqMan Anche se rare, le mutazioni nell'ambito delle regioni altamente conservate del genoma virale coperte dai primer e/o dalle sonde del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV potrebbero determinare una quantificazione per difetto del virus o la mancata rilevazione dello stesso. 7. L'identificazione del DNA di CMV dipende dal numero di particelle virali presenti nel campione e può essere influenzata dal metodo di prelievo del campione e da fattori legati al paziente (ad esempio età, presenza di sintomi e/o stadio dell'infezione). 8. A causa delle differenze intrinseche tra le tecnologie, prima di passare da una tecnologia a un'altra è consigliabile svolgere studi correlazionali nel proprio laboratorio al fine di quantificare tali differenze tra le tecnologie. 9. Non sono state definite le soglie di decisione clinica relativamente ai valori del carico virale in Unità Internazionali/ml (UI/ml). Si consiglia agli specialisti di utilizzare il fattore di conversione appropriato da UI/ml a copie/ml (cp/ml) prima di assumere decisioni cliniche basate sui risultati espressi in UI/ml IT 19 Doc Rev. 4.0

20 SOSTANZE INTERFERENTI È dimostrato che la presenza nei campioni di livelli elevati di trigliceridi (fino a 3300 mg/dl), bilirubina coniugata (fino a 20 mg/dl), bilirubina non coniugata (fino a 20 mg/dl). emoglobina (fino a 200 mg/dl) e DNA umano (fino a 0,4 mg/dl) e di malattie autoimmuni o relativi marcatori, ad esempio il Lupus Eritematoso Sistemico (LES), l'artrite Reumatoide (AR) e gli Anticorpi Antinucleari (ANA), non interferiscono con la quantificazione del DNA di CMV, né influenzano la specificità del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. La valutazione è stata svolta seguendo le Linee Guida EP7-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 41 utilizzando un lotto di reagenti del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. È dimostrato che i composti farmaceutici elencati di seguito, analizzati con un valore 3 volte superiore al livello plasmatico di picco (Cmax) non interferiscono con la quantificazione del DNA di CMV, né influenzano la specificità del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Immunosoppressori Azatioprina Ciclosporina Micofenolato mofetile Micofenolato sodico Sirolimus Tacrolimus Everolimus Prednisone Antivirali (anti-cmv) Ganciclovir Valganciclovir Cidofovir Foscarnet Antibiotici Sulfametossazole Trimetoprima Cefotetan Piperacillina Tazobactam sodico Clavulanato di potassio Ticarcillina disodica Vancomicina Antimicotici Fluconazolo VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI NON CLINICHE A. Tracciabilità al Primo Standard Internazionale dell'oms per il Citomegalovirus Umano Durante lo sviluppo di questo test sono stati utilizzati molteplici standard e controlli per assicurare la tracciabilità allo standard dell'oms [il Primo Standard Internazionale dell'oms per il Citomegalovirus Umano per le tecniche di amplificazione dell acido nucleico (NIBSC 09/162)]. 40 Gli standard utilizzati durante lo sviluppo del test includono lo standard di CMV dell'oms, lo standard secondario di CMV di RMS, il materiale di origine dello standard secondario di CMV di RMS e il pannello di calibrazione di CMV di RMS (Lambda CMA1.2). Gli standard, il pannello di calibrazione e un campione clinico di CMV indipendente sono stati analizzati a livelli analoghi. Per quanto riguarda lo standard di CMV dell'oms è stato analizzato un intervallo di concentrazione compreso tra 5,00E+02 UI/ml e 5,00E+05 UI/ml (2,70 5,70 log 10 UI/ml); per quanto riguarda il materiale di origine dello standard secondario di CMV di RMS è stato analizzato un intervallo compreso tra 5,00E+02 UI/ml e 1,00E+07 UI/ml (2,70 7,00 log 10 UI/ml); per quanto riguarda il pannello di calibrazione di CMV di RMS è stato analizzato un intervallo compreso tra 5,23E+02 e 9,30E+06 UI/ml (2,72 6,97 log 10 UI/ml); per quanto riguarda il campione clinico indipendente di CMV è stato analizzato un intervallo compreso tra 5,00E+02 UI/ml e UI/ml (2,70 4,36 log 10 UI/ml). Tutto il materiale analizzato si è comportato in modo simile, dimostrando prestazioni di diluizione co-lineari lungo tutto l'intervallo lineare del test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV (CAP/CTM CMV) (Figura 6) IT 20 Doc Rev. 4.0