COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, version 2.0

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1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, version 2.0 PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0 HI2QCAP 48 Tests P/N: COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent PG WR 5.1 Liters P/N: COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Pre-Extraction Reagent SPEX 5 x 78 ml P/N: USO PREVISTO Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 versione 2.0 è un test diagnostico in vitro per l'amplificazione dell'acido nucleico totale. Il test è destinato alla rilevazione qualitativa del DNA e dell'rna (o acido nucleico totale, TNA) del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) in campioni di plasma umano o macchie di sangue secco utilizzando lo strumento COBAS AmpliPrep per la preparazione automatizzata dei campioni e l'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 per l'amplificazione e la rilevazione automatizzate. Si tratta di un test diagnostico indicato per i soggetti con sospetta infezione attiva da HIV-1. La rilevazione del TNA di HIV-1 è indicativa di un'infezione attiva da HIV. Nei neonati di madri infette con HIV-1 potrebbero essere presenti gli anticorpi materni anti- HIV-1; la presenza dell'acido nucleico di HIV-1 nel neonato indica un'infezione attiva da HIV-1. Negli adulti è possibile utilizzare il test a sostegno della diagnosi di infezione da HIV-1. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST Il virus dell'immunodeficienza umana (Human Immunodeficiency Virus, HIV) è l'agente eziologico della sindrome da immunodeficienza acquisita (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) 1-3. L'infezione da HIV può essere trasmessa attraverso un contatto sessuale, l'esposizione a sangue o emoderivati infetti o dalla madre sieropositiva al feto 4. Entro tre-sei settimane dal contatto con il virus HIV, i soggetti contagiati manifestano in genere una breve sindrome acuta, caratterizzata da sintomi pseudoinfluenzali e associata a livelli elevati di viremia 5-8. Nella maggior parte dei soggetti contagiati si assiste a questo punto ad una risposta immunitaria HIV-specifica e ad un calo della viremia nel plasma, generalmente entro quattro-sei settimane dall'insorgere dei sintomi 9,10. Dopo la sieroconversione, i soggetti contagiati entrano in una fase asintomatica, clinicamente stabile, che può protrarsi anche per anni Il periodo asintomatico è caratterizzato da una persistente viremia plasmatica di basso livello 14 e da una graduale deplezione dei linfociti T CD4 +, che possono determinare grave immunodeficienza, infezioni opportunistiche multiple, forme di neoplasie maligne e decesso 15. Sebbene le concentrazioni virali nel sangue periferico siano relativamente basse durante la fase asintomatica dell'infezione, la replica e la clearance virali sembrano essere processi dinamici, in cui l'elevata velocità di riproduzione virale e di infezione dei linfociti CD4 + è controbilanciata dall'altrettanto elevata velocità di clearance virale, morte dei linfociti infetti e rigenerazione di nuovi linfociti CD4 +, con la conseguenza che i livelli di viremia plasmatica e di linfociti CD4 + si mantengono relativamente stabili I test di amplificazione dell'acido nucleico possono diagnosticare l'infezione da HIV nei primi 18 mesi di vita del neonato, quando il sangue contiene ancora gli anticorpi materni che complicano l'interpretazione dei test sierologici. 42 I test di rilevazione dell'rna di HIV nel plasma e nelle macchie di sangue secco possono fornire la prova di un'infezione in atto, attraverso l'uso di tecnologie di amplificazione dell'acido nucleico come la reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR) Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 (CAP/CTM HIV-1 Qual Test, v2) utilizza la tecnologia PCR per ottenere la massima sensibilità nella rilevazione qualitativa dell'rna di HIV-1 nel plasma con anticoagulante EDTA e nelle macchie di sangue intero secco. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è un test diagnostico in vitro per l'amplificazione dell'acido nucleico totale, destinato alla rilevazione qualitativa del DNA e dell'rna di HIV-1 in plasma umano con EDTA o in macchie di sangue secco in combinazione con il reagente di pre-estrazione dei campioni COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (SPEX). Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è basato su tre processi principali: (1) preparazione dei campioni per isolare gli acidi nucleici dell'hiv-1; (2) trascrizione inversa dell'rna target per generare un DNA complementare (cdna) e; (3) amplificazione mediante PCR del DNA e del cdna target, con simultanea rilevazione delle sonde di rilevazione oligonucleotidiche segmentate a doppia marcatura, specifiche per il target e per il controllo interno. Il flusso di lavoro automatizzato prevede l'uso dello strumento COBAS AmpliPrep con l'analizzatore COBAS TaqMan o con l'analizzatore COBAS TaqMan 48. Per i campioni di macchie di sangue secco (dried blood spots, DBS) è necessario un passaggio di pre-estrazione manuale. La sezione Revisione del documento è disponibile in calce al documento IT 1 Doc Rev. 1.0

2 Selezione del target La selezione della sequenza target dell RNA di HIV-1 dipende dall'identificazione, nell'ambito del genoma dell'hiv-1, delle regioni che evidenziano la massima conservazione della sequenza tra i campioni rappresentativi dell'hiv-1 gruppo O e dei vari sottotipi dell'hiv-1 gruppo M. Per far fronte in maniera adeguata all'elevata variabilità genetica del virus, il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 seleziona come target due regioni del genoma dell'hiv e le sottopone simultaneamente ad amplificazione e rilevazione. Le due sonde oligonucleotidiche a doppia marcatura sono una specifica del target e una specifica del controllo interno, pertanto consentono di identificare in modo indipendente l'amplicone HIV-1 e l'amplicone del controllo interno (HIV-1 IC). Per questa ragione, è fondamentale che i primer e le sonde oligonucleotidiche a doppia marcatura siano selezionati in modo corretto affinché il test possa amplificare e rilevare l'hiv-1 gruppo O e i sottotipi dell'hiv-1 gruppo M. Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 utilizza la trascrizione inversa e i primer di amplificazione della PCR che definiscono le sequenze nell'ambito delle regioni altamente conservate del gene gag dell'hiv-1 32 e della regione LTR dell'hiv-1. Preparazione dei campioni Procedura pre-analitica per i campioni DBS I campioni DBS vengono preparati spruzzando 70 μl di sangue intero umano su una carta da filtro e lasciando essiccare la macchia di sangue. Prima di preparare l'acido nucleico per l'amplificazione e la rilevazione, i campioni vengono estratti dal filtro di carta. L'estrazione avviene manualmente: si stacca un cerchio dal filtro di carta macchiato di sangue secco e lo si inserisce in una provetta campione COBAS AmpliPrep, quindi si aggiunge il reagente COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan SPEX e si avvia l'incubazione a una temperatura elevata con miscelazione. A questo punto i campioni sono pronti per la preparazione automatizzata sullo strumento COBAS AmpliPrep. Per il flusso di lavoro dettagliato, vedere la sezione ISTRUZIONI PER L'USO. Preparazione automatizzata dei campioni Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 si basa sulla preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS AmpliPrep mediante una tecnica di cattura generica basata sulla silice. Le cellule e le particelle del virus vengono lisate tramite incubazione a una temperatura elevata con una soluzione tampone di lisi/legame caotropico, che rilascia gli acidi nucleici e protegge il DNA e l'rna rilasciati dalle nucleasi nel campione. In ogni provetta campione vengono introdotte le biglie magnetiche, insieme al reagente di lisi e a una quantità nota di HIV-1 IC (controllo interno, molecole di Armored RNA). Successivamente la miscela viene messa in incubazione e gli acidi nucleici rilasciati dal campione e dall'rna del controllo interno (HIV-1 IC) si legano alla superficie delle biglie magnetiche. Le sostanze che non formano legami, ad esempio i sali, le proteine e le altre impurità cellulari, vengono eliminate attraverso il lavaggio delle biglie magnetiche. Dopo avere separato le biglie magnetiche e completato le fasi di lavaggio, gli acidi nucleici adsorbiti vengono eluiti a una temperatura elevata con una soluzione acquosa. Il campione trattato, che contiene le biglie magnetiche e gli acidi nuclei rilasciati da HIV-1 e RNA di HIV-1 IC, viene aggiunto dallo strumento COBAS AmpliPrep alla miscela di amplificazione, quindi viene trasferito sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48. Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR La reazione di trascrizione inversa e di amplificazione mediante PCR viene eseguita con l'enzima ricombinante termostabile Thermus specie Z05 (DNA polimerasi Z05). In presenza di manganese (Mn 2+ ) e in condizioni tampone adeguate, l'enzima Z05 presenta attività sia di trascrittasi inversa, sia di DNA polimerasi 30,31. Ciò consente il verificarsi della trascrizione inversa e dell'amplificazione mediante PCR simultaneamente alla rilevazione in tempo reale dell'amplicone. I campioni trattati vengono aggiunti alla miscela di amplificazione nelle provette cinetiche (provette K), dove avvengono sia la trascrizione inversa che l'amplificazione mediante PCR. La miscela di reazione viene riscaldata per consentire ai primer a valle (downstream) di appaiarsi in modo specifico ai target (RNA di HIV-1 e RNA di HIV-1 IC). In presenza di Mn 2+ e di un eccesso di deossinucleotidi trifosfati (dntp), comprendenti trifosfati di deossiadenosina, deossiguanosina, deossicitidina, deossiuridina e deossitimidina, la polimerasi Z05 estende i primer appaiati formando filamenti di DNA complementari all'rna target. Amplificazione del target I campioni trattati vengono aggiunti alla miscela di amplificazione nelle provette cinetiche (provette K), dove avviene l'amplificazione mediante PCR. Dopo la trascrizione inversa dell'rna target dell'hiv-1 e dell'rna dell'hiv-1 IC, il termociclatore nell'analizzatore COBAS TaqMan o nell'analizzatore COBAS TaqMan 48 riscalda la miscela di reazione per denaturare gli ibridi RNA:cDNA e per esporre le specifiche sequenze target dei primer. A mano a mano che la miscela si raffredda, i primer si appaiano al DNA target. In presenza di Mn 2+ e di un eccesso di deossinucleotidi trifosfati (dntp), comprendenti trifosfati di deossiadenosina, deossiguanosina, deossicitidina, deossiuridina e deossitimidina, l'enzima Z05 estende i primer appaiati lungo lo stampo target per produrre molecole di DNA a doppio filamento denominate "ampliconi". Gli analizzatori TaqMan e COBAS TaqMan 48 ripetono automaticamente questo processo per un determinato numero di cicli, raddoppiando la quantità di DNA amplicone ad ogni ciclo. Il numero di cicli deve essere preimpostato sugli analizzatori COBAS TaqMan e COBAS TaqMan 48. L'amplificazione interessa esclusivamente le due regioni del genoma dell'hiv-1 delimitate dai primer (non viene amplificato l'intero genoma dell'hiv-1) IT 2 Doc Rev. 1.0

