MORTE CELLULARE. Può essere di due tipi: NECROSI APOPTOSI. Sfumano tra di loro.

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1 MORTE CELLULARE. Può essere di due tipi: NECROSI APOPTOSI. Sfumano tra di loro. La necrosi è caratterizzata da un rigonfiamento cellulare perché alla base della necrosi c è sempre un alterazione delle pompe, per cui la cellula tende a rigonfiarsi e gli organuli intracellulari tendono a rigonfiarsi. A questo punto si hanno alterazioni di membrana ed alterazioni di enzimi che sciolgono le membrane che portano ad un disfacimento delle membrane e quindi della cellula. Uno dei caratteri distintivi della cellula morta, cioè necrotica, tenendo presente che la necrosi è il corrispettivo morfologico della morte cellulare, cioè le prime indicazioni che abbiamo del fatto che quella cellula è arrivata ad uno stato di irreversibilità. Non sappiamo l attimo fuggente in cui la cellula muore ma conosciamo il corrispettivo morfologico che rappresenta la morte cellulare. Come corrispettivo morfologico della necrosi, al microscopio elettronico vediamo i mitocondri rigonfi. Se voi trovate al microscopio elettronico una cellula con mitocondri rigonfi sapete che quella cellula è andata in necrosi, è morta. Invece nel fenomeno dell apoptosi anziché un rigonfiamento cellulare si ha una condensazione. Bisogna essere molto competenti per riuscire a coglierla. Invece noi possiamo cogliere che questa cellula si sedimenta dando luogo alla formazione dei corpi apoptotici, i quali sono componenti della cellula che sono stati segregati, sono frammenti di disgregazione della cellula. Questo fenomeno avviene per un iniziale invaginazione della membrana che poi arriva fino al nucleo e questi corpi apoptotici risultano contenere organuli cellulari. Questo fenomeno fino a pochi anni fa non era assolutamente conosciuto, malgrado avessimo studi di molti patologi, nessuno si era mai reso conto di questa possibilità di morte cellulare. Le cose o si conoscono o non si vedono!! Vi erano delle colture cellulari che quando avevano riempito la piastra, non si moltiplicavano più apparentemente, in queste piastre ci rendevamo conto che c erano delle vescicolette, siccome avevano la grandezza grosso modo di batteri,di muffe, si decideva che quella coltura era inquinata e si buttava senza pensare alla possibilità di morte cellulare. Poi ci fu qualcuno, particolarmente in gamba, che si rese conto che di fatto le cellule hanno questo potenziale replicativo definito e che il numero delle cellule è programmato sia nel senso della moltiplicazione, sia nel senso della morte cellulare. Cioè loro prendendo un vermetto di 945 cellule, quindi con poche cellule, si sono resero conto che le cellule continuavano a dividersi ma il vermetto era uguale, allora si misero a contare le cellule e videro che erano sempre 945, cioè il vermetto alla fine dello sviluppo aveva sempre 945 cellule, per cui si capì che per ogni cellula che si moltiplica un altra cellula muore. Si decise di chiamare questo meccanismo morte programmata. Pagina 1

2 Questo modo di morire delle cellule apoptotico non è solo frutto di un programma cellulare ma può essere indotto da stimoli cellulari. La definizione di apoptosi è quella di morte cellulare programmata. Con atteggiamento romantico hanno chiamato anche apoptosi come caduta via, come le foglie dagli alberi!! Un punto di distinzione tra necrosi ed apoptosi è che mentre la necrosi riguarda sempre un tessuto o una parte di tessuto, comunque gruppi di cellule, se mi brucio una parte dell organismo brucio un gruppo di cellule tutte insieme, l apoptosi riguarda singole cellule, così come il vermetto che doveva mantenere il suo numero di cellule, così come in altre situazioni ma avremo una cellula qua ed una cellula là che va incontro in apoptosi. Cosa si vede su un preparato istologico? Prima grandi istologi non se ne erano accorti perché nell ambito di un tessuto si vede una vescicoletta con qualcosa dentro ma non ci facevano caso perché pensavano che potesse essere dovuta al taglio che semplicemente aveva coinvolto un estroflessione, un prolungamento di un altra cellula per cui sotto c era una cellula