FOSFORO fosfati minerali

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1 FASI DI UN PROCESSO FERMENTATIVO I microrganismi vengono coltivati industrialmente per ottenere: prodotto, sia metabolita 1 che 2 ( etanolo, acido citrico, penicillina..) o un metabolita primario si forma nel corso dei processi che permettono alla cellula di accrescersi e riprodursi. Esso si accumula contemporaneamente alle cellule e la sua produzione declina nella fase stazionaria o un metabolita secondario si forma nel corso dei processi di metabolismo collaterale non indispensabili alla vita. Si accumula in ritardo rispetto alla fase esponenziale e raggiunge il massimo nella fase stazionaria. biomassa ( SCP, lievito per panificatori..) consumo di substrato ( depurazione dei reflui ) bioconversione (steroidi ) MATERIE PRIME Devono fornire tutti gli elementi necessari alla crescita dei microrganismi rispettando alcuni requisiti: Disponibilità in continuo per l intero periodo di produzione Facile reperibilità e bassi costi di trasporto Trattamenti non complessi Buona conversione nel prodotto Devono rappresentare una buona fonte di: Carbonio Azoto Fosforo Oligoelementi Fattori di crescita TRATTAMENTI SULLE MATERIE PRIME Si rendono necessari quando le materie prime: Non possono essere direttamente metabolizzate dalle cellule ( pochi microrganismi possiedono la cellulasi, i lieviti non assimilano l amido ) Devono essere corrette nella composizione e nello stato fisico ( ph, aggiunta di glucosio..) Devono trovarsi in un ambiente ottimale per le cellule ( temperatura, pressione osmotica..) Devono essere integrate da fattori nutritivi ( precursori, induttori, inibitori) FONTI di SUBSTRATO MATERIA PRIMA PRETRATTAMENTO CARBONIO glucosio cereali Macinazione melasso Inversione, acidificazione amido Cottura e idrolisi cellulosa Macinazione, cottura idrolisi lipidi Oli vegetali idrocarburi petrolio Distillazione frazionata AZOTO proteine Soia, pesce, semi, Macinazione CSL (corn steep liquor) Scarti macellazione, latte ammoniaca Ammoniaca e ammonioderivati nitrato nitrati FOSFORO fosfati minerali PREPARAZIONE DEL NUTRILITA Consiste nel miscelare opportunamente i vari componenti controllando le condizioni fisiche (temperatura, ph, aerazione) del terreno, aggiungendo eventuali fattori nutritivi e eliminando eventuali componenti dannosi (metalli.) STERILIZZAZIONE Il processo serve per eliminare i microrganismi estranei alla produzione, sia per evitare microbi potenzialmente pericolosi sia per evitare perdite nella produzione ( rese più basse ). Nei processi industriali si parla di sterilizzazione anche quando in realtà si tratta di ridurre al massimo la flora contaminante. E un punto particolarmente delicato e costoso del processo industriale. Devono essere sterilizzati: Le materie prime Il fermentatore L aria 1

2 Si effettua tramite mezzi fisici: Filtrazione su filtri di lana di vetro o di materiali polimerici che trattengono particelle con diametro > 0,2 µm; si usa per l aria e per componenti termolabili dei terreni. Calore umido sia a pressione atmosferica ( vapore fluente) sia in sovrapressione. La sterilizzazione delle materie prime o del terreno si può fare in discontinuo ( 120 C per 20 ) o in continuo ( C per 2-3 ) il sistema in continuo è preferito perché meno costoso e meno dannoso per il terreno. Il vapore può essere somministrato direttamente nel terreno (rischio di diluizione eccessiva e di schiumeggiamento) o tramite tubi o piastre scambiatori di calore CEPPO SELVAGGIO (wild type) Per ceppo si intende l insieme di cellule omogenee o clone derivante dalla riproduzione di un unica cellula iniziale. Ceppo selvaggio è il clone di cellule reperite in natura. ISOLAMENTO Consiste in più fasi denominate: Screening 1 Insieme di operazioni atte a isolare un microrganismo di interesse industriale e a esprimere una valutazione sommaria sul funzionamento e sulle attività delle sostanze prodotte. La ricerca di un microrganismo utile si può fare: - isolamento in coltura pura di specie provenienti da ambienti naturali in cui si è già verificata una selezione naturale ; ad esempio m.o. di interesse alimentare isolati da alimenti o assimilatori di idrocarburi in terreni contenenti petrolio. - isolamento in coltura pura di specie provenienti da ogni tipo di ambiente naturale; è una ricerca a tappeto usata per individuare produttori di antibiotici. - ricorso alle collezioni internazionali, vere