3 Amplificazione selettiva Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 esegue l'amplificazione selettiva dell'acido nucleico target dal campione mediante l'uso dell'enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) e del trifosfato di deossiuridina (dutp). L'enzima AmpErase riconosce e catalizza la reazione di distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina 33 ma non del DNA contenente deossitimidina. La deossiuridina non è presente nel DNA naturale, ma è sempre presente nell'amplicone perché il trifosfato di deossiuridina è uno dei dntp utilizzati nel reagente Master Mix e, di conseguenza, soltanto l'amplicone contiene deossiuridina. La deossiuridina rende l'amplicone contaminante suscettibile alla distruzione da parte dell'enzima AmpErase prima dell'amplificazione del DNA target. Inoltre qualsiasi prodotto non specifico che si sia formato dopo l'attivazione iniziale del reagente Master Mix ad opera del manganese viene distrutto dall'enzima AmpErase. L'enzima AmpErase, che è contenuto nel reagente Master Mix, catalizza la scissione del DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosio nella posizione C1. In occasione del riscaldamento nella prima fase del ciclo termico, la catena di DNA dell'amplicone si spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo così il DNA non amplificabile. L'enzima AmpErase rimane inattivo per un periodo di tempo prolungato dopo essere stato esposto a temperature superiori a 55 C (quindi per tutte le fasi del ciclo termico) e pertanto non distrugge l'amplicone target che si è formato durante l'amplificazione. Rilevazione dei prodotti della PCR in un test COBAS TaqMan Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 si basa sulla tecnologia Real-time PCR 34,35. L'uso di sonde fluorescenti a doppia marcatura consente di rilevare in tempo reale i prodotti della PCR accumulati, monitorando l'intensità di emissione dei fluorocromi reporter che vengono liberati durante il processo di amplificazione. Le sonde oligonucleotidiche specifiche per l'hiv-1 e per l'hiv-1 IC sono costituite da un fluorocromo reporter e da un fluorocromo quencher. Nel test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0, le sonde HIV-1 e HIV-1 IC sono marcate con fluorocromi reporter differenti. Quando le sonde sono integre, la fluorescenza del fluorocromo reporter viene soppressa dalla vicinanza del fluorocromo quencher per effetto del trasferimento di energia di tipo Förster. Durante la PCR, la sonda ibridizza con una sequenza target e viene scissa dall'attività nucleasica 5' 3' della DNA polimerasi Z05 termostabile. Non appena i fluorocromi reporter e quencher vengono liberati e si separano, l'attività di soppressione (quenching) cessa, mentre la fluorescenza del fluorocromo reporter si intensifica. L'amplificazione dell'rna di HIV-1 e dell'rna di HIV-1 IC viene misurata separatamente, a lunghezze d'onda diverse. Questo processo viene ripetuto per un determinato numero di cicli; ad ogni ciclo l'intensità di emissione dei singoli fluorocromi reporter aumenta, consentendo l'identificazione indipendente dell'rna di HIV-1 e dell'rna di HIV-1 IC. Il ciclo della PCR in cui una curva di crescita inizia una crescita esponenziale è correlato alla quantità di materiale di partenza all'inizio della PCR. REAGENTI COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0 (P/N: ) HIV-1 QL v2.0 CS1 (Cassetta di reagente con biglie magnetiche HIV-1) Biglie magnetiche 93% Isopropanolo HI2QCAP 48 test 1 x 48 test 93% (p/p) Isopropanolo H225, H319, H336 HIV-1 QL v2.0 CS2 (Cassetta di reagente di lisi HIV-1) Citrato di sodio diidrato 42,5% Guanidina tiocianato < 14% Polidocanolo 0,9% Ditiotreitolo 1 x 48 test 42,5% (p/p) Guanidina tiocianato H302, H315, H318, H IT 3 Doc Rev. 1.0

4 HIV-1 QL v2.0 CS3 Cassetta multireagente HIV-1 contenente: Pase (Soluzione proteinasi) Tampone Tris < 0,05% EDTA Cloruro di calcio Acetato di calcio < 7,8% Proteinasi Glicerolo 1 x 48 test 1 x 3,8 ml < 7,8% (p/p) Proteinasi H318, H334 EB (Tampone di eluizione) Tampone Tris base 0,2% Metilparabene HIV-1 QL v2.0 CS4 Cassetta di reagente specifico per test HIV-1, contenente: HIV-1 IC (Controllo Interno HIV-1) Tampone Tris-HCl EDTA < 0,005% Poli ra RNA (di sintesi) < 0,001% Costrutto di Armored RNA di HIV-1 contenente sequenze di legame per primer HIV-1 e una regione univoca di legame alla sonda (RNA non infettivo in batteriofago MS2) 0,05% Azoturo di sodio HIV-1 MMX (Master Mix HIV-1) Tampone tricina Acetato di potassio Idrossido di potassio 20% Dimetilsolfossido Glicerolo < 0,04% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,003% Primer a monte e a valle del gene gag e della regione LTR dell'hiv-1 < 0,003% Aptamero oligonucleotidico < 0,003% Sonde oligonucleotidiche fluorescenti specifiche per HIV-1 e per HIV-1 IC < 0,05% DNA Polimerasi Z05 (batterica) < 0,1% Enzima AmpErase (uracil-n-glicosilasi) (batterico) 0,09% Azoturo di sodio CAP/CTM Mn 2+ (Soluzione di manganese CAP/CTM) < 0,5% Acetato di manganese Acido acetico glaciale 0,09% Azoturo di sodio HIV-1 (+)C, v2.0 (Controllo positivo HIV-1, v2.0) < 0,001% Costrutto di Armored RNA di HIV-1 contenente sequenze di HIV-1 (RNA non infettivo in batteriofago MS2) Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la determinazione di anticorpi anti-hcv, anticorpi anti-hiv-1/2, antigene p24 di HIV e HBsAg; RNA di HIV-1, RNA di HCV e DNA di HBV non rilevabili con le metodiche PCR 0,1% Conservante ProClin x 7,0 ml 1 x 48 test 1 x 3,6 ml 1 x 2,5 ml 1 x 19,8 ml 4 x 1,0 ml Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone IT 4 Doc Rev. 1.0

