STRATEGIE UTILIZZATE PER LA PRODUZIONE BATTERI DEI VACCINI:

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1 VACCINI Una precedente risposta immune verso un microrganismo rende un individuo meno suscettibile oppure anche resistente ad una infezione da parte dello stesso agente infettivo. Una malattia infettiva può difficilmente colpire soggetti guariti della stessa infezione. Questa constatazione fornisce la base razionale della vaccinazione. La vaccinazione consiste nell inoculazione di vaccini per indurre una risposta immunitaria attiva simile a quella che si osserva nell infezione naturale, in assenza di malattia. I vaccini possono essere microrganismi, virus, materiali d origine microbica (tossine) resi poco o per nulla dannosi per l organismo ma in grado di funzionare da antigeni. In Oriente si inoculava per scarificazione cutanea materiale proveniente da pustole di soggetti con vaiolo leggero: la pratica della vaiolizzazione fu propagandata in Europa da Lady Mary Wortley Montague, moglie di un ambasciatore inglese in Turchia. Alla fine del 700, Edward Jenner osservò che soggetti che avevano superato un affezione pustolosa benigna contratta dai bovini non si ammalavano di vaiolo. Pensò quindi di inoculare la malattia del bovino (variolae vaccinae) per proteggere l uomo contro il vaiolo. I francesi derisero Jenner chiamando Vaccination il trattamento jenneriano. Pasteur, alla fine del 1800, dimostrò la passibilità di attenuare microrganismi patogeni per usarli come vaccini. L uso dei vaccini nella terapia delle malattie infettive si deve a Wright. VACCINI BATTERICI Sono di due tipi: 1. ANATOSSINE o TOSSOIDI: le esotossine proteiche batteriche prive del potere tossico, ma con inalterate proprietà antigeni. Alcune tossine, in seguito all invecchiamento o a trattamenti (formaldeide, ecc) sono parzialmente denaturate, perdono il potere tossico e mantengono le proprietà antigeni. Oggi ci sono due vaccini: antidifterico e antitetanico. Nella difterite e nel tetano, tutta la sintomatologia è causata dalle esotossine prodotte dai clostridi. La presenza di anticorpi previene la sintomatologia, mentre le difese infiammatorie eliminano i batteri infettanti che sono scarsamente virulenti. 2. BATTERI: batteri patogeni uccisi (calore, formolo) e varianti apatogene viventi. I vaccini allestiti con batteri patogeni viventi sono il vaccino antitifico, il vaccino contro la Rickettsia prowazekii (agente del tifo petecchiale), ed altri. Mentre il vaccino antitubercolare è allestito con il bacillo di Calmette e Guerin (BCG) e il vaccino antitifico è preparato con il ceppo attenuato Ty21a di Salmonella typhi. GENERALITÀ: Malattie causate da agenti patogeni quali virus e batteri subirono una drastica caduta di incidenza a partire dal momento in cui vennero introdotte in modo sistematico le vaccinazioni. Il sistema immunitario garantisce un buon livello di protezione nei confronti degli agenti patogeni basandosi soprattutto su una caratteristica unica e fondamentale: la specificità. L immunità, o memoria immunologica, rende l organismo pronto a rispondere in modo estremamente efficiente ad un agente infettivo qualsiasi, virus o batterio che sia. Esso deve però prima incontrare il patogeno e in un secondo tempo attivare un efficace azione difensiva nei suoi confronti. Risulta quindi chiaro che l immunità verso microorganismi infettivi può essere ottenuta in modo: Naturale: è quanto fa il sistema immunitario normalmente, ma non esclude l instaurarsi della patologia; Artificiale: si tratta dei vaccini, potenti mezzi a disposizione dell uomo che portano ad una risposta del sistema immunitario (come l instaurarsi di immunità e della memoria immunologica) senza l instaurarsi della malattia. È inoltre importante conoscere la differenza che esiste tra immunizzazione attiva e passiva. L immunizzazione : Passiva consiste nel trasferimento di anticorpi in un organismo ricevente. Essa può avvenire in modo naturale, attraverso il trasferimento di anticorpi dalla madre al feto durante la gravidanza, oppure in modo passivo, in quella che viene anche indicata come "sieroprofilassi", cioè con l introduzione nel ricevente