grande e nella mia sezione ho una parte di questa cellula, mentre in realtà sono corpi apoptotici. Ci sono delle tecniche istologiche specifiche che ci permettono di individuare queste cellule che vanno incontro ad apoptosi. D altra parte uno dei motivi per cui questi corpi apoptotici non si vedono è che vengono immediatamente fagocitati. Certamente esiste anche una fagocitosi del tessuto necrotico, cioè delle cellule andate incontro a necrosi ma è qualcosa di molto grossolano. Bisogna infatti tener presente che la fagocitosi induce infiammazione: arrivo massiccio di cellule che saranno fondamentalmente granulociti e neutrofili che sciolgono tutto, ingeriscono tutto e ripuliscono questa zona andata in necrosi. Nel caso invece dell apoptosi la cosa è parcellizzata: corpo apoptotico per corpo apoptotico. Le cellule che fagocitano questi corpi apoptotici non sono solo i macrofagi tissutali anche perché in un tessuto normale di macrofagi tissutali ce ne sono pochi, invece la novità è che le cellule giustapposte sono in grado di fagocitare questi corpo apoptotici, quindi cellule parenchimali che sono indotte e sono capaci di fagocitare tali corpi apoptotici, per questo ci si giustifica del fatto che non si erano mai visti. Un ultimo punto da sottolineare è che come nel caso della necrosi c è l infiammazione che eliminerà i detriti, qui invece c è la fagocitosi da parte delle singole cellule ma l apoptosi non induce infiammazione, anche se tante cellule vanno incontro ad apoptosi non vi sarà induzione del fenomeno infiammatorio,non vi sarà arrivo di granulociti, non ci saranno nuovi monociti che vengono attivati. La meiosi?non lo so! Di tutta l apoptosi la domanda che faccio è questa: vi chiedo di ricordarvi la serie di esempi di apoptosi che danno senso a questo capitolo che è estremamente importante. LUCIDO Pagina 2

3 Esempi : Caernohabditis elegans (nematode di 945 cellule): perde 131 cellule durante la maturazione (= programma ontogenetico). Si erano individuati dei geni che favorivano e dei geni che inibivano l apooptosi. Se noi facciamo iperesprimere un dato gene riconosciamo l effetto di quel gene. Gene ced-3 e ced-4 ---apoptosi Gene ced sopravvivenza (Ced= caernohabditis elegans death, quindi geni di morte del caernohabditis elegans) Il corrispettivo umano del vermetto con il suo programma ontogenetico è rappresentato per esempio dalle cellule interdigitali dell abbozzo degli arti, cioè all inizio dell organogenesi noi abbiamo le mani con le dita attaccate poi subentra un fenomeno di apoptosi che ci stacca le dita una dalle altre. Embriogenesi- organogenesi: es. cellule interdigitali nell abbozzo degli arti. Sviluppo dopo la nascita: es. involuzione timica, eliminazione di cellule T autoreattività (via fas). In questo caso non c è un programma ontogenetico ma lo stimolo deve venire da fuori, allora noi riconosciamo il meccanismo che sarà quello fas ligand, cioè il fas è il recettore e qui stiamo parlando del ligando per questo recettore presente sulle cellule killer nei confronti dei nostri linfociti autoreattivi che permetterà l eliminazione di queste cellule che porterebbero ad una malattia autoimmune. Cicli fisiologici ed involuzione epitelio ghiandolare mammario e mucosa uterina in fase post- mestruale, oppure post- allattamento o post- gravidica. Noi conosciamo delle grossolane riduzioni di tessuto che avvengono via apoptosi. Qual è il meccanismo? Siamo di nuovo alla differenza tra necrosi ed apoptosi. Vi dicevo che la necrosi riguarda una grossa porzione di tessuto, tante cellule, in seguito a stimoli rilevanti, per esempio un ischemia grave, cioè si chiude una coronaria, avrò un infarto, avrò necrosi ischemica di una porzione di muscolo cardiaco. Invece nel caso dell apoptosi è semplicemente una variazione delle condizioni, per esempio una riduzione dei fattori di crescita rappresenta già uno stimolo sufficiente perché un certo numero di cellule decidano di andare in apoptosi. Altra possibilità fondamentale: una riduzione della tensione dell ossigeno non sufficiente per far andare il tessuto o la cellula in morte via necrosi, è uno stimolo sufficiente per far andare le cellule in apoptosi. Nel cuore ci sono delle zone in cui con istruzione di arteria coronaria, risultano relativamente ischemizzate in cui ci sono cellule che in continuazione vanno incontro ad apoptosi, questo è importante nel tempo perché ci porterà ad una perdita di tessuto cardiaco ci giustificherà uno scompenso cronico del cuore. Risposta immune Citotossicità di CTL ed NK nei confronti di: Pagina 3