5 CTM ( ) C [Controllo negativo COBAS TaqMan (plasma umano)] Plasma umano negativo, definito non reattivo in base ai test per la determinazione di anticorpi anti-hcv, anticorpi anti-hiv-1/2, antigene p24 di HIV e HBsAg; RNA di HIV-1, RNA di HCV e DNA di HBV non rilevabili con le metodiche PCR 0,1% Conservante ProClin x 1,0 ml Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone HIV-1 (+)C, v2.0 Clip (Clip con codice a barre, controllo positivo HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Clip con codice a barre, controllo negativo HIV-1, v2.0) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR (Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Citrato di sodio diidrato < 0,1% N-Metilisotiazolone-HCI COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Pre-Extraction Reagent Reagente di pre-estrazione dei campioni COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) SPEX (Reagente di pre-estrazione dei campioni COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) 4 M GuSCN 30 mm Na-Citrato 4% Polidocanolo 2% DTT PG WR SPEX 1 x 4 clip 1 x 4 clip 1 x 5,1 l 5 x 78 ml 42,5% (p/p) Guanidina tiocianato H302, H318, H412 AVVERTENZE E PRECAUZIONI A. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. B. Questo test non è destinato all'uso per lo screening dei donatori di sangue o di plasma. C. Questo test è destinato all'uso con plasma umano e macchie di sangue secco, preparate con sangue intero raccolto con l'anticoagulante EDTA. D. Non pipettare con la bocca. E. Non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti monouso protettivi, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi. Dopo avere manipolato i campioni e i reagenti del test, lavarsi accuratamente le mani. F. Evitare la contaminazione dei reagenti con microbi e ribonucleasi durante l'estrazione delle aliquote dai flaconi dei controlli. G. È consigliato l'uso di pipette sterili e di puntali di pipettamento monouso e privi di ribonucleasi. H. Non combinare controlli di lotti diversi o di flaconi diversi dello stesso lotto IT 5 Doc Rev. 1.0

6 I. Non mescolare cassette di reagenti o controlli appartenenti a kit diversi. J. Non aprire le cassette COBAS AmpliPrep e non scambiare, mescolare, rimuovere o aggiungere flaconi. K. Smaltire i reagenti inutilizzati, i rifiuti e i campioni nel rispetto dei regolamenti locali, regionali e nazionali. L. Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza indicata. M. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale. N. I campioni e i controlli devono essere manipolati come se fossero infettivi, adottando le procedure di sicurezza del laboratorio delineate in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 e nel documento CLSI M29-A3 38. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca, preparata con ipoclorito di sodio allo 0,5% e acqua deionizzata o distillata. Nota: la candeggina liquida per uso domestico che si trova in commercio contiene in genere ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 5,25%. La diluizione 1:10 della candeggina per uso domestico consente di ottenere una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%. O. ATTENZIONE: I controlli CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0 contengono plasma umano derivato da sangue umano. Il materiale di origine è stato analizzato ed è risultato non reattivo alla presenza dell'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg), degli anticorpi anti-hiv-1/2 e anti-hcv e dell'antigene p24 dell'hiv. I test eseguiti sul plasma umano negativo con le tecniche PCR non hanno evidenziato la presenza di RNA di HIV-1, RNA di 'HCV e DNA di HBV rilevabili. Nessun metodo di analisi attualmente disponibile è in grado di garantire con certezza assoluta che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Di conseguenza, tutti i materiali di origine umana devono essere considerati potenzialmente infettivi. I controlli CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0 devono essere manipolati come se fossero infettivi, adottando le procedure di sicurezza del laboratorio delineate in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 e nel documento CLSI M29-A3 38. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca, preparata con ipoclorito di sodio allo 0,5% e acqua deionizzata o distillata. P. I reagenti HIV-1 IC, CAP/CTM Mn 2+ e HIV-1 MMX contengono azoturo di sodio. L'azoturo di sodio può reagire con le tubature di piombo e rame formando azoturi metallici altamente esplosivi. Quando le soluzioni contenenti azoturo di sodio vengono smaltite nei lavelli del laboratorio, è necessario sciacquare gli scarichi con abbondanti quantità d'acqua per impedire l'accumulo di azoturi. Q. Indossare protezioni per gli occhi, camici da laboratorio e guanti monouso durante la manipolazione di qualsiasi reagente. Evitare il contatto di questi materiali con la pelle, gli occhi o le membrane mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua. Intervenire tempestivamente per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita di questi reagenti, diluire con acqua prima di asciugare. R. Evitare che il reagente HIV-1 QL v2.0 CS2 e i rifiuti liquidi dello strumento COBAS AmpliPrep, che contengono guanidina tiocianato, entrino in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). Queste miscele possono produrre un gas altamente tossico. S. Durante lo smaltimento delle unità SPU usate (che contengono guanidina tiocianato) dallo strumento COBAS AmpliPrep, evitare qualsiasi contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). Queste miscele possono produrre un gas altamente tossico. REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE A. Non congelare i reagenti e i controlli. B. Conservare i reagenti HIV-1 QL v2.0 CS1, HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1 QL v2.0 CS4 a 2-8 C. Se inutilizzati, questi reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, questi reagenti sono stabili per 28 giorni a 2-8 C o fino alla data di scadenza indicata, se precedente. I reagenti HIV-1 QL v2.0 CS1, HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1 QL v2.0 CS4 possono essere utilizzati per un massimo di 4 cicli dello strumento e complessivamente non devono superare le 64 ore di permanenza sullo strumento COBAS AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8 C tra un ciclo dello strumento e il successivo. C. Conservare i controlli HIV-1 (+)C, v2.0 e CTM ( ) C a 2-8 C. I controlli sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, scartare le eventuali parti inutilizzate. D. Conservare le clip con il codice a barre [HIV-1 (+)C, v2.0 Clip e HIV-1 ( ) C Clip] a 2-30 C. E. Conservare il reagente PG WR a 2-30 C. Il reagente PG WR è stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente è stabile per 28 giorni a 2-30 C o fino alla data di scadenza, se precedente IT 6 Doc Rev. 1.0