e proprie biblioteche di tutti i microrganismi conosciuti. Una volta isolato il m.o. si procede ad una coltivazione in presenza di altri microrganismi-test, valutando se la crescita di questi ultimi è rallentata ( probabile produttore di antibiotici) o aumentata ( probabile produttore di fattori di crescita). Microrganismo test = può essere un batterio, lievito, muffa.; possibilmente aerobio, geneticamente stabile, di rapida crescita. Screening 2 Insieme di operazioni atte ad appurare se il microrganismo ha un effettivo interesse industriale. E un processo molto lungo che prevede: -identificazione del microrganismo -identificazione delle sostanze prodotte siano esse già note o sconosciute. Se le sostanze prodotte sono già note è necessario valutare se la produttività del ceppo è migliore di quella dei ceppi già conosciuti. Se le sostanze prodotte sono sconosciute è necessario procedere al riconoscimento ed analisi del prodotto di fermentazione cioè: -analisi chimica -analisi tossicologica -analisi farmacologia -analisi dei parametri di crescita, in impianto pilota per definire temperatura, ph, po 2., efficienza di resa del prodotto. Se la produttività è troppo bassa è frequente ricorrere ad un programma di mutazione genetica. SELEZIONE o RICOMBINAZIONE Serve per migliorare la produttività di un ceppo o per introdurre nuovi geni. Si può fare sottoponendo il m.o. ad agenti mutageni e selezionando solo quei m.o. che abbiano assunto ( casualmente) le caratteristiche volute oppure introducendo i geni desiderati tramite la tecnica del DNA ricombinate. Cenni sulla tecnica del DNA ricombinante: 1. produzione del gene; si può fare per sintesi dal relativo mrna tramite la trascrittasi inversa oppure per isolamento dal DNA tramite gli enzimi di restrizione e successiva amplificazione tramite PCR 2. purificazione del gene; aggiunta di eventuali marcatori 3. scelta del vettore per il gene; generalmente plasmidi o fagi 4. inserimento del gene nel vettore; il gene, grazie a enzimi di restrizione e a DNA ligasi, viene inserito nel DNA del vettore formando un DNAr (ricombinante) 5. introduzione del DNAr nella cellula ospite; si effettua per trasformazione se è un plasmide, per trasduzione se è un fago 6. selezione delle cellule mutate e loro clonazione Se il microrganismo ha superato tutti i test e risponde ai requisiti di : stabilità genetica facile sporulazione possibilmente anaerobio facoltativo alta produttività si può passare alla produzione industriale. 2

3 Conservazione delle colture pure. Ogni laboratorio mantiene una collezione di colture pure per le proprie necessità detta collezione di stock colture ; devono mantenersi vive e stabili per molti anni. Possono essere conservate per: - ricoprimento con olio minerale sia su brodi che slant; tenute in frigo si mantengono fino a anni. - liofilizzazione; si mantengono per più di 20 anni, consentono di risparmiare spazio però si ha una discreta mortalità all atto della liofilizzazione. - congelamento in N 2 liquido; richiede l aggiunta al terreno di una sostanza protettiva ( glicole o DMSO ); ottima conservabilità - conservazione su terra per funghi o muffe; si prepara un terreno con terra, sabbia, CaCO 3 ; si inocula e si conserva sottovuoto anche 20 anni. Per i cicli produttivi si usano le working stock cioè colture su agar, mantenute in frigo a 0-4 C e rinnovate di frequente. SCALE UP Insieme di operazioni necessarie per preparare un inoculo per fermentatori industriali partendo da colture working stock. Si opera in diverse fasi: - si riattiva il ceppo working stock in modo da avere colonie in fase log ( su piastra ) - si inoculano queste colonie in molte beute ( su brodo) e si mettono a incubare - si inocula il contenuto delle beute in una grossa beuta ( su brodo ) e si mette a incubare - con passaggi successivi si arriva a preparare l inoculo per il fermentatore industriale. Si intende per livello di inoculo quel volume di sospensione di microrganismi che si deve prelevare da un fermentatore più piccolo per inoculare in un recipiente più grande. Può variare molto, mediamente dal 5 al 10 % del volume utile del fermentatore; il volume utile è circa 2\3 del volume totale. In alcuni casi si richiede un volume di inoculo molto più alto ( 20 % ), quando : - il mezzo di coltura è molto povero - quando si effettua una conversione enzimatica; ad es. il microrganismo A produce un enzima E che viene utilizzato dal