Le malattie infettive trasmesse da. donazioni/trasfusioni

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1 Relazione Dr. Giulio Pisani Le malattie infettive trasmesse da vettori e l impatto sul sistema donazioni/trasfusioni Diagnosi di laboratorio

2 Febbre Mal di testa Dolori muscolari Nausea, Vomito Linfonodi ingrossati Rash cutaneo Febbre Confusione Convulsioni Debolezza muscolare Perdita vista Intorpidimento Paralisi Stato comatoso Ricerca IgM nel -Siero -CSF

3 IgM Le IgM compaiono a partire dall ottavo giorno dall infezione Le IgM compaiono 3-8 giorni dopo la sintomatologia Presenti per almeno giorni Raramente presenti anche fino a 12 mesi ed oltre IgM ASSENZA prima dell ottavo giorno Ripetere il test t dopo 7-14 fine della fase acuta giorni PRESENZA Eid Evidenza di una infezione i recente Test di conferma da Possibile cross-reattività eseguire mediante test neutralizzazione in vitro

4 Febbre Mal di testa Dolori muscolari Nausea, Vomito Linfonodi ingrossati Rash cutaneo Febbre Confusione Convulsioni Debolezza muscolare Perdita vista Intorpidimento Paralisi Stato comatoso Ricerca IgG nel - Siero

5 IgG Le IgG compaiono qualche giorno dopo le IgM Presenti per almeno 1 2 anni.ed oltre IgG ASSENZA Prelievo in periodo precoce Ripetere il test dopo 7-14 giorni Da associare con le IgM Evidenza di una infezione PRESENZA passata Ripetizione dopo 7-14 Possibile cross-reattività giorni per valutare un rialzo

6 Possibile cross-reattività reattività Usutu Virus Virus Febbre gialla Virus Encefalite giapponese Virus encefalite di St. Louis Virus Dengue Plaque-reduction neutralization tests PRNT

7 Febbre Confusione Convulsioni Debolezza muscolare Perdita vista Intorpidimento Paralisi Stato comatoso Febbre Mal di testa Dolori muscolari Nausea vomito Linfonodi ingrossati rash cutaneo Ricerca del Virus plasma, siero, CSF Isolamento su coltura Cellulare Campione raccolto in condizioni sterili in terreno con antibiotici e conservato a +4 C per un massimo di 24 ore Ricerca del genoma virale da 2 3 giorni a giorni post-infezione

8 Efficacia TEST SIEROLOGICI vs MOLECOLARI Studio condotto tra il Pazienti New York 95% IgM + nel CSF 90% IgM + nel siero entro 8 giorni dai sintomi 55% PCR + nel CSF 10% PCR + nel siero West Nile virus surveillance and control: an update for healthcare providers in New York City. New York Department of Health. City Health Information. 2001;20.

9 Ricerca del genoma virale NAT WNV RNA

10 anno casi di trasmissione virale WNV attraverso il sangue durante la stagione epidemica

11 Trasfusione Sangue da 63 donatori WNVD Donatore Organi Febbre da WNV WNVD anno 2002 WNVD

12 La Food and Drug Administration (FDA) richiese ai produttori di kit di sviluppare prima possibile un saggio molecolare per rilevare il WNV RNA nel sangue

13 Giugno 2003 disponibili due kit diagnostici che vennero impiegati in ambito di investigational new drug (IND) nello screening del sangue durante la stagione esiva 2013 Giugno Dicembre milioni di unità analizzate. 818 confermate positive WNV RNA Evitate potenziali trasmissioni di WNV attraverso la trasfusione

14 virus IgG IgM 240 cp/ml rtpcr MP cp/ml TMA MP cp/ml 10 cp/ml rtpcr ID TMA ID

15 .. rare transfusion-transmitted infections could still occur from the transfusion of units with low level viremia that would not be detected by MP NAT Busch MP et al. Emerg Infect Dis 2006 Giugno Dicembre milioni di unità analizzate. 6 donazioni sfuggite 818 confermate positive WNV RNA Retrospective studies of samples from donors in epidemic areas established that a substantial fraction (20% - 30%) of WNV RNA positive blood donations had very low- level viremia that was detectable by ID-NAT but not by MP-NAT