di anticorpi prodotti appositamente. Questo tipo di immunità ha il pregio di essere ottenuta molto velocemente, ma ha anche il limite di non conferire memoria immunologica. Attiva consiste nel produrre un immunità protettiva e soprattutto una memoria immunologica, in modo che una successiva esposizione al patogeno provochi una risposta immunologica più potente, che lo elimini con successo prima di dar luogo a manifestazione patologiche. In questo caso il S.I. svolge un ruolo di primaria importanza, mentre nel caso precedente esso risultava inattivo: i linfociti selezionati e specifici per l antigene proliferano e determinano la formazione di cellule memoria. STRATEGIE UTILIZZATE PER LA PRODUZIONE DEI VACCINI: Per la produzione di un vaccino, occorre considerare che i requisiti per la sua efficienza variano in relazione alla natura dell agente patogeno. I vaccini hanno avuto un enorme sviluppo a partire dagli anni 60, quando si passò ad un approccio più razionale, basato sulla comprensione a livello molecolare della patogenicità microbica, sulla comprensione della regolazione del sistema immunitario nella generazione di risposte T- o B- dipendenti. Si vide da subito che non poteva esistere 1

2 un unica strategia per ottenere "artificialmente" immunità contro i più svariati patogeni: tramite i vaccini si cerca infatti di riprodurre nel modo più fedele possibile un attacco "reale" da parte di un agente infettivo. Si vuole indurre l organismo a produrre la risposta immune più simile a quella che farebbe se incontrasse in circostanze "normali" lo stesso patogeno. Non si possono, quindi, ignorare le differenze che si hanno nei confronti dei diversi agenti patogeni. Per esempio, per gli organismi extracellulari sono gli anticorpi a rappresentare la principale forma di difesa, mentre per il controllo di organismi intracellulari è essenziale una efficace risposta CD8-positiva. Il vaccino ideale fornisce all ospite pronte difese nel punto d entrata dell agente infettivo; così una delle parole d ordine nella creazione di un vaccino è "mirare" la sua azione. MODALITÀ DI RISPOSTA DELL ORGANISMO: Risposta T-indipendente: Nell immunità specifica troviamo un tipo di risposta che coinvolge solo i linfociti B. Essa viene indotta da alcune sostanze tra cui l LPS della parete cellulare dei batteri Gram- e il polisaccaride capsulare dello pneumococco. Ammettendo di voler fare un vaccino inoculando in un ospite queste sostanze, si otterrebbe sì risposta, ma con alcune caratteristiche che la renderebbero, secondo le attuali vedute, praticamente inaccettabile: debole, senza memoria, con produzione di sole IgM, inesistente in bambini sotto i due anni d età. Risposta T- e B-dipendente: Per ovviare ai primi tre inconvenienti, appare ora chiaro che un buon vaccino deve indurre una risposta sia di tipo T che di tipo B. Questo perché si vengono così a selezionare linee di linfociti T-helper, i "direttori d orchestra" della risposta immunitaria, le cui citochine secrete sono in grado di garantire: a. sufficiente ampliamento dei cloni selezionati (la successiva risposta sarà basata su "forze" più numerose, oltre che sempre più affini); b. generazione di cloni memoria (di importanza fondamentale, il fine ultimo della vaccinazione); 3. maturazione di affinità (è necessario possedere tanti anticorpi, ma bisogna che siano specifici per l agente patogeno e per la sua via d entrata). È necessario considerare anche altri punti. Nel momento in cui un antigene entra in un organismo, esso determina una risposta policlonale, cioè diretta verso tutti o la maggior parte degli epitopi di superficie del patogeno, siano essi patogenici oppure no. A livello teorico, sembra quindi una soluzione molto semplice e vantaggiosa l inoculo a scopo preventivo solo delle proteine o degli acidi nucleici che determinano la patogenicità; è però da considerare che in questo modo solo raramente potremo ottenere una risposta efficace, in quanto tenderà sempre a mancare la componente T o quella B. Per ovviare a questo inconveniente 2 fondamentale, si possono utilizzare opportuni adiuvanti, proteine "carrier" o anche opportune citochine, in grado di fornire una risposta del tutto mirata. LIMITI DEI VACCINI: Nonostante i notevoli progressi compiuti dalla ricerca sui "vaccini", esistono ancora molti difetti ai quali sembra difficile porre rimedio, legati a: 1. molteplicità degli antigeni: se, come detto, è possibile vaccinare "contro gli antigeni", è altrettanto vero che risulta impossibile vaccinare contro "troppi" antigeni; ad esempio se teoricamente sarebbe possibile ottenere immunità contro tutti gli antigeni patogeni dello Streptococcus pyogenes, di fatto ciò risulta impossibile per l estrema numerosità degli stessi. 