microrganismo B per trasformare la sostanza x in y; la resa in y dipende quindi da E che deve essere prodotto in grande quantità. Per effettuare lo scale up si possono usare anche le spore che però per poter germinare richiedono un trattamento preliminare: heat shocking ( 90 in vapore bollente ) per le spore batteriche, più resistenti o trattamento con un tensioattivo ( sodio laurilsolfonato ) per le spore fungine, più delicate. E fondamentale che il terreno su cui si fa lo scale up sia lo stesso del fermentatore per ridurre il più possibile la fase di latenza. FERMENTATORE Detto anche bioreattore è un recipiente a elevata capacità all interno del quale avvengono le trasformazioni biochimiche sulla materia prima ad opera delle cellule o degli estratti cellulari ( enzimi). La forma deve essere tale da non permettere l accumulo di nutriente in certe zone piuttosto che in altre, dove potrebbero proliferare m.o. contaminanti sopravvissuti alla sterilizzazione. Infatti è generalmente cilindrica senza anfratti e con la massima limitazione di giunzioni e connessioni; abitualmente il fermentatore è progettato con sviluppo verticale per avere minore superficie libera. Attualmente si costruiscono anche fermentatori di forma sferoidale perché si riducono i danni alle cellule, si riduce la possibilità di formazione di focolai, si aumenta la capacità. I materiali usati per la costruzione dei bioreattori devono essere inerti rispetto alla massa fermentante e inossidabili. L interno deve poter essere sterilizzato, con vapore acqueo. Deve essere garantita l agitazione ( STR e CSTR, air- lift ), l immissione di aria e tutti i controlli chimico fisici necessari. CONFIGURAZIONE DI UN IMPIANTO Un fermentatore può essere predisposto per una produzione: in discontinuo o a lotti o batch in continuo in semicontinuo o a fed-batch; esiste anche il FBR cioè fed-batch ripetuto La fermentazione batch è un processo industriale discontinuo; il bioreattore viene caricato con una quantità predeterminata di biomassa (inoculo) che è lasciata a fermentare per tempi e livelli di produzione stabiliti. Quindi il bioreattore viene completamente svuotato, con conseguente recupero del prodotto, e ricaricato per un nuovo ciclo. Si tratta quindi di un sistema chiuso che presenta alcuni vantaggi come basso costo delle apparecchiature, semplicità di esercizio, basso rischio biologico; e alcuni svantaggi come bassa produttività oraria a causa di lunghi tempi morti, scarso controllo sulla cinetica del processo e sulla fisiologia del m.o. E applicato soprattutto per la produzione di alimenti (yogurt) e di metaboliti secondari (antibiotici, vaccini) La fermentazione in continuo è un processo industriale in cui il bioreattore lavora senza interruzioni finché è possibile il controllo dell attività metabolica ai fini della produzione desiderata. Dal bioreattore viene estratto il prodotto e in esso viene reintegrata la materia prima che è stata trasformata in modo che il ciclo di produzione si ripeta il maggior numero di volte possibile. Nel caso di un CSTR il nutriente fresco viene continuamente aggiunto dall alto e un egual volume di brodo contenente prodotto, biomassa e substrato non reagito viene sottratto dal fondo in modo che il volume totale nel 3

4 fermentatore non cambi. Il flusso del nutriente in entrata può essere regolato controllando la concentrazione del substrato limitante (chemiostato) oppure controllando la torbidità del brodo, cioè la concentrazione della biomassa, in uscita (turbidostato). Si tratta di un sistema aperto che presenta alcuni vantaggi come l alta produttività oraria, la possibilità di controllare la concentrazione dei nutrienti, mantenere al massimo e per tempi molto lunghi la velocità di crescita, studiare la cinetica del processo; gli svantaggi sono invece la difficoltà a mantenere per lunghi periodi la sterilità, la possibilità di comparsa di mutazioni, la difficoltà nel recupero del prodotto da brodi diluiti, si può applicare solo alla produzione di metaboliti primari. Nel caso del chemiostato inoltre la concentrazione di cellule è piuttosto bassa e quindi si ha spreco di substrato. La fermentazione in semicontinuo consiste nel realizzare l alimentazione in continuo e il prelievo in uscita in discontinuo allo scopo di esaltare il consumo del nutriente. CONTROLLI Vengono controllati i seguenti parametri: temperatura; è necessario termostatare il fermentatore per