7 MATERIALE FORNITO COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0 (P/N: ) HI2QCAP HIV-1 QL v2.0 CS1 (Cassetta reagente con biglie magnetiche HIV-1) HIV-1 QL v2.0 CS2 (Cassetta reagente di lisi HIV-1) HIV-1 QL v2.0 CS3 (Cassetta multireagente HIV-1) HIV-1 QL v2.0 CS4 (Cassetta reagente specifico per test HIV-1) HIV-1 (+)C, v2.0 (Controllo positivo HIV-1, v2.0) CTM ( ) C [Controllo negativo COBAS TaqMan (plasma umano)] HIV-1 (+)C, v2.0 Clip (Clip con codice a barre per controllo positivo HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Clip con codice a barre per controllo negativo HIV-1, v2.0) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) PG WR PG WR (Reagente di lavaggio COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Pre-Extraction Reagent Reagente di pre-estrazione campioni COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: ) SPEX MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO Strumentazione e software Strumento COBAS AmpliPrep Analizzatore COBAS TaqMan o analizzatore COBAS TaqMan 48 Opzionale: Docking Station Software AMPLILINK, versione serie 3.3 Stazione dati del software AMPLILINK, con stampante Manuali del software AMPLILINK versione serie 3.3: Manuale dello strumento - Strumento COBAS AmpliPrep per l'uso con l'analizzatore COBAS TaqMan, l'analizzatore COBAS TaqMan 48 e il software AMPLILINK versione serie 3.3 Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS TaqMan (più Docking Station opzionale) per l'uso con il Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.3 Manuale dello strumento - Analizzatore COBAS TaqMan 48 per l'uso con il Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie IT 7 Doc Rev. 1.0

8 oppure Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.3 per l'uso con lo strumento COBAS AmpliPrep, l'analizzatore COBAS TaqMan e l'analizzatore COBAS TaqMan 48 File delle definizioni del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 versione 2.0; vedere la scheda informativa del prodotto (product information card, PIC) fornita con il kit per conoscere il nome e la versione TDF appropriata Materiale di consumo Unità di trattamento dei campioni (SPU) Provette per campioni iniziali (provette S) e clip con codice a barre Rack per puntali K Confezione di provette K da 12 x 96 ALTRO MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO Rack per campioni (rack SK 24) Rack per reagenti Rack per SPU Capper per provette K, motorizzato Capper per provette K K-carrier Dispositivo di trasporto dei K-carrier Rack per K-carrier Pipettatori con puntali muniti di barriera antiaerosol o a spostamento positivo, privi di RNasi (da 1000 μl)* Guanti monouso, senza talco Miscelatore Vortex Termomiscelatore Eppendorf Thermomixer comfort (solo per applicazioni DBS) Sacchetti essicanti (per la conservazione dei campioni DBS) IsoRack (codice prodotto Eppendorf ): Rack a 24 posizioni sul termomiscelatore Eppendorf Thermomixer comfort (solo per applicazioni DBS) Carte da filtro Whatman 903 o carte di raccolta campioni Munktell TFN Brand 5 o equivalenti (solo per applicazioni DBS) * L'accuratezza dei pipettatori deve rientrare nel 3% del volume dichiarato. Laddove specificato, è necessario utilizzare puntali dotati di barriera antiaerosol o a spostamento positivo privi di RNasi, in modo da prevenire la contaminazione crociata del campione e dell'amplicone IT 8 Doc Rev. 1.0

9 PRELIEVO, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Nota: manipolare tutti i campioni e i controlli come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Nota: questo test è stato validato per l'uso esclusivamente con plasma umano raccolto con l'anticoagulante EDTA e con sangue umano intero raccolto su macchie di sangue secco. L'uso di altri tipi di campioni per lo svolgimento del test può generare risultati non accurati. A. Prelievo dei campioni Plasma in EDTA Il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è destinato all'uso con campioni di plasma. Il sangue deve essere raccolto in apposite provette sterili con l'anticoagulante EDTA (tappo viola) e deve essere miscelato in misura sufficiente (fare riferimento alle istruzioni del produttore delle provette). Conservare il sangue intero a 2-25 C per non più di 24 ore. Separare il plasma dal sangue intero entro 24 ore dal prelievo, tramite centrifugazione a x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il plasma in una provetta sterile in polipropilene. Macchie di sangue secco Prelevare il campione dalla macchia di sangue secco (dried blood spot, DBS) seguendo le procedure cliniche appropriate. Si raccomanda di applicare almeno 70 μl di sangue capillare all'interno di ogni cerchio delineato sulla carta filtro Whatman 903 o sulla carta di raccolta campioni Munktell TFN Brand 5 o equivalente. Utilizzare la carta filtro verificando che ENTRAMBI i lati della carta siano saturati oltre il cerchio delineato Lasciare asciugare i campioni DBS a temperatura ambente (18-25 C) per almeno 3 ore, proteggendo la carta DBS dalla luce diretta del sole. Per maggiori dettagli, consultare il foglio illustrativo delle carte filtro utilizzate. Si consiglia di preparare 3 dischi di carta per ogni campione del paziente. B. Trasporto dei campioni Il trasporto del sangue intero o del plasma deve avvenire in conformità ai regolamenti per il trasporto degli agenti eziologici che sono in vigore a livello locale, regionale e nazionale 39. Il sangue intero deve essere trasportato a 2-25 C e centrifugato entro 24 ore dal prelievo. Il plasma può essere trasportato a 2-8 C oppure congelato tra 20 C e 80 C. C. Conservazione dei campioni Plasma in EDTA I campioni di plasma possono essere conservati a temperatura ambiente (25-30 C) per non più di 1 giorno o a 2-8 C per non più di 5 giorni. È stato osservato che i campioni di plasma sono rimasti stabili per sei settimane, se congelati tra 20 C e 80 C. Si raccomanda di conservare i campioni in aliquote di μl in provette sterili in polipropilene da 2,0 ml dotate di tappo a vite (ad esempio, le provette Sarstedt ). I campioni di plasma possono essere congelati e scongelati al massimo per tre volte senza perdite significative di RNA di HIV-1. Macchie di sangue secco Conservare le macchie di sangue secco in sacchetti singoli richiudibili, ciascuno con un sacchetto essiccante, a temperatura ambiente per un massimo di tre mesi. ISTRUZIONI PER L'USO Per istruzioni operative dettagliate, una descrizione approfondita delle possibili configurazioni, la stampa dei risultati e l'interpretazione di avvisi (flag), commenti e messaggi di errore, consultare i manuali del software AMPLILINK versione serie 3.3 elencati nella sezione Strumentazione e software. Dimensioni dei batch e flusso di lavoro Ogni kit contiene reagenti sufficienti per 48 test, che possono essere suddivisi in batch di test. È necessario includere in ogni batch almeno uno ciascuno dei controlli [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] (vedere la sezione Controllo di qualità). La seduta sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 deve essere avviata entro 120 minuti dal termine della preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: non congelare e non conservare a 2-8 C i campioni e i controlli trattati IT 9 Doc Rev. 1.0

