ANALISI DEL DNA Nuovi Metodi di Quantificazione in Real-Time PCR

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1 ANALISI DEL DNA Nuovi Metodi di Quantificazione in Real-Time PCR a cura del Prof. VILBERTO STOCCHI In questa introduzione evidenzierò alcuni aspetti significativi che hanno contributo al raggiungimento dei risultati che oggi verranno presentati. Qualche anno fa ci siamo posti il problema di come documentare in modo rigoroso, scientifico i benefici indotti dall esercizio fisico nella prevenzione delle malattie croniche moderne come l obesità, la sindrome metabolica, il diabete di tipo 2, l ipertensione, ecc (1). La valutazione dei benefici indotti dall esercizio fisico può essere fatta valutando diversi parametri. Per quanto riguarda i campioni biologici che possono essere utilizzati è possibile prelevare campioni di sangue, utilizzare le urine e la saliva ed eseguire biopsie muscolari. Il prelievo di sangue, l utilizzo delle urine e della saliva, in sostanza, non sono invasivi. Diverso è per la biopsia muscolare che richiede il ricorso all anestesia inoltre, secondo le indicazioni dei Comitati Etici delle Facoltà di Medicina o delle diverse Strutture Ospedaliere si può ricorrere all uso della biopsia muscolare per giustificati motivi diagnostici. Dall altra parte il muscolo scheletrico è il tessuto, direttamente coinvolto nel processo di conversione dell energia chimica in energia meccanica realizzando di fatto il movimento quindi, la cellula del muscolo scheletrico è direttamente coinvolta nelle modificazioni metaboliche e funzionali e rappresenta quindi un campione biologico importante. Nel 2007 è stato possibile pubblicare un nostro lavoro (2) in cui abbiamo dimostrato che utilizzando la metodologia dell ago aspirato, già utilizzata da diversi anni in ambito clinico-diagnostico, è possibile prelevare in modo sostanzialmente, non invasivo, e senza la necessità di ricorrere all anestesia - una quantità davvero minima di tessuto muscolare. Quantità minima - ma sufficiente - per ottenere un numero davvero significativo di informazioni a livello molecolare riguardanti la struttura e la funzione della cellula del muscolo scheletrico. In particolare, come biochimici abbiamo rivolto il nostro interesse ad una settantina di geni chiave, coinvolti nella biogenesi mitocondriale, in diverse vie metaboliche oltre alla possibilità determinare la quantità di DNA mitocondriale la cui integrità correla con lo stato di salute della persona. Per ottenere, queste informazioni, è stato necessario utilizzare metodi per l analisi del DNA che permettessero di farlo nel modo più accurato a partire da quantità minime di materiale biologico. I risultati di questo lavoro sono stati pubblicati nel 2007 dimostrando che l utilizzo della metodologia dell ago aspirato unita a metodi sensibili ed accurati per l analisi del DNA - permetteva di evitare la tradizionale biopsia

2 muscolare ed ottenere dalla minima quantità di tessuto prelevato un numero davvero significativo di informazioni riguardanti la condizione metabolica della cellula del muscolo scheletrico. Questo è stato possibile grazie ad una particolare attenzione rivolta ai metodi utilizzati nel quantificare gli acidi nucleici. Nel 2008 è stato possibile pubblicare su BMC bioinformatics (3) un nostro lavoro che ha trovato un significativo riscontro nella comunità scientifica internazionale. Infatti, in pochi giorni ha guadagnato l indicazione highly accessed e a tutt oggi il PDF è stato scaricato da altre 6250 colleghi. Questo ci ha spinto a fare qualche altro passo in avanti con la pubblicazione di un secondo lavoro nel 2010 (4) che ha ricevuto l interesse suscitato dal primo. Tuttavia, i risultati da noi ottenuti non sarebbero stati così facilmente fruibili dagli altri colleghi se non da parte di alcuni specialisti -. Questo ci ha stimolato a realizzare un sito web che permette a colleghi interessati - da ogni parte del mondo di inviare i propri file dati ottenuti con la proprie macchine di real time PCR e riottenerli processati entro 36 ore secondo la metodologia da noi sviluppata. Anche in questo caso siamo stati sorpresi dall interesse dei colleghi. Infatti, nell arco di un paio di mesi dalla realizzazione del sito WEB, oltre 4300 colleghi hanno visitato il sito e inviato i propri file dati. Solo un esempio dell interesse mostrato: un collega del National Institute of Health /National Cancer Institute ci ha inviato i file dati di oltre 1600 campioni e dopo aver confrontato i risultati ottenuti utilizzando anche altri metodi, ha deciso di adottare la metodologia da noi proposta che risulta particolarmente interessante, come verrà illustrato tra breve, soprattutto in condizioni di criticità. E stato quindi possibile realizzare un nuovo software applicativo, che di fatto rende fruibile il lavoro da noi svolto da parte di tutti i ricercatori interessati. E chiaro che il lavoro da noi svolto trova applicazione nei diversi ambiti della ricerca medico-biologica, ogni qualvolta che si rende necessario amplificare minime quantità di DNA per ulteriori studi. Per questo, abbiamo pensato - da subito - di renderlo disponibile a coloro che per compiti istituzionali ed esigenze investigative sono coinvolti in questo lavoro come la Polizia Scientifica e i RIS. Inoltre, abbiamo pensato di renderlo disponibile anche ad alcuni prestigiosi colleghi italiani, alcuni oggi qui presenti, oltre ai colleghi della nostra Università. Attualmente il sito WEB che abbiamo realizzato è open. Però, tenuto conto dei risultati che verranno presentati e del lavoro di ricerca in progress, stiamo valutando, alla luce anche di nuovi elementi che