fornire al m.o. la temperatura ottimale (il range è limitato) e evitare che il calore prodotto dalla crescita delle cellule provochi un surriscaldamento pressione; è determinata dal vapore utilizzato per la sterilizzazione e dai gas prodotti dalla fermentazione. Solitamente si mantiene una leggera sovrapressione per evitare risucchi e contaminazioni agitazione, deve essere sufficiente a garantire il mescolamento senza produrre danni alle cellule, ad esempio le muffe sono molto sensibili allo stress da taglio schiumeggiamento ; è determinato dalla agitazione, dalla variazione di temperatura o di ph e deve essere evitato, si elimina con l uso di apparecchiature o con l aggiunta di adatti agenti tensioattivi ( anche gli oli) torbidità; è una misura della concentrazione della biomassa; si misura con torbidimetri ph; è necessario mantenere il ph nel range ottimale per il tipo di m.o. tamponando eventuali cambiamenti dovuti alla produzione di sostanze acide o basiche concentrazione di O 2 ; nelle trasformazioni aerobie è fondamentale che l ossigeno raggiunga in quantità sufficiente ogni zona del fermentatore altrimenti è possibile o che il m.o. muoia o che modifichi il proprio metabolismo concentrazione dei nutrienti; la misura dei nutrienti è indiretta ed è rilevabile attraverso la misura della quantità di cellule o dei prodotti; è necessario il controllo dei nutrienti perché, in caso di difetto, la cellula metabolizza più lentamente mentre un loro eccesso può provocare una deviazione della via metabolica oltre che uno spreco potenziali redox ; si misura l attività elettrochimica di particolari enzimi ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE PRODOTTO Un processo biotecnologico deve mirare ad ottenere un prodotto a elevata purezza e con rese quantitative adeguate. Invece alla fine di un processo biotecnologico il prodotto risulta impuro, disperso in un ambiente dal volume molto alto ( L) costituito da molte sostanze (acqua, cellule, metaboliti indesiderati, materie prime non consumate, materie di scarto, sia in sospensione che in soluzione). E facile quindi comprendere come il processo di recupero e purificazione del prodotto sia estremamente importante e spesso assai più costoso della vera produzione. Il prodotto può essere: la biomassa un metabolita o intracellulare o extracellulare In ogni caso il primo passaggio al termine della fermentazione consiste nella precipitazione delle cellule dei m.o. e di particelle di solidi adsorbiti ad esse. Si realizza tramite centrifugazione, sedimentazione, filtrazione eventualmente favorita dall aggiunta di flocculanti. Se il prodotto è la biomassa questa sarà adeguatamente lavata e raccolta. Se invece il prodotto è un metabolita intracellulare sarà necessario favorirne la fuoriuscita dalle cellule tramite macinazione o trattamento con tensioattivi seguita da una ulteriore filtrazione. A questo punto il prodotto si troverà nella fase liquida, così come accade nel caso di un metabolita extracellulare. Si può procedere alla raccolta utilizzando vari metodi a seconda delle caratteristiche chimico fisiche della sostanza e della sua concentrazione; cromatografia di adsorbimento, distillazione, estrazione con solventi, precipitazione, filtrazione, liofilizzazione. ASPETTI CINETICI DELLE FERMENTAZIONI Se un microrganismo viene inoculato in un brodo sterile, ricco in tutti i nutrienti compreso l ossigeno, mantenuto alla temperatura e ph adatti, quindi nelle condizioni fisiologiche ottimali si potrà costruire una CURVA di CRESCITA ( cioè un diagramma log N/t misurando N = numero delle cellule con uno dei metodi di conta batterica ) che tipicamente è caratterizzata da più fasi: fase lag o di latenza, in cui il n di cellule non aumenta perché il microrganismo si sta adattando al nutriente fase log o esponenziale o logaritmica, in cui il numero delle cellule aumenta rapidamente perché il microrganismo si sta duplicando; in questa fase si può calcolare il tempo di generazione, cioè il tempo necessario perché la popolazione raddoppi; è tipico di ogni microrganismo 4