10 Preparazione dei campioni e dei controlli Nota: se si utilizzano campioni congelati, lasciarli a temperatura ambiente fino a completo scongelamento e agitarli in Vortex per 3-5 secondi prima dell'uso. Prelevare i controlli dal luogo in cui sono conservati a 2-8 C e attendere che raggiungano la temperatura ambiente prima dell'uso. Configurazione dello strumento COBAS AmpliPrep Parte A. Manutenzione e priming A1. Lo strumento COBAS AmpliPrep è pronto per il funzionamento in modalità stand-by. A2. Accendere la stazione dati del software AMPLILINK (posizione ON). Preparare la stazione dati come segue: a. Eseguire la connessione al sistema operativo Windows XP. b. Fare doppio clic sull'icona del software AMPLILINK. c. Aprire una sessione del software AMPLILINK specificando l'id utente e la password assegnati. A3. Controllare la fornitura di reagente di lavaggio PG WR nella schermata Status e ricaricare, se necessario. A4. Eseguire tutte le attività di manutenzione elencate nella scheda Due. Lo strumento COBAS AmpliPrep eseguirà automaticamente il priming del sistema. Parte B. Caricamento delle cassette dei reagenti Nota: prelevare tutte le cassette de reagenti dal luogo in cui sono conservate a 2-8 C, caricarle immediatamente sullo strumento COBAS AmpliPrep e, prima di avviare il trattamento del primo campione, attendere almeno 30 minuti affinché raggiungano la temperatura ambiente sullo strumento. Evitare che le cassette dei reagenti raggiungano la temperatura ambiente all'esterno dello strumento, in quanto potrebbe formarsi della condensa sulle etichette del codice a barre. Non tentare di asciugare l'eventuale condensa strofinando le etichette del codice a barre. B1. Caricare il reagente HIV-1 QL v2.0 CS1 su un rack per reagenti. Caricare i reagenti HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1QL v2.0 CS4 su un altro rack per reagenti. B2. Caricare il rack con il reagente HIV-1 QL v2.0 CS1 nella posizione rack A dello strumento COBAS AmpliPrep. B3. Caricare il rack con i reagenti HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1 QL v2.0 CS4 nella posizione rack B, C, D o E dello strumento COBAS AmpliPrep. Vedere la Tabella 1 per maggiori informazioni. Parte C. Caricamento del materiale di consumo Nota: calcolare il numero necessario di cassette dei reagenti COBAS AmpliPrep, di unità SPU, di provette S, di puntali K e di provette K. Per ogni campione o controllo occorrono: un'unità SPU, una provetta S, un puntale K e una provetta K. Per quanto riguarda l'utilizzo dello strumento COBAS AmpliPrep con l'analizzatore COBAS TaqMan o con l'analizzatore COBAS TaqMan 48, sono disponibili diversi flussi di lavoro. Consultare la Tabella 1 per riferimento. A seconda del flusso di lavoro utilizzato, caricare il numero appropriato di rack con le cassette dei reagenti, rack per campioni con le provette S, rack per SPU, rack per puntali K, rack per provette K e K-carrier su rack per K-carrier nelle posizioni corrispondenti dei rack sullo strumento COBAS AmpliPrep (consultare la Tabella 1 per maggiori informazioni). C1. Caricare le unità SPU nei rack per SPU, quindi caricare i rack nelle posizioni rack J, K o L dello strumento COBAS AmpliPrep. C2. A seconda del flusso di lavoro utilizzato, caricare i rack riempiti con le provette K nella posizione rack M, N, O o P dello strumento COBAS AmpliPrep. C3. Caricare i rack riempiti con i puntali K nelle posizioni rack M, N, O o P dello strumento COBAS AmpliPrep. C4. Per il flusso di lavoro 3 con l'analizzatore COBAS TaqMan 48, caricare i K-carrier sui rack per K-carrier nelle posizioni rack M e N, o O e P dello strumento COBAS AmpliPrep IT 10 Doc Rev. 1.0

11 Tabella 1 Flussi di lavoro possibili per utilizzare lo strumento COBAS AmpliPrep con gli analizzatori COBAS TaqMan o COBAS TaqMan 48 Flusso di lavoro Modalità di trasferimento verso l'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 Rack, carrier e materiali di consumo Posizione sullo strumento COBAS AmpliPrep Strumento COBAS AmpliPrep più Docking Station più analizzatore COBAS TaqMan Strumento COBAS AmpliPrep più analizzatore COBAS TaqMan Strumento COBAS AmpliPrep più analizzatore/i COBAS TaqMan 48 Trasferimento automatico dei K-carrier Trasferimento manuale delle provette K tramite i rack per campioni sull'analizzatore COBAS TaqMan Trasferimento manuale del K-carrier tramite i rack per K-carrier sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 Provette K in rack riempiti con provette K Puntali K in rack riempiti con puntali K Provette S contenenti campioni e controlli nei rack per campioni Unità SPU nei rack per SPU CS1 nel rack per cassette CS2, CS3, CS4 nel rack per cassette Provette K in rack riempiti con provette K Puntali K in rack riempiti con puntali K Provette S contenenti campioni e controlli nei rack per campioni Unità SPU nei rack per SPU CS1 nel rack per cassette CS2, CS3, CS4 nel rack per cassette Al termine del trattamento dei campioni: provette K nei rack per campioni (pronti per il trasferimento manuale) Provette K nei rack per campioni Puntali K in rack riempiti con puntali K Provette S contenenti campioni e controlli nei rack per campioni Unità SPU nei rack per SPU CS1 nel rack per cassette CS2, CS3, CS4 nel rack per cassette K-carrier vuoto, con codice a barre, nel rack per K-carrier Al termine del trattamento dei campioni: provette K nel K-carrier sul rack per K-carrier M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Come sopra (F H) F - H M P F - H J - L A B - E M P Come sopra (M P) Parte D. Ordini e caricamento dei campioni D1. Preparare i rack per campioni come segue: applicare una clip con codice a barre in ogni posizione del rack per campioni nella quale verrà inserito un campione (provetta S). Applicare una delle clip con codice a barre specifiche per i controlli [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] in ogni posizione del rack per campioni nella quale verrà inserito un controllo (provetta S). Sulle clip con il codice a barre dei controlli dovrebbero essere stampati numeri di lotto identici a quelli stampati sui flaconi dei controlli contenuti nel kit. Fare attenzione ad assegnare il controllo corretto alla posizione con la clip corrispondente. D2. Utilizzando il software AMPLILINK, creare gli ordini per ogni campione e controllo nella scheda Sample della finestra Orders. Selezionare il file del test opportuno (file di definizione del test EDTA o DBS) e terminare salvando. Per informazioni sul nome e sulla versione del file TDF specifico, vedere la scheda informativa del prodotto fornita con il kit. D3. Assegnare gli ordini per i campioni e i controlli alle posizioni rack riservate ai campioni nella scheda Sample Rack della finestra Orders. Il numero del rack per campioni deve corrispondere a quello del rack preparato al punto D1. D4. Stampare il report Sample Rack Order per utilizzarlo come foglio di lavoro IT 11 Doc Rev. 1.0

12 D5. Procedere alla preparazione dei rack per i campioni e i controlli nell'area riservata all'aggiunta dei campioni e dei controlli: agitare in Vortex ogni campione e controllo [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] per 3-5 secondi. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli. Nota: per i campioni di plasma in EDTA passare al punto D6. Nota: per i campioni DBS passare al punto D7. Nota: non mescolare i campioni di plasma in EDTA e i campioni DBS sullo stesso rack per campioni. D6. Inserire una provetta S in ogni posizione contenente una clip con codice a barre. Trasferire μl di ogni campione nella provetta S con codice a barre corretta, utilizzando un micropipettatore con puntale dotato di barriera antiaerosol o a spostamento positivo privo di RNasi. Evitare di trasferire sostanze particellari e/o coaguli di fibrina dal campione originale alla provetta S. I campioni devono essere trasferiti nelle posizioni delle provette assegnate e registrati sul foglio di lavoro descritto al punto D4. Evitare di contaminare la parte superiore delle provette S con i campioni. Ignorare il punto D7 e passare al punto D8. D7. Inserire le provette S in tutte le posizioni (dalla 1 alla 24) di un termomiscelatore IsoRack. Asportare le macchie di sangue secco dalla carta filtro Whatman 903 o dalla carta di raccolta campioni Munktell TFN Brand 5 o equivalente (consultare le istruzioni per l'uso della carta filtro) e trasferirle all'interno della provetta S. Per tutti i tipi di carta utilizzati con i campioni DBS, è di fondamentale importanza verificare che la macchia di sangue aderisca alla parete interna della provetta S (per evitare coaguli nel campione) e sia completamente ricoperta di reagente SPEX. Vengono pipettati 1000 μl di reagente SPEX in una provetta S contenente la macchia di sangue secco. Per consentire l'eluizione del sangue intero secco, la provetta S viene inserita nel termomiscelatore Eppendorf Thermomixer Comfort (codice prodotto ) per 10 minuti a 56 C e 1000 rpm. Trasferire le provette S nelle posizioni riservate alle provette sul rack per campioni, facendo riferimento al foglio di lavoro descritto al punto D4. D8. Trasferire μl di ogni controllo [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] nella provetta S con codice a barre corretta, utilizzando un micropipettatore con puntale dotato di barriera antiaerosol o a spostamento positivo privo di RNasi. I controlli devono essere trasferiti nelle posizioni delle provette assegnate e registrati sul foglio di lavoro descritto al punto D4. Sulle clip con il codice a barre dei controlli dovrebbero essere stampati numeri di lotto identici a quelli stampati sui flaconi dei controlli contenuti nel kit. Fare attenzione ad assegnare il controllo corretto alla posizione nella quale è presente la clip con il codice a barre corrispondente. Evitare di contaminare la parte superiore delle provette S con i controlli. D9. Per i flussi di lavoro 1 e 2 caricare i rack per campioni contenenti le provette S nelle posizioni rack F, G o H dello strumento COBAS AmpliPrep. D10. Per il flusso di lavoro 3 con l'analizzatore COBAS TaqMan 48, caricare i rack per campioni contenenti le provette S e le provette K (una per ogni provetta S, inserita nella posizione a destra adiacente alle provette S) nelle posizioni rack F, G o H dello strumento COBAS AmpliPrep. Parte E. Avvio della seduta sullo strumento COBAS AmpliPrep E1. Avviare lo strumento COBAS AmpliPrep utilizzando il software AMPLILINK. Parte F. Fine della seduta dello strumento COBAS AmpliPrep e trasferimento sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 (solo per i flussi di lavoro 2 e 3) F1. Verificare la presenza di avvisi (flag) o messaggi di errore. F2. Rimuovere dallo strumento COBAS AmpliPrep i campioni e i controlli preparati sui rack per campioni (per l'analizzatore COBAS TaqMan senza Docking Station) o sui rack per K-carrier (per l'analizzatore COBAS TaqMan 48), a seconda del flusso di lavoro (per maggiori dettagli, vedere la Parte G). F3. Rimuovere i rifiuti dallo strumento COBAS AmpliPrep. Nota: al termine della preparazione dei campioni e dei controlli, non esporre i campioni e i controlli alla luce. Amplificazione e rilevazione Configurazione dell'analizzatore COBAS TaqMan o dell'analizzatore COBAS TaqMan 48 La seduta sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48 deve essere avviata entro 120 minuti dal termine della preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: non congelare e non conservare a 2-8 C i campioni e i controlli trattati IT 12 Doc Rev. 1.0