16 Strategia del trigger 6 MP Sensibilità 240 cp/ml ID Sensibilità 40 cp/ml ID Sensibilità 10 cp/ml 16 MP Sensibilità 160 cp/ml

17 1 MP positivo alla NAT WNV Trasmissione all uomo di WNV nella popolazione 1 caso ogni abitanti nelle aree rurali 1 caso ogni abitanti nelle aree urbane Se il numero delle infezioni nella popolazione scende o e non vengono più identificati donatori positivi alla NAT per WNV nei successivi 7 gg, si può ritornare a MP6

18 4 MP positivi alla NAT WNV Trasmissione all uomo di WNV nella popolazione 1 caso ogni abitanti Se non vengono più identificati donatori positivi alla NAT per WNV nei successivi 7 gg, si può ritornare a MP6 o MP : un caso di trasmissione WNV (il MP6 era negativo) 2006 : due casi di trasmissione WNV da uno stesso donatore (emazie e plasma)

19 Dal 2003, circa Unità di Sangue NAT positive per il WNV sono state identificate e rimosse WNV human cases total 35,153 WNV reactive units 3,762 Un totale di 12 casi di trasmissione di WNV con il sangue sono stati identificati Fatal WNV infection after probable transfusion-associated transmission Colorado, 2012 MMWR / August 9, 2013 / Vol. 62 / No. 31

20 Infezione umana da WNV rientra tra le malattie notificabili Commission Decision 2009/312/EC. Definizione di caso infezione umana da WNV Commission Decision of 28/IV/2008. Criteri Clinici Qualsiasi persona con febbre o almeno Encefalite o Meningite Criteri Diagnostici - Isolamento virale dal sangue o liquido cerebrospinale - rilevamento genoma virale dal sangue o liquido cerebrospinale - presenza di IgM anti-wnv nel liquido cerebrospinale - presenza di alto titolo IgM anti-wnv, presenza di IgG e conferma mediante neutralizzazione in vitro

21 NAT per WNV RNA

22 biglia magnetica Fase di estrazion Lisi della particella virale Rilascio del genoma virale legame a biglie magnetiche lavaggi biglia magnetica

23 Fase di Amplificazione Fase di Rilevazione Sonda TaqMan Valore soglia Crossing-point Threshold-cycle

24 TMA Transcription Mediated Assay Fase di Amplificazione Fase di Rilevazione probe RNA target chemiluminescenza EA RLU

25 WNV RNA NAT Sensibilità Analitica 95%LOD

26 WNV RNA NAT: Sensibilità Analitica 95% Limit of Detection WNV Lin 1 ~ 40 cp / ml 1 Real time PCR Health Canada reagent ~ 10 cp / ml 2 TMA HC-SC, WNV Nat Ref 001/03 Saldanha J Transfusion 45, ) Saldanha et al Transfusion 48, ) Linnen et al J Med Virology WNV Stock, NY Lot FDA WNV Reference Panel CONFIRMED

27 WNV RNA NAT: Sensibilità Analitica 95% Limit of Detection WNV Lin 2 ~ 5 cp / ml 1 Real time PCR ~ 20 cp / ml 2 TMA The WNV RNA qualification panel QWN701 1) Saldanha et al Transfusion 48, ) Linnen et al J Med Virology

28 WNV RNA NAT Specificità Analitica

29 Cross-reattività VIRUS Real time PCR TMA Japanese Encephalitis Virus SI no Murray Valley encephalitis virus SI no Saint Louis encephalitis virus SI no Kunjin virus SI SI Yellow fever virus non riportato no Dengue virus non riportato no Usutu virus SI 2 SI 1,2 1) Gaibani P et al. J Clin Microbiol 2010; 48: ) Pisani G et al, Blood Transfusion 2010; 10:515-20

30 WNV screening in Italia

31 WNV screening in Italia Anno n. donatori NAT + n. donazioni testate Casi WNVD Non riportato 21

32 IgM IgG RNA: ~ cp/ml IgM negativa IgG negativa donazione

33 IgM IgG RNA: << 100 cp/ml IgM positiva IgG negativa donazione

34 Su 9 donazioni positive alla NAT IgM e IgG negative IgM e/o IgG positive

35 Grazie