5 fase stazionaria, in cui il numero delle cellule ha raggiunto il valore massimo e rimane costante perché si stabilisce un equilibrio fra il numero di cellule che nascono e di cellule che muoiono a causa della mancanza di un nutriente o della comparsa di metaboliti tossici. fase di declino in cui il numero di cellule che muoiono è maggiore di quelle che nascono La crescita cellulare si definisce limitata quando, tra tutti i nutrienti che l organismo consuma in continuazione per la sua attività metabolica e per la produzione di biomassa, uno diminuisce più velocemente degli altri e raggiunge un valore minimo di concentrazione al di sotto del quale l accrescimento rallenta notevolmente fino ad arrestarsi; la stessa condizione si verifica quando i metaboliti si accumulano nell ambiente colturale in modo da risultare tossici per le cellule. La crescita cellulare si definisce non limitata quando nessun nutriente è presente in concentrazione minima tale da abbassare la velocità dell attività metabolica oppure quando nessun metabolita si accumula in modo tale da essere tossico per la cellula. In realtà non è possibile mantenere indefinitamente la crescita non limitata, si può solo cercare di mantenerla il più a lungo possibile. CINETICA DELLA CRESCITA DI MICRORGANISMI Per i m.o. la crescita consiste essenzialmente nell aumento del numero delle cellule dovuto alla fissione binaria e che si verifica grazie ad un insieme molto complesso di reazioni enzimatiche (metabolismo).. La reazione può dunque essere scritta come: cellula + nutriente S N cellule + prodotto P e la velocità di crescita può essere scritta come v = k N oppure v = k P oppure come v = - k S normalmente si preferisce la prima espressione. Per ogni specie di m.o. esiste un tempo di generazione (tg) caratteristico che rappresenta il tempo necessario perché una popolazione di m.o. raddoppi se posta in condizioni ottimali. Tempo 0 1 tg 2 tg 3 tg 4 tg n tg N (numero di cellule) 1 2 (cioè 2 1 ) 4 (cioè 2 2 ) 8 ( 2 3 ) 16 ( 2 4 ) N ( cioè 2 n ) Da questa tabella si deduce che, dopo n cicli, il numero di cellule sarà : N finale = N 0 x 2 n Per cui la velocità o tasso di crescita sarà v = n / t cioè il numero di generazioni nell unità di tempo; inoltre vale anche che tg = t / n e che n = t / tg Quindi si deduce che maggiore è il tempo di generazione e minore sarà la velocità di crescita. Accanto a questa definizione di velocità di crescita viene più frequentemente usata la velocità o tasso di crescita specifico indicata con la lettera µ,(su alcuni testi è indicata come k o come r) e definita come µ= dn/dt x 1/N ( h -1 ) Il vantaggio di questa definizione è che la velocità di crescita specifica risulta costante quando il tempo di generazione è costante. Osservando le diverse fasi della curva di crescita si può notare che: Log N Log N µ [ S ] nella fase lag la velocità è circa 0 nella fase log aumenta rapidamente raggiungendo il valore massimo nella fase stazionaria torna nuovamente a 0 essendo in equilibrio con la velocità di mortalità nella fase di declino la velocità di mortalità = - dn/dt 1/N è maggiore rispetto a quella di crescita La velocità di crescita specifica dipende dagli stessi fattori che influenzano le reazioni enzimatiche: temperatura ph natura del microrganismo concentrazione del substrato 5

6 Di particolare interesse è la relazione fra il tasso di crescita e la concentrazione del substrato limitante, studiata dal chimico Jacques Monod nel Questa relazione è espressa dal grafico descritto sotto e dall equazione, detta di Monod µ = µ max [S] / K s + [S] che non a caso assomiglia molto alla eq. di Michaelis- Menten. µ [ S ] K s esprime l affinità tra il microrganismo e il substrato preso in esame; ha normalmente valori molto bassi per cui nella fase log è molto facile che la concentrazione di S superi anche di 10 volte il valore di K s e si raggiunga quindi il valore massimo di velocità di crescita. Anche l equazione di Monod può essere linearizzata con l equazione di Lineweaver-Burk TECNICHE DI PRODUZIONE Le tecniche di produzione industriale sono: batch continuo ( CSTR, a flusso ) versioni intermedie (fed-batch, FBR ) Coltivazione in BATCH Si può considerare come un sistema chiuso e si tratta di una crescita limitata. Al tempo t=0, il brodo sterile viene inoculato con il microrganismo e lo si lascia incubare senza nessuna altra aggiunta eccetto l ossigeno, l agente antischiuma, i correttori di ph. Se questo procedimento avviene in condizioni fisiologiche ottimali, si potrà osservare la curva di crescita già nota: fase lag, se il processo di scale-up è stato progettato ed eseguito correttamente la fase di latenza è assente fase log o esponenziale; in questa fase si assiste anche alla comparsa e al rapido incremento del prodotto quando è