4 cellule infettate da virus cellule allotipiche ( trapianti, graft vs host disease) cellule tumorali. Questo tipo di risposta personalizzata cellula per cellula avviene attraverso il meccaniso fas. Spegnimento della riposta immunitaria: quando viene a mancare lo stimolo la risposta immunitaria deve spegnersi, anche qui vengono ad esprimersi meccanismi precisi. linfonodi e milza: linfociti e plasmacellule di cloni precedentemente amplificati (via fas antigen) punto molto importante: linfociti in corso di terapia cortisonica. Questo ve lo sottolineo perché rende ragione di un osservazione che esisteva da 20anni, cioè che pazienti con terapia autoimmune, le alterazioni del sistema immunologico di fatto si curano con il cortisone, il cortisone di fatto è la panacea in tutte le allergie. Il problema era: se da una parte riduce l infiammazione ecc, come mai ha una capacità così generalizzata nei confronti di tutta la patologia autoimmune e la risposta sta qui, perchè il cortisone a dosi adatte risulta distruggere i linfociti in proliferazione e li manda in apoptosi pertanto qualsiasi paziente abbia una patologia autoimmune in cui c è un clone o più cloni di linfociti che si stanno moltiplicando ed autoreattivi, con un breve trattamento cortisonico ad alte dosi questi linfociti si eliminano. Noi questo stesso tipo di servizio lo possiamo fare alle leucemie linfatiche: noi abbiamo una crisi leucemica acuta in cui c è un aumento spropositato di linfociti in circolo( linfociti normali in circolo3000, in questo caso 80000) con una settimana di cortisone le eliminate ed è un ottima cura contro le leucemie. Pensate all artrite reumatoide. Cellule neoplastiche (spontanea ed effetti di chemioterapici) Vi ho detto che ci sono dei meccanismi per cui quando le condizioni non sono ottimali possono subentrare condizioni endogene alla cellula per cui, attraverso una serie di meccanismi queste cellule arriveranno all apoptosi. Comunque sia anche i chemioterapici agiscono inducendo l apoptosi nelle cellule tumorali. PMN invecchiati (in assenza di attivazione): limitazione del processo flogistico. C è la possibilità anche per alcuni virus di mandare le cellule in apoptosi- Miocardio, area perifrontale, ischemia moderata. Anche in condizioni di ischemia relativa ed abbassamento della pressione dell ossigeno è sufficiente perché un certo numero di cellule decida di andare in apoptosi. Per cui in un paziente in cui sappiamo che c è una patologia coronarica, che di per sé non indica assolutamente un intervento che potrebbe essere rischioso, allora Pagina 4

5 gli diremo di fare molto movimento in maniera tale che si crei nel tessuto cardiaco un ischemia, che induce un abbassamento del ph che è il migliore stimolo per una proliferazione capillare da una parte, ma dall altra gli dirò no, stai fermo perché se il tuo cuore si trova nelle aree di relativa ischemia in condizioni di miglioramento e peggiori( non si capisce bene la registrazione in questo punto!!)so che molto delle tue cellule andranno incontro ad apoptosi. Dunque una relativa ischemia fa perdere tessuto ed infatti noi sappiamo che nel paziente con scompenso cronico si ha un progressivo assottigliamento del cuore. Vedrete che i pazienti con cardiomiopatie ipertrofiche hanno un cuore ingrossato ma anche il paziente con cuore ingrossato alla lunga, ha perdita cellulare e quindi perdita di tessuto. Questo vuol dire progredire verso la morte, verso lo scompenso terminale per perdita cellulare, per apoptosi. D altra parte noi sappiamo anche che l ipossia ed in particolare l ipoglicemia indurrà la produzione di fattori di crescita, in particolare VEGF che infiammerà e determinerà replicazioni di endotelio che formerà i capillari sanguigni. Certamente sarà inadatto che il paziente