2. Variabilità degli antigeni: qualsiasi vaccino, per perfetto che sia, risulterà efficace solo per l antigene per cui è stato ideato; qualora il target muti (quanto accade tipicamente per i virus influenzali o HIV, per esempio) esso risulterà inefficace nei confronti delle "novità". 3. Variabilità individuale dell ospite: sono state dimostrate diversità individuali a livello di cellule del sistema immunitario: è noto il grande numero di HLA esistenti per la nostra specie; così, se un antigene è ben processato ed esposto su di un particolare MHC, in modo tale da indurre un appropriata risposta T in un individuo, non è detto che lo sia anche per tutti gli altri, dotati di HLA diversi. 4. Modo di somministrazione: la maggior parte dei vaccini è somministrata per via parenterale; oltre a svantaggi di tipo pratico, ciò ha un importante svantaggio immunologico: l iniezione non è l usuale porta d entrata della maggior parte degli antigeni patogeni contro cui la vaccinazione è diretta. Può accadere che un vaccino porti ad anticorpi altamente affini ma di classe "sbagliata": ad es. l inoculazione sotto cute di un Ag induce una risposta di tipo IgM, seguita da IgG, ma è molto più difficile un ulteriore switch isotipico ad IgA, vale a dire la classe anticorpale più efficace contro quei patogeni che colonizzano le mucose, quali rhinovirus o virus dell influenza. È importante capire come questi organismi stimolino l immunità mucosale e sviluppare vaccini che possano essere somministrati alla mucosa oralmente o attraverso inalazione na-sale. 5. Somministrazione a bambini di età inferiore a 6 mesi: i neonati infatti posseggono ancora gli anticorpi materni per un tempo variabile in relazione al periodo di allattamento; il preparato vaccinico può quindi essere neutralizzato da tali anticorpi senza indurre un attivazione del sistema immunitario tale da garantire l immunità. Inoltre il neonato non ha ancora un sistema immunitario perfettamente sviluppato, ma proprio per questo è importante vaccinare ugualmente i bambini sotto i 6 mesi, età in cui alcune malattie infettive si manifestano molto frequentemente e con la massima virulenza (tanto più che non possiamo conoscere il grado di copertura anticorpale dei sin-

3 goli bambini data la difficoltà ad effettuare prelievi di sangue). 6. Limiti della risposta stessa: può accadere che un vaccino risulti molto efficace nel conferire immunità, ma che sia il sistema immunitario in sé a risultare inefficace contro alcuni patogeni; è quanto accade, ad esempio, nel caso del virus dell influenza, che ha un periodo d incubazione di circa tre giorni. Infatti dopo 5-6 giorni dalla vaccinazione si formano anticorpi con emivita dell ordine di qualche mese e cellule memoria: quando la titolazione anticorpale scenderà sotto livelli efficaci, poiché il "risveglio" delle cellule memoria si può attuare solo in un tempo superiore al tempo di incubazione, il virus potrà dar luogo all infezione. In questi casi risulta quindi necessario mantenere alto il livello di anticorpi neutralizzanti con immunizzazioni successive. Figura 1. Risposta anticorpale sierica e secretoria a poliovaccino con virus ucciso somministrato intramuscolo (Salk) e a poliovaccino con virus vivo attenuato somministrato oralmente (Sabin). 7) Inefficacia dei vaccini: la vaccinazione non è efficace nel 100 % degli individui, ma per ogni vaccino una piccola percentuale di individui risponde poco e non viene adeguatamente protetta. Questo non è un problema serio se la maggior parte della popolazione è immune all agente infettivo. In quanto la probabilità che un individuo suscettibile entri in contatto con uno infetto è così bassa che le probabilità d infezione sono minime. Questo importante fenomeno è noto come immunità di massa. 