totalmente o parzialmente associato alla crescita fase stazionaria; in questa fase si assiste anche alla comparsa del prodotto quando sia non associato alla crescita fase di declino; il processo industriale viene interrotto prima Vantaggi della coltivazione in batch: dal momento che è una crescita limitata si può raggiungere la fase stazionaria e quindi è possibile produrre i metaboliti secondari esecuzione semplice basso costo delle apparecchiature, facili da gestire basso rischio di rotture e quindi di perdite basso rischio biologico Svantaggi della coltivazione in batch: scarso controllo sulla fisiologia della coltura difficile comprensione dei fenomeni biologici; non è attendibile per effettuare studi perché sono troppi i parametri che cambiano insieme bassa produttività oraria Applicazioni della coltivazione in batch: produzione di sostanze ad valore aggiunto ( antibiotici, vaccini ) su cui dato il basso costo di esercizio esiste un buon guadagno produzione di sostanze con caratteristiche chimico-fisiche non completamente definite e controllabili ( vino, birra, yoghurt ) Coltivazione in CONTINUO Si può considerare un sistema aperto in cui una soluzione nutriente sterile è aggiunta continuamente nel reattore ed una quantità equivalente di brodocoltura è prelevata simultaneamente. 6

7 Comporta una crescita non limitata. Si può realizzare con un bioreattore CSTR o con un bioreattore a flusso; nel primo caso, il più significativo, si può far funzionare il reattore come un chemiostato o come un turbidostato. Chemiostato quando la velocità di diluizione è regolata in base alla concentrazione di un substrato scelto come limitante; turbidostato quando la velocità di diluizione è regolata in base alla concentrazione della biomassa misurata per via turbidimetrica. La velocità di diluizione è definita come il rapporto fra il flusso in entrata e il volume della brodocoltura D = F/V (h -1 ) Nella coltura in continuo si può raggiungere lo stato stazionario cioè tale che la concentrazione della biomassa sia costante; ciò si realizza se le cellule che vengono sottratte con il prelievo continuo di brodocoltura sono rimpiazzate da una crescita del microrganismo che quindi deve rimanere nella fase log; in altre parole deve essere soddisfatta la seguente relazione D = µ Si può ottenere regolando D in modo tale che D < µ max ; se invece D > µ max allora ci si trova nella condizione di washout che porta la concentrazione di biomassa = 0 Nella realtà la situazione tipica può essere descritta con il seguente diagramma: X D S X = concentrazione biomassa X S = conc substrato (g/l) Sr D = velocità di diluizione Sr = substrato in entrata 0 D critica D al crescere di D : X diminuisce fino a diventare 0 per un valore di Dcritica S aumenta fino a diventare S r in corrispondenza di Dcritica Dcritica è la velocità di diluizione a cui X = 0 e S = S r Se il processo serve per degradare un substrato conviene lavorare a D basse Se il processo serve per produrre biomassa o prodotti associati alla crescita converrebbe lavorare a D = µ max, cioè allo stato stazionario ; ciò si realizza a valori di D vicini a Dcritica per cui conviene evitare il rischio wash-out e lavorare a D più basse. Il processo non è adatto per produrre prodotti non associati alla crescita in quanto la coltura viene mantenuta in fase log e non stazionaria; le industrie però tendono a lavorare il più possibile in continuo ( è più conveniente) e cercano di produrre in continuo anche i metaboliti secondari, ad esempio sottoponendo le colture a stress o operando a D molto basse. Vantaggi della coltivazione in continuo: Condizioni costanti e ottimali mantenute per tempi molto lunghi Alta produttività oraria, perché non ci sono tempi morti Possibilità di effettuare studi cinetici e valutare le rese al variare dei parametri principali Svantaggi della coltivazione in continuo: Non è possibile produrre metaboliti secondari Apparecchiature più difficili da gestire Difficoltà a mantenere la sterilità per lunghi periodi Più è lunga la permanenza in coltura più è facile sorgano mutanti Se si lavora a D molto basse il prodotto è presente in basse concentrazioni e in grossi volumi; ciò rende il recupero difficoltoso. Applicazioni della coltivazione in continuo: Studi sul metabolismo ( scoprire se un prodotto è associato alla crescita o no ) Produzione di SCP, metaboliti primari come alcoli, aceto.. Degradazione di substrati 7