Problematiche di laboratorio nell applicazione del protocollo regionale

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1 MALATTIE TRASMESSE da VETTORI e SORVEGLIANZA delle FEBBRI E STIVE Venezia, 9 maggio 2013 Problematiche di laboratorio nell applicazione del protocollo regionale Luisa Barzon Dipartimento di Medicina Molecolare, Università di Padova UOC Microbiologia e Virologia, Azienda Ospedaliera di Padova

2 Laboratorio di Riferimento Regionale Diagnostica delle infezioni virali emergenti UOC Microbiologia e Virologia Azienda Ospedaliera dio Padova Direttore Prof. Giorgio Palù giorgio.palu@unipd.it Laboratorio Virologia tel Dr.ssa Monia Pacenti monia.pacenti@sanita.padova.it Dr. Riccardo Cusinato riccardo.cusinato@sanita.padova.it Laboratorio Sierologia tel Dr.ssa Margherita Cattai margherita.cattai@sanita.padova.it Laboratorio Diagnostica Molecolare tel Prof. Luisa Barzon luisa.barzon@unipd.it Dr.ssa Elisa Franchin elisa.franchin@unipd.it Dr.ssa Silvana Pagni silvana.pagni@unipd.it

3 Surveillance of West Nile fever

4 Viremia and antibody kinetics in West Nile virus infection

5 Pitfalls in Laboratory Diagnosis of WNV infection Antibody detection IgM antibodies may persist for over 1 year after acute infection. Cross-reactivity of WNV antibodies with other flaviviruses Neutralizing antibodies are specific, but partial cross-neutralization may occur. In the early phase of infection, antibodies may be non-neutralizing. For the neutralization test, a BSL3 lab is required. Molecular testing Low and short duration of vireamia. Genetic diversity (lineages, strains). Risk of degradation of viral RNA Viral isolation In BSL3 lab. Inhibited by the presence of antibodies.

6 EU case definition for West Nile fever West Nile fever in humans is a notifiable disease at the European Union (EU) level according to Commission Decision 2009/312/EC. The case definition for reporting human cases of West Nile fever at EU level is outlined in Commission Decision of 28/IV/2008. It includes the following criteria and case classification: Clinical criteria Any person with fever OR at least one of the following two: - Encephalitis - Meningitis -(Acute flaccid paralysis) Epidemiological criteria At least one of the following two epidemiological links: -Animal to human transmission (residing, having visited or having been exposed to mosquito bites in an area where WNV is endemic in horses or birds) - Human to human transmission (vertical transmission, blood transfusion, transplants)

7 EU case definition for West Nile fever Case classification Probable case Any person meeting the clinical criteria AND with at least one of the following two: - an epidemiological link -a laboratory test for a probable case Confirmed case Any person meeting laboratory criteria for case confirmation

8 Laboratory criteria EU case definition for West Nile fever 1. Laboratory test for case confirmation At least one of the following four: -Isolation of WNV from blood or CSF (and urine) -Detection of WNV nucleic acid in blood or CSF (and urine) - WNV specific antibody response (IgM) in CSF - WNV IgM high titre AND detection of WNV IgG, AND confirmation by neutralisation 2. Laboratory test for a probable case - WNV specific antibody response in serum - Laboratory results need to be interpreted according to flavivirus vaccination status

9 Laboratorydiagnosis(Padova Lab) WN feverand WNND SerumIgMand IgGELISA asfirst line test; ifpositive PRNT (when IgG are detectable). In housereal-time RT-PCR WNV lin-1 and RT-PCR WNV lin-1 /2 in plasma, CSF, and urine RT-PCR pan-flavivirus + sequencingin plasma, CSF, and urine if WNV RNA-positive, viral isolation and full genome sequencing.

10 Clinical and virological findings in the outbreak of West Nile virus Livenza strain in northern Italy, July to September 2012 Barzon et al. Euro Surveill, 2012

11 Inviare sempre la scheda compilata I campioni di siero, CSF, sangue in EDTA e urine possono essere conservati a 4 C fino a 72 ore. Raccogliere subito siero, plasma, e urine per i test sierologici e molecolari. Poco utile un protocollo in due fasi con test di screening e test di secondo livello.

12 Compilare semprela scheda, indicando sempre: -data inizio sintomi -Sintomi -Vaccinazioni pregresse -Eventuali precedenti risultati di laboratorio (anticorpi anti-wnv e altri flavivirus con test ELISA o IFA) -Segnalare se NON sono stati eseguiti test di primo livello. -Info medico richiedente. Inviare sempre i seguenti campioni: -Almeno 1 provetta di sangue per sierologia -Almeno 2 provette di sangue intero in EDTA -Un campione di urina in contenitore sterile. Inviare semprei campioni di follow-up a distanza di 15 giorni (utile anche followup ravvicinato)

13 Surveillance and molecular epidemiology of West Nile virus in Veneto Region, 2012 Barzon et al. Euro Surveill, 2012 Barzon et al. Euro Surveill, 2012

14 Surveillance of dengue e chikungunya

15 Course of dengue infection and timings of diagnosis Halstead SB. Lancet 2007

16 CHIKV infection and timings of diagnosis Schwarts & Albert. Nat Rev Microbiol 2010

17 Laboratorydiagnosis(Padova Lab) Dengue and chikungunya fever DENV NS1Ag and IgM/IgG, CHIKV IgM rapid tests on serum. Real-time RT-PCR DENV1-4, RT-PCR CHIKV, RT-PCR pan- Flavivirus in plasma and urine. if positive viral isolation and genome sequencing. Serum DENV and CHIKV IgM/IgG ELISA and IFA; if positive PRNT.