3 derivano dall attività di ricerca di coprire il tutto con una procedura brevettuale. E chiaro il nostro impegno a rendere sempre disponibili alla Polizia Scientifica e ai RIS quelli che saranno i possibili miglioramenti che verranno apportati. Infine, vorrei sottolineare che il lavoro svolto ha richiesto un approccio necessariamente pluridisciplinare utilizzando competenze nell ambito biochimico e biologico molecolare, competenze nell ambito matematico-statistico e in quello informatico come tra l altro apparirà dagli interventi che seguiranno. REFERENCES 1. Handschin, C., and Spiegelman, M.B. The role of exercise and PGC1α in inflammation and chronic disease. Nature, , Guescini M., Fatone C., Stocchi L., Guidi C., Potenza L., Ditroilo M., Ranchelli A., Di Loreto C., Sisti D., De Feo P., Stocchi V. Fine needle aspiration coupled with real-time PCR: a painless methodology to study adaptive functional changes in skeletal muscle. Nutr Metab Cardiovasc Dis Jun;17(5): Epub 2007 May Guescini M., Sisti D., Rocchi M.B., Stocchi L., Stocchi V. A new real-time PCR method to overcome significant quantitative inaccuracy due to slight amplification inhibition. BMC Bioinformatics Jul 30;9: Sisti D., Guescini M., Rocchi M.B., Tibollo P., D'Atri M., Stocchi V. Shape based kinetic outlier detection in real-time PCR. BMC Bioinformatics Apr 12;11: Prof. Vilberto Stocchi Università degli Studi di Urbino "Carlo Bo" Dipartimento di Scienze Biomolecolari Via A. Saffi, Urbino - Italy

4 Dal metodo Ct al Cy0: nuove prospettive nella quantificazione degli acidi nucleici a cura del Dott. MICHELE GUESCINI Kary Mullis ricevette il Premio Nobel per la Chimica nel 1993 per l invenzione della PCR (Polymerase Chain Reaction, 1983). Dalla sua scoperta, la PCR ha rivoluzionato le metodologie d analisi del DNA diventando uno strumento insostituibile nelle diagnosi molecolari. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica che consente l amplificazione di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Questa procedura, ampiamente utilizzata in biologia molecolare, consente di ottenere molto rapidamente grandi quantità di materiale genetico necessarie per le successive applicazioni. La PCR è una metodica sensibile, in quanto permette di amplificare sequenze di DNA anche da una singola cellula, veloce (in circa un ora è possibile ottenere milioni di copie della sequenza target) ed altamente specifica perché in grado di amplificare in maniera selettiva la sequenza di interesse. Dall introduzione della PCR sono state sviluppate tante applicazioni, la real-time PCR è una di queste. Questa tecnica permette di quantificare le molecole di DNA in maniera straordinariamente semplice e precisa a partire da poche molecole di DNA (5-10 molecole). Questa tecnica basa sulla possibilità di misurare l accumulo dei prodotti di PCR in tempo reale durante tutti cicli della reazione. Grazie al suo elevato range di quantificazione e all alto grado di sensibilità, la real-time PCR è la tecnica di quantificazione del DNA più usata in medicina molecolare, nelle biotecnologie, microbiologia e diagnostica. Il metodo Gold standard utilizzato in real-time PCR è il metodo Ct che si basa sulla definizione di un livello di fluorescenza soglia scelto dall operatore in maniera tale da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale. Il valore Ct rappresenta il ciclo frazionario della reazione di amplificazione in cui il segnale della fluorescenza del campione interseca il valore soglia (1,2). Obiettivo di questo lavoro è stato sviluppare una nuova procedura per la quantificazione di acidi nucleici mediante la tecnica real-time PCR. Le strategia proposte permettono di superare le limitazioni dei metodi standard che richiedono uguale efficienza di amplificazione tra il campione sconosciuto e i campioni noti utilizzati per costruire la curva standard. Questo assunto è aspetto fondamentale nella quantificazione in real-time. Infatti i dati disponibili in letteratura riportano che una piccola differenza di efficienza di amplificazione tra i campioni da analizzare può condurre a significativi errori di quantificazione.