8) Possibile presenza nella preparazione vaccinale di virus contaminanti che erano presenti in forma latente nelle cellule di coltura, usate per propagare il virus da inattivare o per le procedure di attenuazione. Nel 1960 si scoprì che il virus oncogeno SV40 aveva contaminato alcune colture di rene di scimmia usate nella 3 produzione del vaccino di Sabin così come in quello di Salk e si richiese un analisi più attenta per eliminare questo contaminante. (Si riteneva che questo virus non fosse pericoloso per l uomo, anche se ultimamente è stata descritta la sua presenza in certi casi di tumori cerebrali, osteosarcomi e mesoteliomi). È stata vista contaminazione dei vaccini attenuati anche ad opera di CMV di scimmia e virus della leucemia aviaria. Il problema può essere superato con l uso di linee di cellule diploidi umane come substrato per la coltura del virus. Vaccini preparati in tale modo sono in uso da anni. USO CORRETTO DEI VACCINI: 1) Devono essere somministrati in un dosaggio appropriato alla suscettibilità individuale e

4 secondo un calendario preciso, cosa decisamente necessaria in quei vaccini che richiedono numerosi richiami. La difficoltà a raggiungere tutti i settori della popolazione con completa serie di immunizzazioni è evidenziata da continui casi di poliomielite e morbillo in persone non vaccinate; bambini di età prescolare nelle aree povere sono meno vaccinati. 2) La somministrazione contemporanea di ceppi virali diversi è possibile solo con opportuni accorgimenti a causa delle interferenze nella stimolazione della risposta immunitaria. Ad esempio il vaccino polio di Sabin, composto da tre ceppi attenuati di poliovirus deve essere somministrato in più dosi, perché i tre ceppi interferiscono l uno con l altro nella replicazione nell individuo. Con la prima immunizzazione uno dei tre ceppi cresce in modo predominante e induce una immunità mirata verso quel ceppo. Con la seconda immunizzazione l immunità generata dalla prima dose di vaccino limiterà la crescita del ceppo in precedenza predominante, permettendo a uno dei due ceppi rimasti di predominare e di indurre immunità. Con la terza immunizzazione si ottiene l immunità anche verso il terzo ceppo. 3) Analogo discorso può essere fatto per altri vaccini trivalenti, in cui la risposta anticorpale a ogni componente del vaccino è comparabile a quella che si ottiene somministrando i vaccini separatamente. 4) In circostanze eccezionali un vaccino antivirale può essere somministrato all inizio del contagio, nella speranza di ottenere una risposta immunitaria prima che il virus si manifesti negli organi bersaglio. In questi casi si ha la possibilità di evitare e/o attenuare la sintomatologia di malattie virali a incubazione lunga (es. rabbia, morbillo, vaiolo, ecc.). PREPARAZIONE DI VACCINI PER L IMMUNIZ- ZAZIONE ATTIVA: È stato possibile creare molti tipi di vaccini seguendo tecniche diverse e basandosi su diverse considerazioni. Schematicamente li possiamo suddividere in: VACCINI con ORGANISMI: 1) Inattivati 2) Attenuati 3) Innovativi: Attenuazione tramite manipolazione genetica Vettori virali avirulenti Proteine purificate prodotte usando geni clonati Peptidi sintetici Vaccini composti da subunità Vaccini a DNA Vaccini a RNA Vaccini antiidiotipo VACCINI INATTIVATI Lo scopo di tali vaccini è quello di ottenere preparazioni antigeniche inerti capaci di stimolare efficacemente il sistema immunitario in assenza totale di attività replicativa e/o patogena per organismi e culture cellulari. È definito appunto inattivato o ucciso un virus che abbia perso capacità replicativa; in questo modo esso ha perso il potere infettante e patogeno, ma conserva il potere antigenico. Metodi di Inattivazione. Punto chiave nella preparazione di un vaccino a virus inattivato è quello di uccidere effettivamente il virus, in modo da non rischiare infezioni. Allo stesso tempo, però, è molto importante mantenere la struttura degli epitopi antigenici di superficie, cioè