cardiopatico compia degli sforzi intensi, è più adatto che compia un attività fisica regolare che in qualche modo stimoli questi vasi sanguigni, perde qualche cellula ma magari nel frattempo ci sarà una migliore irrorazione di quelle che rimangono e comunque anche una rigenerazione che sappiamo è possibile anche nel cuore. Tessuti segregati. Voi sapete che ci sono dei tessuti che sono estranei al sistema immunitari. Perché sono segregati? Perché il nostro sistema immunitario non controlla questi tessuti? Perché come arriva un linfocita si attacca, trova il fas ligande e attraverso questo recettore fas, che è un recettore di morte, va incontro ad apoptosi. Per cui hanno l antidoto come il sistema immunitario. DAL PUNTO DI VISTA MOLECOLARE. Nell apoptosi ci sono 4 fasi: STIMOLAZIONE REGOLAZIONE ESECUZIONE EFFEROCITOSI. Disegno dal Robins pag.29 Stimolazione: vedremo una serie di possibilità di induzione dell apoptosi. Poi abbiamo una serie di meccanismi di regolazione ed a questo punto troviamo il Bcl2 che è il corrispondente del ced-9, cioè quel tipo di meccanismo che proteggeva dall apoptosi, invece bax e bat la favoriscono. Poi abbiamo dei meccanismi di esecuzione, si tratta di quei meccanismi che sedimentano il nucleo e portano alla formazione dei corpi apoptotici. Possiamo anche descrivere il meccanismo dell efferocitosi. Efferocitosi è un modo complicato per esprimere la fagocitosi da parte delle cellule circostanti però chi ha studiato il meccanismo lo ha paragonato al funerale dei corpi apoptotici, per cui Pagina 5

6 efferocitosi ricorda fero, cioè portare la bara alla cellula che poi dovrà eliminare definitivamente questi corpi apoptotici. Qui si mostra come, per esempio, il TGF beta1, prodotto dai macrofagi, blocca questa possibilità di fagocitosi dei corpi apoptotici. Si sono individuate delle patologie in cui questi corpo apoptotici restano nel tessuto. Vediamo singolarmente questi meccanismi. Radiazioni, tossine, radicali liberi quindi per ossidazioni cellulari in genere, ossido nitrico e tutte quelle cose che causano danno perossidativo nei confronti della cellula, che arrivano a produrre un danno al DNA. Il danneggiamento del Dna ha dei meccanismi che lo riconosce,tipo l ATM che poi attiverà la p53 e sarà la p53 che indurrà l apoptosi, così come si era intuito nel disegno sulla senescenza. Intrinsical embriogenic segnal. Qui parla di vera e propria morte programmata, sono dei geni che ad un certo punto si attivano ed inducono l attivazione dei meccanismi di apoptosi. Dall esterno troviamo, come fattore esogeno, min17:30 un allontanamento di fattori di crescita oppure ormoni. Unitamente al fatto che calino i fattori di crescita, oppure che calino gli ormoni sarà uno stimolo sufficiente per indurre quella cellula ad andare incontro ad apoptosi ed agiranno attraverso il meccanismo mitocondriale. Reception legand interaction, cioè fas legand: il fas sarebbe il recettore ed il fas legand sarebbe il contro-recettore. Allo stesso identico modo agisce il TNF. Anche il recettore per il TNF di fatto è un fas, si può comportare come fas. Il tumor necrosis factors adesso lo riconosciamo come un fattore infiammatori ma inizialmente era stato descritto come un fattore di necrosi tumorale, cioè aggiunta di TNF in una coltura di cellule tumorali si vedeve che questa coltura moriva. In effetti è un onduttore di apooptosi. D altra parte vedremo che si comporta anche come un interleuchina, ha il nome sbagliato, altrimenti si chiamerebbe interleuchina 1 e mezzo perché è uguale all interleuchina 1 come effetti. Quando determina attivazione cellulare in senso infiammatorio e quando invece necrosi? Dipende dallo costimolazione: in presenza di un costiamolo di un tipo indurrà apoptosi, in presenza di un altro costiamolo indurrà infiammazione. Poi anche le cellule citotossiche, i linfociti T citotossici, agiscono attraverso due meccanismi: attraverso il fase ed attraverso un meccanismo perforinico che determina l introduzione del granzime B che a sua volta attiva l apoptosi. Quali sono i meccanismi dell apoptosi? Si chiamano caspasi. Conosciamo due gruppi di caspasi: caspasi induttrici caspasi esecutrici. Se noi adesso più modernamente, volessimo sincerarci della presenza o meno dell apoptosi in un preparato istologico, poiché la caspasi più importante è la caspasi Pagina 6