13 Parte G. Caricamento dei campioni preparati G1. A seconda del flusso di lavoro, eseguire le procedure opportune per trasferire le provette K sull'analizzatore COBAS TaqMan o sull'analizzatore COBAS TaqMan 48: Flusso di lavoro 1. Trasferimento automatizzato del K-carrier tramite Docking Station verso l'analizzatore COBAS TaqMan. Non è richiesto l'intervento manuale dell'operatore. Flusso di lavoro 2. Trasferimento manuale delle provette K contenute nei rack per campioni verso l'analizzatore COBAS TaqMan. Flusso di lavoro 3. Trasferimento manuale del K-carrier sui rack per K-carrier verso l'analizzatore COBAS TaqMan 48. Trasferimento manuale dei K-carrier verso l'analizzatore COBAS TaqMan 48 mediante il dispositivo di trasporto dei K-carrier. Parte H. Avvio della seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan o dell'analizzatore COBAS TaqMan 48 H1. Avviare l'analizzatore COBAS TaqMan o l'analizzatore COBAS TaqMan 48 scegliendo una delle opzioni seguenti, a seconda del flusso di lavoro: Flusso di lavoro 1. Non è richiesto nessun intervento. Flusso di lavoro 2. Avvio automatico dell'analizzatore COBAS TaqMan dopo l'inserimento dei rack per campioni. Flusso di lavoro 3. Riempire il K-carrier con provette K vuote se ne contiene meno di 6. L'operazione è guidata dal software AMPLILINK. Aprire il coperchio del termociclatore, caricare il K-carrier nel termociclatore e chiudere il coperchio. Avviare la seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan 48. Parte I. Fine della seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan o dell'analizzatore COBAS TaqMan 48 I1. Al termine della seduta dell'analizzatore COBAS TaqMan o dell'analizzatore COBAS TaqMan 48, stampare il report dei risultati. Controllare se nel report dei risultati sono presenti avvisi (flag) o messaggi di errore. I campioni con avvisi (flag) e commenti vengono interpretati secondo la modalità descritta nella sezione Risultati. Archiviare i dati dopo averli accettati. I2. Rimuovere le provette K usate dall'analizzatore COBAS TaqMan o dall'analizzatore COBAS TaqMan 48. RISULTATI Gli analizzatori COBAS TaqMan e COBAS TaqMan 48 determinano automaticamente la presenza dell'rna di HIV-1 nei campioni e nei controlli. Software AMPLILINK: Determina il valore di soglia del ciclo (Cycle Threshold, Ct) per l'rna di HIV-1 e per l'rna di HIV-1 IC. Determina la presenza dell'rna di HIV-1 e dell'rna di HIV-1 IC sulla base dei valori Ct per l'rna di HIV-1 e per l'rna di HIV-1 IC. Convalida del batch Controllare la finestra o la stampa dei risultati del software AMPLILINK per individuare eventuali avvisi (flag) e commenti a conferma della validità del batch. Nel caso degli ordini per i controlli, viene effettuata una verifica per determinare se il valore Ct del controllo rientra nell'intervallo specificato. Se il valore Ct per il controllo non rientra nell'intervallo specificato, viene generato un avviso (FLAG) per segnalare che un errore del controllo. Il batch è valido se non sono presenti avvisi (flag) per nessuno dei controlli [HIV-1 (+)C, v2.0 e CTM ( ) C]. Il batch non è valido se per i controlli HIV-1 vengono generati i seguenti avvisi (flag): IT 13 Doc Rev. 1.0

14 Controllo negativo Flag Risultato Interpretazione NC_INVALID Invalid Un risultato non valido, oppure il risultato del controllo negativo non è negativo. Controllo positivo HIV-1, v2.0 Flag Risultato Interpretazione PC_INVALID Invalid Un risultato non valido, oppure il risultato del controllo positivo non è positivo. Se il batch non è valido, ripetere l'intera procedura incluse preparazione, amplificazione e rilevazione. Interpretazione dei risultati Se il batch è valido, controllare se sono presenti avvisi (flag) o commenti sulla stampa dei risultati. Un batch valido può includere risultati di campioni sia validi che non validi, a seconda che vengano generati o meno avvisi (flag) e/o commenti per i singoli campioni. I risultati dei campioni devono essere interpretati nel modo seguente: Tipo di campione Plasma in EDTA DBS Risultato della rilevazione Not Detected Detected Not Detected DBS Detected DBS Interpretazione Valore Ct per l'hiv-1 superiore al limite del test oppure nessun valore Ct ottenuto per l'hiv-1. Documentare il risultato come RNA di HIV-1 non rilevato. Documentare il risultato come RNA di HIV-1 rilevato. Valore Ct per l'hiv-1 superiore al limite del test oppure nessun valore Ct ottenuto per l'hiv-1. Documentare il risultato come RNA di HIV-1 non rilevato. Documentare il risultato come RNA di HIV-1 rilevato. Se il risultato del campione visualizzato è "Failed", "Invalid" o "Aborted", consultare il Manuale dell'applicazione - Software AMPLILINK versione serie 3.3, come indicato nella sezione "Materiale necessario ma non fornito" IT 14 Doc Rev. 1.0

