Indice. Parte I L uso industriale dei microrganismi. Storia e campi di applicazione (Giancarlo Lancini) Prefazione

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1 IX Indice Prefazione Parte I L uso industriale dei microrganismi Cap. 1 Storia e campi di applicazione (Giancarlo Lancini) 1.1 Le origini Le premesse scientifiche Le fermentazioni anaerobiche L evoluzione delle fermentazioni artigianali in fermentazioni industriali Fermentazioni anaerobiche innovative Le fermentazioni aerobiche Lieviti Produzione di acidi inorganici Vitamine Biotrasformazione degli steroidi Metaboliti secondari Antibiotici La ricerca sistematica di nuovi antibiotici (screening) L evoluzione del processo di screening Il miglioramento dei processi di produzione degli antibiotici Ingegneria genetica Il panorama attuale Metaboliti secondari Acidi organici Aminoacidi Vitamine Enzimi Farmaci da DNA ricombinante Etanolo 32 Letture consigliate 32 XIX

2 X ISBN Parte II I microrganismi di interesse biotecnologico Cap. 2 Escherichia coli (Gianni Dehò) 2.1 Introduzione L organismo modello L organismo reale: stili di vita, metabolismo, struttura cellulare L organismo virtuale Gli strumenti che hanno permesso la rivoluzione biotecnologica Gli strumenti genetici Gli strumenti epigenetici: modificazione e restrizione La clonazione molecolare Obiettivi e strategie Gli strumenti Produzione di beni e servizi Produzione di metaboliti E. coli in laboratorio 62 Letture consigliate 67 Cap. 3 Cap. 4 Streptomyces (Anna Maria Puglia, Rosa Alduina) 3.1 Introduzione Il genoma degli streptomiceti Differenziamento morfologico di Streptomyces Regolazione della biosintesi degli antibiotici Regolatori pathway-specifici e pleiotropici Segnali extracellulari Influenza dei nutrienti Quadro generale Applicazioni biotecnologiche Manipolazione genetica Produzione di proteine eterologhe 88 Letture consigliate 89 Bacillus (Alessandra Albertini) 4.1 Le specie di Bacillus e il loro ciclo vitale Genetica e genomica Il sistema di secrezione Differenziamento e sporificazione Gli enzimi extracellulari di interesse commerciale prodotti da Bacillus 105 Box 4.1 La raffinata regolazione dell espressione genica durante la sporificazione di B. subtilis Prodotti del metabolismo primario di Bacillus di interesse industriale Insetticidi e tossine entomopatogene di Bacillus Antibiotici prodotti da Bacillus Espressione di proteine eterologhe in Bacillus 120 Conclusioni 126 Letture consiglite 126

3 XI Cap. 5 Cap. 6 Lieviti (Laura Frontali) 5.1 Introduzione Il lievito nella storia della biologia Cenni di morfologia e tassonomia del lievito 129 Box 5.1 Forme miceliari dei lieviti e loro importanza 130 Box 5.2 Identificazione dei lieviti in base al cariotipo per elettroforesi pulsata Genetica e genomica di S. cerevisiae Genetica molecolare del lievito 136 Box 5.3 Il trascrittoma di lievito 139 Box 5.4 La metodologia del doppio ibrido Il lievito come modello Altri lieviti di importanza industriale I lieviti nelle produzioni industriali attuali La produzione di bevande alcoliche Nuove prospettive nella produzione di bioetanolo I lieviti nella produzione di proteine ricombinanti 145 Letture consigliate 147 Funghi filamentosi (Giovanna Cristina Varese, Antonella Anastasi, Valeria Prigione) 6.1 Inquadramento sistematico 151 Box 6.1 Principali caratteristiche dei phyla fungini Caratteristiche morfologiche dei funghi filamentosi Esigenze nutrizionali e parametri ambientali La riproduzione nei funghi Genetica e genomica Trasformazione e manipolazione genica 160 Box 6.2 Principali tecniche per la trasformazione dei funghi filamentosi Micologia industriale: le principali applicazioni biotecnologiche dei funghi filamentosi 162 Box 6.3 Le micoproteine Acidi inorganici Vitamine Enzimi Antibiotici Antifungini Immusoppressori Ipocolesterolemici Alcaloidi Altri metaboliti di interesse terapeutico Fitormoni Pigmenti Bioconversioni Produzione di aromi 178 Conclusioni 179 Letture consigliate 179