18 Pitfalls in the laboratory diagnosis of dengue False negative and false positive results of rapid tests (NS1 Ag and IgM/IgG) Like WNV, cross-reactivity of antibodies vs other flaviviruses, and vaccines (rapid tests, EIA, and IFA) Persistence of IgM antibodies Neutralization test required for confirmation (BSL3 lab) Low titre and short duration of viraemia Risk of degradation of viral RNA Viral genome diversity (4 types) Viral isolation in BSL3.

19 The problem of serological diagnosis of WNV and DENV infection in an area of high prevalence of serum WNV antibodies Barzon et al. Eurosurveillance, 2011

20 Cases of imported dengue in Veneto Region, imported dengue cases 2011 imported dengue cases 2012 imported dengue cases DENV-1 DENV-1 DENV-1 DENV-1 DENV-4 DENV-1 DENV-3 DENV-3 DENV-2 DENV-2 DENV-2 DENV-3 DENV-3 DENV-3 DENV-3 DENV-3 DENV-1

21 Proposal of DENV RNA and other vector-borne Flavivirus testing in urine DENV and other vector-borne Flavivirus genome sequences are detectable in urine of patients with acute infection for longer time than in blood. urine serum Number of DENV genome-positive and -negative urine and serum samples determined by real-time RT-PCR based on disease days. Closed bar, positive; open bar, negative. Hirayama et al. J Clin Microbiol, 2012

22 Pitfalls in the laboratory diagnosis of chikungunya False negative results of the rapid test (IgM) Persistence of IgM antibodies Short duration of viraemia Risk of degradation of viral RNA Viral genome diversity Viral isolation in BSL3.

23 Cases of imported chikungunya in Veneto Region, 2012

24 Inviare sempre la scheda compilata Rischio elevato di test rapidi IgM/IgG positivi nei casi autoctoni Rischio di risultati falsi negativi con i test rapidi come screening. Il test rapido è utile perchè eseguibile in urgenza. I campioni di siero, sangue in EDTA e urine possono essere conservati a 4 C fino a 72 ore. Raccogliere subito siero, plasma, e urine per i test sierologici e molecolari.

25 Compilare sempre la scheda, indicando sempre: -Data inizio sintomi -Sintomi -Paesi visitati -Vaccinazioni pregresse -Eventuali precedenti risultati di laboratorio. -Segnalare se NON sono stati eseguiti test di primo livello. -Info medico richiedente. Inviare sempre i seguenti campioni: -Almeno 1 provetta di sangue per sierologia -Almeno 1 provetta di sangue intero in EDTA -Un campione di urina in contenitore sterile. Inviare sempre un campione di siero a distanza di giorni per i pazienti DENV RNA-negativi (per test di neutralizzazione).

26 The Regional Reference Centre at the Microbiology and Virology Division, Padova University Hospital National and European Networking Italian Society for Virology (G. Palù, President) European Society for Virology (G. Palù, First Vice President) ECDC (Scientific Panel, Focal Point) European Network for Diagnostic of Imported Viral Diseases (ECDC Outbreak Assistance Laboratory Network) (G.Palù, Member) ENIVD Collaborative Laboratory Response Network (G. Palù and L. Barzon, members) EpiSouth Network (Azienda Ospedaliera Padova, focal point, M. Pacenti, member) Collaboration with Greece (A. Papa)

27 Laboratorio di riferimento regionale UOC Microbiologia e Virologia - Azienda Ospedaliera di Padova Per migliorare la diagnosi laboratoristica e la conferma dei casi è utile centralizzare i test presso il Laboratorio di Rifermento Regionale (come per es. in Emilia-Romagna e altri Paesi Europei). Approccio diagnostico integrato per la conferma rapida dei casi. Personale altamente qualificato con ampia esperienza e capacità di set-up rapido di nuovi test diagnostici. Tempi rapidi di riposta (6-48 ore dal ricevimento del campione) Costi contenuti grazie all esecuzione di test in house. No costi aggiuntivi per il trasporto dei campioni (si eseguono già routinariamente test diagnostici per tutti gli ospedali del Veneto). Elevata qualità delle prestazioni (unico laboratorio clinico italiano accreditato ISO 15189). Partecipazione regolare a VEQ e network per diagnostica di infezioni emergenti (WNV, DENV, Hantavirus, CCHFV, influenza virus, coronavirus, etc.) Laboratorio BSL3 per colture virali. Disponibili test per la diagnosi differenziale.