di quelle stesse molecole presenti sui virus infettanti e che in questo modo saranno poi riconosciute dagli anticorpi prodotti grazie alla vaccinazione. A tale scopo sono state ideate varie tecniche, con agenti denaturanti di natura chimico-fisica: calore: è una tecnica generalmente non soddisfacente, poiché causa un estesa denaturazione delle proteine, che altera gli epitopi dipendenti dalla struttura nativa delle stesse; formaldeide: assieme all uso di altri agenti alchilanti è la tecnica che ha maggior successo; beta-propionolattone; raggi U.V Vantaggi: Possono essere somministrati in soggetti immunodepressi e donne gravide, in quanto non possono in alcun modo generare infezione; Non richiedono particolari tecniche di conservazione, potendo resistere bene anche a temperature piuttosto ostili, tipiche delle regioni del terzo mondo, in cui da un certo periodo sono in corso estese campagne di vaccinazione. Svantaggi: Si può verificare l esistenza di frammenti di genoma virale non inattivati; ad esempio in seguito all inattivazione di Herpes simplex con U.V si è notata la persistenza di corte sequenze dei geni precoci ad azione trasformante; Conferiscono immunità spesso breve e devono essere ripetuti; con questo tipo di vaccini, per ottenere una buona risposta primaria occorre una forte massa antigenica, bisogna quindi effettuare inoculi sufficientemente concentrati e se possibile frazionati in più somministrazioni, per iniezione sottocute. Ciò implica non solo problemi logistici nel raggiungimento dei pazienti, ma ha anche causato preoccupazione per i possibili effetti di ripetute somministrazioni di proteine estranee (ad esempio le reazioni di ipersensibilità); Provocano solo la produzione di IgM e IgG circolanti e non di IgA; quindi in caso di contagio col virus selvaggio (es. mucosa nasofaringea per i virus respiratori o mucosa del tatto alimentare per il poliovirus) non lo bloccano alla porta d entrata, ma controllano l infezione ad uno stato più avanzato: quello della viremia, risultando attivi soprattutto in casi di infezioni generalizzate; 2

5 Determinano attivazione esclusiva o quasi della risposta di tipo B, senza quella cellulomediata (risposta T). Questo avviene perché i virus, essendo uccisi, non possono replicarsi nelle cellule e quindi indurre presentazione di loro molecole su MHC di classe I, necessarie per l attivazione dei linfociti T CD8+. Essi possono solo essere processati secondo la via esogena ed esposti su MHC di classe II, andando così ad attivare i T CD4+, indispensabili per una risposta solo di tipo anticorpale. VACCINI ATTENUATI I vaccini attenuati sono preparazioni virali che mantengono inalterato il loro potere antigenico, sono dotate di capacità replicativa limitata nell ospite senza indurre manifestazioni patologiche e con caratteristiche attenuate stabili nel tempo. L attenuazione può essere ottenuta coltivando virus (così come batteri) patogeni per lunghi periodi in condizioni di coltura anormali. Questa procedura seleziona mutanti che crescono meglio nelle nuove condizioni di coltura, ma sono meno capaci di crescere nell ospite originale e non in grado di indurre la patologia in quanto mutati in qualche tappa essenziale per la patogenesi. Mentre è relativamente semplice creare terreni di coltura anormali per selezionare ceppi batterici mutanti attenuati, le condizioni sperimentali per estendere la procedura ai virus richiedono l utilizzo di cellule ospiti, molto spesso di specie diverse da quella umana e che quindi possono dare problemi di contaminazione. Ad esempio il poliovirus utilizzato nel vaccino di Sabin fu attenuato mediante coltura in cellule epiteliali di scimmia, mentre il vaccino del morbillo contiene un ceppo virale coltivato in cellule di embrione di anitra e successivamente in linee cellulari umane. Proprio per i problemi di contaminazione e perché l attenuazione sia irreversibile, si stanno cercando nuovi approcci di genetica molecolare, volti ad ottenere modificazioni mirate nei geni virali responsabili della patogenesi (ad es. per virus di rabbia, influenza, virus respiratori, ecc.). Questo è stato ottenuto nel maiale con un vaccino per