4 XII ISBN Parte III Le basi molecolari dei processi produttivi Cap. 7 Metaboliti primari (Concetta Compagno, Ermenegilda Parrilli, Gennaro Marino) 7.1 Introduzione 185 Box 7.1 Fonti di carbonio e loro trattamento per la produzione industriale Esempio di produzione di metaboliti a due atomi di carbonio: etanolo Aspetti microbiologici Aspetti metabolici e regolativi 190 Box 7.2 Effetto Crabtree Processo industriale Esempio di produzione di metaboliti a tre atomi di carbonio: acido lattico Aspetti microbiologici e metabolici 196 Box 7.3 Nuove applicazioni dell acido lattico Processo industriale Esempio di produzione di metaboliti a quattro atomi di carbonio: butanolo 198 Box 7.4 Un esempio di ingeneria metabolica: la produzione di acido lattico in Saccharomyces cerevisiae Aspetti metabolici e biochimici 200 Box 7.5 La scissione fosforoclastica Processo industriale Esempio di produzione di metaboliti a cinque atomi di carbonio: acido glutammico Aspetti microbiologici e metabolici Processo industriale Esempio di produzione di metaboliti a sei atomi di carbonio: lisina Aspetti microbiologici e metabolici Esempio di produzione di metaboliti a sei atomi di carbonio: acido citrico Aspetti microbiologici e metabolici 212 Conclusioni 215 Letture consigliate 215 Cap. 8 Antibiotici (Margherita Sosio) 8.1 Metaboliti secondari e microrganismi produttori Diversità chimica e classi strutturali Vie biosintetiche 223 Box 8.1 Principali classi strutturali di antibatterici Sintesi di monomeri specializzati Polichetidi e polichetidi sintasi Oligopeptidi e NRPS Sistemi ibridi PKS-NRPS Oligopeptidi di origine ribosomale Oligosaccaridi e terpeni Principali reazioni di decorazione Manipolazione delle vie biosintetiche 250 Letture consigliate 256

5 XIII Cap. 9 Biotrasformazioni (Francesco Molinari, Maurizio Ruzzi) 9.1 Definizioni e caratteristiche Vantaggi e svantaggi: miti e realtà Applicazioni Tecniche di biotrasformazione Miglioramento di biotrasformazioni Selezione e miglioramento di biocatalizzatori Ingegneria di reazione Classi di enzimi e biotrasformazioni Idrolasi Ossidoreduttasi Formazione di legami carbonio-carbonio: decarbossilasi e aldolasi Applicazioni industriali Modificazioni di steroidi e steroli Produzione di aminoacidi Produzione di sciroppi di fruttosio Produzione di L-carnitina Produzione di acrilamide 295 Letture consigliate 296 Cap. 10 Proteine ricombinanti (Maria Luisa Tutino) 10.1 Introduzione 297 Box 10.1 Il folding delle proteine ricombinanti: una sfida produttiva per le fabbriche cellulari La produzione ricombinante di proteine nel panorama delle moderne biotecnologie: i principali prodotti e la dimensione del mercato mondiale I criteri per la scelta del sistema di espressione più opportuno: la centralità del prodotto ricombinante La scelta dell ospite della produzione ricombinante La scelta del sistema genetico di espressione più conveniente 308 Box 10.2 Il problema della stabilità genetica dei cloni ricombinanti e i sistemi autoselezionanti La scelta della modalità di processo Alcuni esempi di produzione ricombinante di proteine di interesse industriale L insulina L antigene di superficie del virus dell epatite B Prospettive nel panorama della produzione ricombinante di proteine 321 Letture consigliate 322 Cap. 11 Vaccini (Laura Serino, Mariagrazia Pizza) 11.1 Cenni storici I principi immunologici Vaccini convenzionali Vaccini uccisi o inattivati Vaccini vivi attenuati 325

6 XIV ISBN Vaccini a subunità Vaccini ricombinanti Vaccini ricombinanti virali Vaccini ricombinanti batterici Vaccini vivi attenuati geneticamente Vaccini commestibili Vaccini nell era post-genomica La reverse vaccinology Vaccini a DNA Vaccini sintetici Aspetti clinici e normativi 338 Letture consigliate 339 Parte IV Ricerca e sviluppo nei processi industriali Cap. 12 Screening (Stefano Donadio) 12.1 Introduzione L approccio di screening Terminologia Strategia Screening e HTS Costi e probabilità Componenti dello screening Library Test e validazione 356 Box 12.1 Validazione analitica di un test Automazione Gestione dati Esempi di screening Ricerca di nuovi microrganismi Ricerca di nuovi enzimi Ricerca di nuove molecole Ricerca di ceppi alto-produttori Prospettive 375 Letture consigliate 376 Cap. 13 Metodi di coltivazione dei microrganismi (Rosario Bruno Lo Curto) 13.1 Introduzione La curva di sviluppo 378 Box 13.1 L espressione matematica della velocità di sviluppo Fermentazione discontinua o batch Cinetica di sviluppo della biomassa in batch Rapporto tra concentrazione del substrato e velocità di sviluppo 383 Box 13.2 La velocità di sviluppo µ dipende dalla concentrazione di S 385 Box 13.3 L espressione matematica della produttività specifica q p 386