5 Nella strategia che proponiamo in questo studio (metodo Cy0), per la prima volta vengono combinate la stabilità e l affidabilità della curva standard con la possibilità di tener conto delle variazioni delle singole efficienze di reazione (3). Principali risultati ottenuti: Lavori precedenti hanno riportato che il metodo SCF (Sigmoidal Curve Fitting, (4,5)) è in grado di quantificare correttamente un campione di DNA senza il bisogno di conoscere a priori l efficienza della reazione di amplificazione. L efficacia del metodo SCF si basa sul fitting delle fluorescenze grezze in modo che le variazioni dei singoli campioni siano considerate durante l analisi. Sorprendentemente, i risultati riportati nel nostro studio dimostrano che l accuratezza e la precisione del metodo SCF era significativamente compromessa in presenza di diminuzione dell efficienza di reazione. Successivamente, abbiamo confrontato il metodo da noi proposto (Cy0) con il metodo gold standard Ct e con il metodo Cp (6), spesso usato in diagnostica molecolare. I risultati ottenuti dimostrano chiaramente che in condizioni di quantificazione ottimali questi tre metodi sono precisi e accurati in maniera comparabile. Tuttavia, in presenza di lieve inibizione dell amplificazione di PCR i metodi Ct e Cp risultano inefficienti mentre il metodo Cy0 fornisce risultati significativamente più accurati e precisi. In conclusione, il metodo Cy0 combina le metodologie della curva standard con una procedura di fitting al fine di superare il problema della determinazione dell efficienza della PCR nella quantificazione degli acidi nucleici mediante real-time PCR. I dati presentati dimostrano in maniera inequivocabile che il metodo Cy0 rappresenta un miglioramento significativo rispetto ai metodi attuali al fine di ottenere una quantificazione precisa e affidabile anche in presenza di condizioni di amplificazione non-ottimali.

6 REFERENCES 1. Livak, K. J. (1997) PE Applied Biosystems 2. Livak, K. J., and Schmittgen, T. D. (2001) Methods 25(4), Guescini, M., Sisti, D., Rocchi, M. B., Stocchi, L., and Stocchi, V. (2008) BMC bioinformatics 9, Goll, R., Olsen, T., Cui, G., and Florholmen, J. (2006) BMC bioinformatics 7, Rutledge, R. G. (2004) Nucleic Acids Res 32(22), e Wilhelm, J., Pingoud, A., and Hahn, M. (2003) Anal Biochem 317(2), Michele Guescini, PhD Università degli Studi di Urbino "Carlo Bo" Dipartimento di Scienze Biomolecolari Sezione di Scienze Motorie e della Salute Via I Maggetti, 26/2 (Loc Sasso) Urbino - Italy Tel Fax