15 LIMITI DELLA PROCEDURA 1. Questo test è stato validato per l'uso con plasma umano raccolto in anticoagulante EDTA e macchie di sangue intero secco raccolte in anticoagulante EDTA. L'uso di altri tipi di campioni per lo svolgimento del test può generare risultati non accurati. 2. Le prestazioni del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 non sono state sottoposte a valutazione né con campioni contenenti HIV-1 gruppo N, né con campioni contenenti HIV L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure di prelievo, trasporto, conservazione e trattamento dei campioni. 4. La presenza dell'enzima AmpErase nel reagente Master Mix del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 riduce il rischio di contaminazione da ampliconi. È tuttavia possibile prevenire la contaminazione da controlli HIV-1-positivi e da campioni clinici soltanto adottando buone pratiche di laboratorio e seguendo scrupolosamente tutte le procedure descritte in questo foglio illustrativo. 5. Questo prodotto deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato nelle tecniche PCR. 6. Questo prodotto può essere utilizzato esclusivamente con lo strumento COBAS AmpliPrep e con gli analizzatori COBAS TaqMan e COBAS TaqMan Anche se rare, le mutazioni nell'ambito delle regioni altamente conservate del genoma virale coperte dai primer e/o dalle sonde del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 potrebbero causare la mancata rilevazione del virus. 8. L'identificazione dell'rna di HIV-1 dipende dal numero di particelle virali presenti nel campione e può essere influenzata dal metodo di prelievo del campione e da fattori legati al paziente (ad esempio età, presenza di sintomi, stadio dell'infezione, set-point virologico e uso di farmaci antiretrovirali). 9. A causa delle differenze intrinseche tra le tecnologie, è consigliabile che gli utenti, prima di passare da una tecnologia a un'altra, svolgano studi sulla correlazione tra i metodi nei propri laboratori alla scopo di quantificare tali differenze. SOSTANZE INTERFERENTI Secondo quanto osservato, livelli elevati di trigliceridi (fino a 30 g/l), bilirubina coniugata (fino a 0,2 g/l), albumina sierica umana (fino a 60 g/l), emoglobina (fino a 2 g/l) e DNA umano (fino a 2 mg/l) nei campioni DBS e nei campioni di plasma non interferiscono con la rilevazione dell'rna di HIV-1 e non pregiudicano la specificità del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. Secondo quanto osservato, gli autoanticorpi dei pazienti con anticorpi antinucleari reattivi presenti nei campioni DBS e nei campioni di plasma non interferiscono con il test. Secondo quanto osservato, il lupus eritematoso sistemico (LES) e l'artrite reumatoide (AR) nei campioni di plasma interferiscono con la rilevazione dell'rna di HIV-1 e possono determinare risultati falsi negativi in rari casi. I marcatori delle malattie autoimmuni fin qui citate sono stati testati anche con i campioni DBS e non hanno causato interferenze. La valutazione è stata svolta in base alle Linee Guida CLSI EP7-A2, utilizzando più lotti di reagenti del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. Secondo quanto osservato, il Foscarnet sodico (farmaco per infezioni da CMV, inibitore della polimerasi virale) a concentrazioni 2 volte superiori al livello plasmatico di picco (Cmax) indicato dal produttore interferisce con il controllo interno del kit, compromettendo la validità di alcuni test. Non sono stati osservati risultati falsi positivi o falsi negativi. I seguenti composti farmaceutici sono stati analizzati ad una concentrazione 3 volte superiore al livello plasmatico di picco (Cmax) e, secondo quanto osservato, non interferiscono con la rilevazione dell'rna di HIV-1 e non pregiudicano la specificità del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0: IT 15 Doc Rev. 1.0

16 Farmaci contro l'hiv: Inibitori della proteasi Atazanavir Saquinavir Ritonavir Lopinavir/Ritonavir Nelfinavir mesilato Darunavir Tipranavir Fosamprenavir Inibitori dell'integrasi Raltegravir Elvitegravir Inibitori d'ingresso Maraviroc Analoghi dei nucleosidi/nucleotidi inibitori della trascrittasi inversa Zidovudina, AZT Abacavir solfato, ABC Lamivudina, 3TC Tenofovir DF, TDF Emtricitabina, FTC Stavudina, d4t Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa Efavirenz Rilpivirina Etravirina Nevirapina Agenti di boosting farmacocinetico Cobicistat Farmaci contro l'hbv e/o l'hcv: Analoghi dei nucleotidi Adefovir dipivoxil Immunomodulatori Peginterferone alfa-2 Peginterferone alfa-2b Ribavirina Analoghi dei nucleosidi Entecavir Telbivudina Inibitori della proteasi Boceprevir Telaprevir Composti per il trattamento dei virus dell'herpes: Analoghi dei nucleosidi Aciclovir Ganciclovir Valganciclovir cloridrato Cidofovir Composti per il trattamento e la prevenzione delle infezioni opportunistiche nella malattia da HIV Antinfettivi Sulfametossazole Trimetoprima Antimicotici Fluconazolo Antimicobatterici Azitromicina Isoniazide Rifampina Rifabutina Etambutolo Claritromicina Pirazinamide IT 16 Doc Rev. 1.0

17 VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI NON CLINICHE A. Limite di rilevazione Il limite di rilevazione del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è stato determinato analizzando il 2 o Standard Internazionale dell'oms per l'rna di HIV-1, Codice NIBSC 97/650 41, HIV-1 sottotipo B, diluito in plasma umano in EDTA o sangue intero (per i campioni DBS) HIV-1-negativi. Una copia di RNA di HIV-1 equivale a 1,7 ± 0,1 UI (Unità Internazionali). È stato determinato il limite di rilevazione per tre lotti di reagenti. Per ogni lotto di reagenti sono state analizzate tre serie di diluizioni. In totale il test è stato eseguito 126 volte per ogni livello di concentrazione nel caso dei campioni di plasma in EDTA e 189 volte per ogni livello di concentrazione nel caso dei campioni DBS. La valutazione si è svolta nel rispetto delle Linee Guida CLSI EP17-A2. I risultati combinati per tutti e tre i lotti di test eseguiti su campioni di plasma in EDTA e campioni DBS (Tabelle 2 e 3) dimostrano che il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 ha rilevato la presenza dell'rna di HIV-1 a concentrazioni di 20 cp/ml per quanto riguarda il plasma in EDTA e di 300 cp/ml per quanto riguarda i campioni DBS, o a concentrazioni maggiori con un tasso di successo 95% in base all'analisi PROBIT. Tabella 2 Limite di rilevazione del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 per campioni di plasma in EDTA utilizzando lo Standard Internazionale dell'oms e l'analisi PROBIT Input nominale (RNA di HIV-1 cp/ml) N. di test N. di positivi Tasso di positività Tasso di successo 95% PROBIT 16,5 cp/ml Intervallo di confidenza al 95%: 14,3 19,8 cp/ml Input nominale (RNA di HIV-1 cp/ml) Tabella 3 Limite di rilevazione del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 per campioni DBS utilizzando lo Standard Internazionale dell'oms e l'analisi PROBIT N. di test N. di positivi Tasso di positività Tasso di successo 95% PROBIT 221,8 cp/ml Intervallo di confidenza al 95%: 195,6 260,5 cp/ml IT 17 Doc Rev. 1.0