7 XV Box 13.4 L espressione matematica della velocità specifica di consumo del substrato 387 Box 13.5 Il significato di velocità specifica di consumo del substrato 387 Box 13.6 Relazioni caratteristiche della fermentazione batch Fermentazione continua 389 Box 13.7 La velocità di sviluppo e il fattore limitante nel processo continuo 393 Box 13.8 Un esempio di coltura continua 396 Box 13.9 Parametri cinetici del processo continuo 397 Box Relazioni caratteristiche della fermentazione continua 399 Box Vantaggi e svantaggi del processo continuo rispetto al batch 401 Box La coltura continua a cascata Fermentazione fed-batch 401 Box Vantaggi e svantaggi del fed-batch rispetto al continuo 407 Box Il fed-batch nella produzione di antibiotici 408 Letture consigliate 410 Cap. 14 Recupero di prodotti biotecnologici (Attilio Converti) 14.1 Introduzione Chiarificazione Sedimentazione/flocculazione 415 Box 14.1 Principali equazioni che descrivono i processi di sedimentazione e di centrifugazione Centrifugazione Filtrazione convenzionale 418 Box 14.2 Principali equazioni che descrivono il processo di filtrazione Flottazione Disintegrazione cellulare Metodi enzimatici Metodi meccanici 423 Box 14.3 Principali equazioni che descrivono i processi di rottura cellulare mediante omogeneizzazione e di precipitazione delle proteine Precipitazione Processi a membrana Dialisi Microfiltrazione, ultrafiltrazione e osmosi inversa Filtrazione tangenziale 428 Box 14.4 Principali equazioni che descrivono il processo di filtrazione tangenziale Elettrodialisi Estrazione liquido-liquido 430 Box 14.5 Principali equazioni che descrivono i processi di estrazione liquido-liquido, i processi cromatografici e l elettroforesi Evaporazione Distillazione Processi cromatografici Gelfiltrazione Cromatografia a scambio ionico 437

8 XVI ISBN Cromatografia di adsorbimento Interazione idrofobica Cromatografia di affinità 438 Box 14.6 Case study: la cromatografia di affinità Metodi analitici Trattamenti finali Essiccamento Liofilizzazione Cristallizzazione Processo integrato di purificazione e considerazioni conclusive 444 Letture consigliate 445 Cap. 15 Il miglioramento dei processi produttivi (Claudio Falcone, Cristina Mazzoni) 15.1 Il miglioramento dei ceppi I metodi non-ricombinanti I metodi ricombinanti I metodi omici (system biotechnology) 457 Box 15.1 Esempi di miglioramenti di processi produttivi Il miglioramento del terreno di coltura I metodi statistici Il controllo e l ottimizzazione del processo produttivo Modalità operative Controllo del processo 469 Box 15.2 Produzione di vaccini antitumorali in bioreattore a fibre cave L ottimizzazione del downstream Ingegneria genetica e downstream Operazioni legate alla fermentazione Fermentazioni e ambiente Sicurezza delle fermentazioni e dei prodotti 479 Letture consigliate 480 Cap. 16 Il processo industriale (Maddalena Rossi, Alberto Amaretti) 16.1 Il bioreattore e il processo fermentativo Fermentatori ad agitazione meccanica Fermentatori ad agitazione pneumatica Lo scale-up Formulazione del terreno L ossigeno come nutrilita delle colture aerobiche La sterilità La produzione di calore Esempi di processo Produzione di acido citrico Produzione di penicillina Produzione di una proteina eterologa con Pichia pastoris 507 Letture consigliate 511

9 XVII Parte V Il mercato Cap. 17 Mercato e nuova imprenditorialità nelle biotecnologie (Roberto Vona, Nadia Di Paola) 17.1 Le dinamiche competitive nel settore delle biotecnologie La struttura del settore Le biotecnologie bianche Scenari competitivi e strategie emergenti Imprenditorialità e managerialità nel settore delle biotecnologie Saperi scientifici e visione strategica dell impresa Lo sviluppo del business nel settore delle biotecnologie Competizione e marketing management Il finanziamento dell impresa 525 Letture consigliate 527 Glossario 529 Indice analitico 537 Appendice tavole a colori 545