7 Precisione ed accuratezza del metodo Cy0 a cura del Dott. DAVIDE SISTI L applicazione del metodo Ct richiede che l efficienza dei run della curva di calibrazione e dei campioni unknown non siano significativamente differenti. Quando le efficienze sono invece diverse, si ha che il Ct assume valori progressivamente maggiori al diminuire dell efficienza. L inibizione, che diminuisce il valore di efficienza, può essere presente in una reazione di amplificazione pcr, ed è uno dei più grossi problemi che si affrontano quando si lavora con campioni biologici. Infatti la quantificazione dipende esponenzialmente dal calcolo dell efficienza; peraltro nella comune pratica di laboratorio si assume a priori che l efficienza sia la medesima tra i run della curva standard e i campioni ma più di un autore ha mostrato che questo assunto molto spesso non è per nulla soddisfatto. Infatti l efficienza diminuisce a causa di molecole organiche chiamate genericamente inibitori che di solito vengono co-purificate durante il processo di estrazione degli acidi nucleici a partire da un campione biologico. L efficienza in una reazione di amplificazione pcr in realtà dipende da parecchi fattori: molecole organiche come l emoglobina, l urea, l eparina, i fenoli, il glicogeno, gli acidi grassi hanno un effetto inibitorio sulla efficienza. In letteratura sono presenti alcuni metodi che tentano di ovviare alla differente efficienza di amplificazione tra due campioni. Questi metodi portano nella pratica a risultati tra loro differenti aumentando in pratica la varianza della quantificazione. Proprio per questo alcuni anni fa Kubista e Bar hanno proposto un metodo (KOD; cioè kinetic outlier detection) di controllo di qualità della reazione di amplificazione. Essi, considerando il logaritmo delle fluorescenze, determinano la finestra di linearità e da questa calcolano l efficienza dell amplificazione. Dalle efficienze derivanti dai run della curva standard viene stimato l intervallo di confidenza dell efficienza. Un run non viene utilizzato, in quanto considerato outlier, quando la relativa efficienza non ricade all interno dell intervallo di confidenza. Il limite principale del KOD sta a monte, in quanto considera il valore dell efficienza non affetto da errore. In realtà a tutt oggi non è ancora stato univocamente accettato un metodo per il calcolo dell efficienza, in quanto essa non è un valore fisso, come si presuppone nelle premesse del metodo Ct, bensì è un valore ciclo dipendente. Esistono in letteratura vari metodi per il calcolo dell efficienza: metodi che derivano dalla serie della diluizione delle curve standard, modelli ad approssimazione esponenziale, logistica, multipla ed altri come riportati in diapositiva. Il metodo KOD si basa sull efficienza ottenuta da 3-5 valori di fluorescenza, considerando la pendenza dei logaritmi delle fluorescenze. Utilizzando invece i parametri che caratterizzano la funzione di Richards, specifici di una curva di amplificazione, abbiamo pensato non di calcolare l efficienza, bensì di parametrizzare l intera curva, ottenendo informazioni sulla relativa shape. L idea di base era quindi di non utilizzare il valore di

8 efficienza per il riconoscimento di outlier, bensì tre parametri di forma, cioè il valore di Plateau, la pendenza della tangente nel punto di flesso e l ordinata del flesso. Abbiamo quindi utilizzato l acido tannico, le IgG e la quercitina, tutti inibitori noti in real-time pcr. L aumento delle concentrazioni di acido tannico porta ad una diminuzione della fluorescenza massima con una diminuzione della pendenza ed una poco evidente asimmetria della curva di amplificazione; le quantificazioni ottenute utilizzando il metodo Ct fino ad una certa concentrazione ricadono nell intervallo di confidenza, mentre al di sopra le quantificazioni sono significativamente inaccurate. Andando a verificare l andamento dei parametri di forma si può qualitativamente verificare come i parametri di forma abbiano lo stesso andamento dell errore di quantificazione del metodo Ct. Infine l asimmetria delle curve aumenti all aumentare dell inibizione. L aggiunta di IgG fa sì che i parametri di forma si modifichino anche in questo caso progressivamente all aumentare dello specifico inibitore. Anche in questo caso ad alte concentrazioni le quantificazioni sono inaccurate mentre, l asimmetria è molto più marcata rispetto all aggiunta dell acido tannico. Infine l aggiunta di quercitina provoca una variazione negli indici di forma solo alle concentrazioni più elevate, mentre l asimmetria si mantiene sempre piuttosto bassa e non inibitore dipendente. Abbiamo quindi definito un indice per determinare gli outlier, cioè i run con accuratezza significativa, che non dipendesse dall efficienza, come il KOD, bensì dai parametri di forma. Per fare questo siamo ricorsi alla distanza di Mahalanobis (SOD, cioè shape outlier detection). Quindi il SOD non è altro che un valore che tiene conto contemporaneamente della variazione di forma di un run al netto delle correlazioni tra gli indici di forma. Il SOD riconosce correttamente quasi tutti i run che sono outlier, mentre il KOD ha una capacità di discriminazione più bassa. Infatti confrontando i risultati del KOD e del SOD, si trova che il SOD ha sempre una sensibilità maggiore del KOD in tutti i casi sperimentali, mentre la specificità del KOD e del SOD è uguale in presenza di IgG e di quercitina, mentre il SOD è anche più specifico del KOD qualora si sia in presenza di acido tannico. Come il Cy0 si comporta in presenza di inibitori? La quantificazione con Ct è, al di sopra di una certa concentrazione di inibitore, significativamente inaccurata, mentre le quantificazioni ottenute con il Cy0 rientrano sempre all interno dell intervallo di confidenza della quantificazione. È interessante notare come la funzione che lega la concentrazione del tannino all errore relativo sia di tipo logaritmico. Ciò implica che il metodo SPUD, utilizzato per minimizzare l effetto degli inibitori in questo caso specifico, non possa essere applicato, in quanto alla diluizione del campione non corrisponde la relativa lineare diminuzione dell effetto dell inibitore. Le quantificazioni in presenza di IgG e quercitina mostrano lo stesso effetto: il Cy0 quantifica sempre in maniera accurata laddove il metodo Ct risulta significativamente inaccurato.