7 3, il fatto di trovare un attivazione della caspasi 3 che è una caspasi esecutrice ci dice che quella cellula sta andando in apoptosi, per cui noi dobbiamo fare una banalissima immunoistochimica con anticorpi anti-caspasi3 attiva e individuiamo tutte le cellule che stanno andando incontro ad apoptosi. Per quanto riguarda il meccanismo la caspasi 3 attiva delle endonucleasi, cioè degli enzimi che rompono il DNA e caratteristicamente li rompono in frammenti di 200 paia di basi. Se io ho questo meccanismo che rompe il DNA in 200 paia di basi, se questo meccanismo procede avrò dei frammenti che sono di 200 paia di basi ma altri che non sono ancora stati completamente digeriti per cui, invece di essere frammenti di 200 paia di basi, sono frammenti di 400 paia di basi, di 800 paia di basi, sempre a scalare. Se io faccio un elettroforesi di questo DNA, di queste cellule che sono andate incontro ad apoptosi, mi si formerà una cosiddetta scala cromatinica, per cui avrò una serie di frammenti, regolarmente uno la metà dell altro, dividibili per 200. se invece, in quel tessuto che sto analizzando fosse intervenuta una necrosi che rompe il DNA in maniera indifferente, con altri tipi di endonucleasi, avrà un unica macchia con tutti i pesi molecolari possibili. La scala cromatinica è un modo per mettermi in evidenza l apoptosi nel tessuto. Peraltro se io ho che in queste cellule agisce un endonucleasi che mi rompe il nucleo posso fare la TUNEL che è una prova per far vedere l apoptosi. (Il prof non ricorda la traduzione di tunel.) La tunel mette in evidenza dei frammenti di cromosomi, è una reazione particolare che riesce ad evidenziare le rotture cromosomiche ed allora posso usare questa tecnica per dire se c è apoptosi. È una tecnica istologica che mi rileva questa frammentazione del materiale nucleare. Avrò una cellula vicina con il suo nucleo intatto che viene negativa, invece la cellula apooptotica, notate bene che è già avvenuta la endonucleasi per cui la cellula è già in una fase irreversibile ed è apoptotica,è una cellula tunel positiva. Immagine dal Robins pag. 30 fig Passaggio che lega il fas, che attiva la caspasi 8 che è una caspasi di induzione, la quale va ad agire sui mitocondri ed attiva dei prodotti del gene bibo, bax ecc che saranno propri dei corpi apoptotici, la morale è che i mitocondri quando sono attivati in maniera precisa, rilasciano citocromo c, il quale attiva la caspasi 9, la quale poi potrà attivare la caspasi. Allora abbiamo due possibilità: che la caspasi 8 attivata dal fas attivi direttamente la caspasi3, oppure passi attraverso questa regolazione mitocondriale che attiva la caspasi 9, poi la caspasi3 attraverso il rilascio di citocromo c. p53 agisce anche attraverso questa via, cioè il rilascio del citocromo c. Il TNF può sia attivare la caspasi 8 e quindi portare all apoptosi o rispettivamente invece attivare una NFKB che sarà quella che attiva la cellula, ma questo dipenderà dalla possibilità di una costimolazione. Figura pag.30 n Fissate nella memoria che dai mitocondri esce il citocromo c. Pagina 7

8 Si vede il mitocondrio con la membrana mitondriale. Novità : il citocromo c che normalmente sta nei mitocondri, quando c è uno stimolo apoptotico viene rilasciato dai mitocondri. Molto importante è il bcl2 che avevamo definito prima un meccanismo antiapoptotico, il prodotto del gene bcl2 blocca la fuoriuscita di citocromo dai mitocondri, per cui non si può attivare la caspasi 9. se questo bcl2 è iperespresso, dal momento che da questo meccanismo dipendeva anche il danno mitocondriale, quello su cui agiva la p53, lui vanifica tutto il lavoro della p53 e quindi rappresenta un meccanismo protumorale, proneoplastico e ci sono dei tumori che dipendono da questo polimorfismo, da quest alterazione genica da bcl2 che praticamente blocca l apoptosi. Allora la cellula che ha tutti i mitocondri rotti, alterati ma ha questo bcl2 attivato è una cellula che continua a sopravvivere fino a moltiplicarsi. Pagina 8