18 B. Precisione La precisione del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è stata determinata analizzando diluizioni seriali di un campione sopranatante da coltura cellulare di HIV-1, sottotipo B, in plasma umano in EDTA e in campioni DBS HIV-1-negativi. L'assegnazione del titolo al sopranatante da coltura cellulare (concentrazione stock) è stata effettuata con un metodo che assicura la tracciabilità al 1 o Standard Internazionale dell'oms per l'rna di HIV-1, Codice NIBSC 97/ Una copia di RNA dell'hiv-1 è equivalente a 1,7 ± 0,1 Unità Internazionali (UI). Per i campioni di plasma in EDTA sono stati analizzati tre lotti di reagenti, suddivisi in 11 sedute. Ogni seduta era costituita da 7 livelli di diluizione e 14 test per ogni livello. Per i campioni DBS sono stati analizzati tre lotti di reagenti, suddivisi in 15 sedute. Ogni seduta era costituita da 6 livelli di diluizione e 21 test per ogni livello. Ogni campione è stato sottoposto all'intera procedura prevista per il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0, che include preparazione, amplificazione e rilevazione dei campioni. Lo studio è stato effettuato utilizzando tre lotti di reagenti del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. Tutti i dati validi relativi alla precisione sono stati valutati calcolando il tasso di successo in % per ogni componente del pannello, in base al lotto di reagenti per i campioni di plasma e DBS. Secondo quanto osservato, il test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 ha assicurato prestazioni uniformi a livelli di concentrazione pari a 60, 40, 30, 20, 10, 5 e 0 cp/ml per i campioni di plasma in EDTA e a livelli di concentrazione pari a 500, 400, 300, 150, 75 e 0 cp/ml per i campioni DBS con tutti e tre i lotti di reagenti utilizzati (Tabelle 4 e 5). Tabella 4 Precisione del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 con campioni di plasma in EDTA Concentrazione nominale Tasso di successo (%) (cp/ml) Lotto 1 Lotto 2 Lotto Tabella 5 Precisione del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 con campioni DBS Concentrazione nominale Tasso di successo (%) (cp/ml) Lotto 1 Lotto 2 Lotto C. Inclusività dell'hiv-1, gruppi M, N e O Sono state proposte otto categorie di sottotipi per l'hiv-1, gruppo M, in base alla divergenza nucleotidica. Questi sottotipi sono identificati con le lettere alfabetiche maiuscole dalla A alla H 40. Verificando il limite di rilevazione, sono state valutate le prestazioni del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 con riferimento all'hiv-1 gruppo M, sottotipi A-H e CRF01_AE, gruppo O e gruppo N. Gli isolati degli 8 sottotipi di HIV-1 gruppo M, CRF01_AE, un isolato del gruppo N e un isolato del gruppo O sono stati sottoposti a valutazione utilizzando fino ad un massimo di quattro livelli di concentrazione per i campioni di plasma in EDTA o per i campioni DBS. Il tasso di successo è stato determinato per ogni livello utilizzando fino a 49 test. Lo studio è stato effettuato utilizzando un massimo di due lotti di reagenti del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. I risultati relativi ai campioni di plasma con EDTA e ai campioni DBS (Tabelle 6 e 7) confermano che il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 ha rilevato l'rna di HIV-1 per dieci genotipi/sottotipi diversi a concentrazioni pari a 7,5E+01 cp/ml (o inferiori) per i campioni di plasma e a concentrazioni pari a 1,0E+3 cp/ml (o inferiori) per i campioni DBS. Il tasso di successo è > 95% IT 18 Doc Rev. 1.0

19 Tabella 6 Verifica del limite di rilevazione dei genotipi per il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 con campioni di plasma in EDTA Sottotipo Designazione dell'isolato Livello più basso di concentrazione > tasso di successo al 95% (cp/ml) gruppo M sottotipo A 92UG029 1,0E+01 gruppo M sottotipo A 4237A/98 2,9E+01 gruppo M sottotipo B 92TH026 3,2E+01 gruppo M sottotipo B 8E5/LAV 7,5E+01 gruppo M sottotipo C 92BR025 3,0E+01 gruppo M sottotipo C 3777A/97 1,1E+01 gruppo M sottotipo D 92UG021 3,0E+01 gruppo M sottotipo D 92UG035 1,1E+01 gruppo M sottotipo E 92TH022 1,2E+01 gruppo M sottotipo E 92TH009 1,4E+01 gruppo M sottotipo F 93BR020 3,2E+01 gruppo M sottotipo G ARP173/RU570 1,3E+01 gruppo M sottotipo H HIV V1557 1,6E+01 gruppo M sottotipo CRF01_AE 1019-HIV ,0E+01 gruppo O MVP5180 5,0E+01 gruppo N YBF30 6,0E+01 Tabella 7 Verifica del limite di rilevazione dei genotipi per il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 con campioni DBS Sottotipo Designazione dell'isolato Livello più basso di concentrazione > tasso di successo al 95% (cp/ml) gruppo M sottotipo A 92UG029 2,0E+02 gruppo M sottotipo C 92BR025 3,0E+02 gruppo M sottotipo D 92UG021 2,0E+02 gruppo M sottotipo E 92TH022 2,0E+02 gruppo M sottotipo F 93BR020 3,0E+02 gruppo M sottotipo G ARP173/RU570 2,0E+02 gruppo M sottotipo H HIV V1557 4,0E+02 gruppo M sottotipo CRF01_AE 1019-HIV ,0E+03 gruppo O MVP5180 4,0E+02 gruppo N YBF30 1,0E+03 D. Sensibilità diagnostica La sensibilità diagnostica del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è stata determinata analizzando singoli campioni di plasma in EDTA HIV-1-positivi (169 risultati in totale) e campioni DBS di soggetti adulti (172 risultati in totale) con tre lotti di reagenti del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. Tutti i campioni di plasma in EDTA e i campioni DBS di soggetti adulti sono risultati positivi all'hiv-1 In questo pannello, la sensibilità diagnostica del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è stata del 100% (limite inferiore di confidenza al 95% monolaterale: > 98,2%) per i campioni di plasma in EDTA e per i campioni DBS (limite inferiore di confidenza al 95% monolaterale: > 98,3%). La sensibilità diagnostica del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è stata inoltre valutata durante la sieroconversione. Sono stati analizzati i componenti di 10 pannelli di sieroconversione HIV-1 disponibili in commercio, ciascuno dei quali prelevato da un singolo donatore di plasma durante un periodo di sieroconversione dell'anticorpo anti-hiv-1, utilizzando un lotto di reagenti del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. In 5 pannelli di sieroconversione su 10, il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 ha rilevato l'hiv-1 prima del saggio sierologico di riferimento Abbott RealTime HIV-1 Qualitative Assay IT 19 Doc Rev. 1.0

20 E. Specificità La specificità del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è stata determinata con due lotti di reagenti, analizzando campioni di plasma in EDTA e campioni DBS HIV-1-negativi appartenenti a donatori di sangue. In totale sono stati ottenuti risultati validi da 1298 campioni di plasma in EDTA e da 998 campioni DBS. Fatta eccezione per due campioni di plasma in EDTA e un campione DBS, tutti i campioni sono risultati negativi all'rna di HIV-1 in base al test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. Sulla base di questi risultati, è possibile affermare che il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 ha una specificità del 99,8% (limite inferiore di confidenza al 95%, monolaterale: > 99,5%) per i campioni di plasma in EDTA e del 99,9% (limite inferiore di confidenza al 95%, monolaterale: > 99,5%) per i campioni DBS. F. Specificità analitica La specificità analitica del test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 è stata valutata aggiungendo organismi da coltura (virus, batteri, lieviti) ad una concentrazione pari a 1,0E+06 particelle/ml e virus dell'epatite C ad una concentrazione iniziale pari a 1,0E+07 particelle/ml al plasma umano in EDTA HIV-1-negativo, al plasma in EDTA HIV-1-positivo ad una concentrazione pari a 6,0E+01 cp/ml di HIV-1 e al plasma in EDTA HIV-1-positivo ad una concentrazione pari a 1,0E+03 per i campioni DBS (Tabella 8). Nessuno degli organismi analizzati ha prodotto reazioni crociate con il test qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0. Tabella 8 Campioni per la specificità analitica Virus Adenovirus tipo 5 Citomegalovirus Virus di Epstein-Barr Virus dell'herpes umano tipo 6 Virus dell'herpes simplex tipo 1 Virus dell'herpes simplex tipo 2 Virus linfotropico delle cellule T umane tipo 1 Virus linfotropico delle cellule T umane tipo 2 Influenza A Virus dell'epatite A Virus dell'epatite B Virus dell'epatite C Virus dell'epatite G Virus dell'epatite E Virus del papilloma umano Virus varicella-zoster Virus del Nilo Occidentale Virus dell'encefalite di St. Louis Virus dell'encefalite della Murray Valley Virus della Dengue tipo 1, 2, 3 e 4 Virus della febbre gialla Virus Zika Virus dell'encefalite trasmessa da zecche, ceppo HYPR Parvovirus B19 Virus della chikungunya Batteri Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Streptococcus sanguinis Propionibacterium acnes Escherichia coli Lieviti Candida albicans IT 20 Doc Rev. 1.0