9 Interessante notare come in questi casi l errore relativo nella quantificazione sia linearmente dipendente dalla concentrazione dell inibitore. Gli outlier possono essere meglio riconosciuti basandosi sul valore del SOD piuttosto che sul valore di efficienza (KOD). Il metodo Cy0 è un metodo di quantificazione che non richiede che le efficienze siano uguali tra i campioni standard e i campioni biologici; inoltre il Cy0 mostra una precisione simile a quella del Ct mentre il Cy0 è significativamente più accurato. -- Dott. Davide Sisti Università degli Studi di Urbino Dipartimento di Scienze della Terra, della Vita e dell'ambiente (DiSTeVA) Via Bramante Urbino (PU) ITALY Tel: 0722/ Fax: 0722/ Cell:

10 Presentazione del sito web Cy0team.uniurb.it A cura del Dott. RENATO PANEBIANCO E stata valutata l opportunità di rendere fruibili e visibili i risultati scientifici relativi alla quantificazione del DNA tramite l utilizzo del Cy0. Da qui la messa on line di un sito di cy0team.uniurb.it allo scopo da un lato di divulgare le specifiche del Cy0, dall altro di permetterne la valutazione on-line, con l ulteriore vantaggio di conseguire il know-how nello sviluppo del software Cy0. La creazione del sito cy0team.uniurb.it è stata preceduta dalla progettazione di un software che è compatibile con i principali formati dei dati prodotti dagli strumenti di real-time PCR, e permette quindi di calcolarne il Cy0. Si è provveduto alla realizzazione di pagine web con un formato che agevolasse la lettura del visitatore con una esposizione dei dati elaborati più fruibile, rispetto al formato pdf reperibile nei principali portali di divulgazione scientifica. La struttura di tali pagine è stata sviluppata secondo criteri SEO friendly (Search Engine Optimization), ovvero rispettando determinati requisiti di progettazione che le rendono interpretabili dagli automatismi dei motori di ricerca; inoltre ne sono stati sottoposti i contenuti (che rimangono il requisito principale) ai principali siti di riferimento del settore, il cui esito positivo ha avuto notevoli risultati sul page rank del sito, ovvero sul posizionamento nei motori di ricerca. Infine, è stata data ai visitatori del sito la possibilità di valutare il metodo proposto, previa registrazione a mezzo validazione dell indirizzo fornito. In pratica all utente viene richiesto di effettuare l upload dei file PCR dei quali si vuole stimare il Cy0. Tali file tramite l impiego di algoritmi combinati, vengono processati e restituiti in formato ExCel(.xls) con aggiunti i dati calcolati, il tutto entro 24 ore, se non in giornata. Va evidenziato come nei primi sei mesi di attività del sito, il feedback degli utenti è stato determinante al fine di migliorarne la funzionalità, ed i commenti sin qui raccolti costituiscono il principale supporto alla strategia intrapresa.

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