il virus dell herpes, nel quale è stato rimosso il gene della timidina chinasi, enzima necessario per la crescita del virus in certi tipi di cellule. Vantaggi È sufficiente somministrare dosi minime di virus che, replicandosi nell organismo, provoca per accumulo il raggiungimento della massa antigenica critica necessaria alla stimolazione ottimale del sistema immunitario. Si possono ottenere risposte specifiche in base alla via di somministrazione del vaccino tenendo conto della naturale via di entrata del patogeno; ovvero con somministrazioni per via naturale si ottengono un efficace stimolo e un adeguata mobilizzazione delle difese immunitarie locali, con conseguente blocco del virus alla porta d ingresso. Un esempio è l induzione della produzione di IgA secretorie antivirali a livello delle mucose nel caso di un vaccino somministrato per via orale, mentre i vaccini 3 inattivati non possono essere somministrati per via orale e quindi non danno IgA secretorie. Oltre ad una buona risposta umorale inducono anche una buona risposta cellulo-mediata, che è di prioritaria importanza nella lotta contro i virus, dato che provoca un immunità di lunga durata. Il virus infatti deve essere in grado di replicarsi nelle cellule dell ospite, in modo che i suoi peptidi possano associarsi con molecole MHC I per attivare cellule T CD8+. Per questa ragione i vaccini attenuati, che permettono una limitata replicazione virale nelle cellule dell ospite, sono estremamente efficaci nell indurre l attività citotossica. Presentano però altri problemi derivanti dalla diversa affinità che le diverse molecole MHC hanno con i vari peptidi. Infatti, come accennato prima, un epitopo T immunodominante in un individuo può non esserlo in un altro che esprime un diverso aplotipo MHC. Proprio per la capacità di indurre efficace memoria immunologica è sufficiente la somministrazione di una singola dose di vaccino, eliminando così la necessità di effettuare successivi richiami. Questa proprietà è un notevole vantaggio per i paesi del terzo mondo dove studi epidemiologici hanno mostrato che circa il 20 % degli individui non effettua richiami successivi. Diffusione e stabilità nell ambiente. Ad esempio il poliovirus, eliminato per via fecale, può diffondere nell ambiente determinando una "vaccinazione di massa naturale". E così, anche se viene vaccinato solo l 80% della popolazione, il restante 20% può venir immmunizzato per questa via naturale. Svantaggi: Possibile ritorno del virus attenuato ad una forma virulenta, anche se con probabilità molto bassa. Ad esempio, la frequenza di reversione del vaccino polio di Sabin, che porta alla produzione di un ceppo virale virulento tale da indurre paralisi nell ospite è di circa 1 caso su di dosi di vaccino. È possibile applicare tecniche di ingegneria genetica a questo vaccino per eliminare il rischio di reversione; Il virus attenuato potrebbe produrre infezioni persistenti. Il rischio reale è sconosciuto, ma sembra molto basso, forse legato ad un eccessiva persistenza del virus nelle cellule, in cui continua a replicarsi; Un virus attenuato non è pericoloso in un soggetto normale immunocompetente, ma può essere letale in soggetti immunodepressi, a cui quindi non può essere somministrato; I virus attenuati hanno un alta affinità per i tessuti embrionali in cui provocano mutazioni e malformazioni; non si possono quindi utilizzare in donne gravide; In caso di somministrazione del virus attenuato contemporaneamente ad altre infezioni virali, il virus patogeno può inibire la replicazione del virus del vaccino e diminuirne l efficacia. Questo è stato notato con i ceppi virali del vaccino per la poliomielite, che possono essere

6 inibiti da concomitanti infezioni da diversi enterovirus; Sono sensibili alla luce e al calore e quindi instabili; vi è necessità di conservazione continua al freddo, il che costituisce un grosso problema nel terzo mondo nel caso di vaccinazioni di massa, inoltre in alcuni casi è necessario per conservarli usare stabilizzatori virali (es. MgCl2 per il vaccino polio); Vi sono due possibili rischi legati alla "vaccinazione di massa naturale": il virus, non più controllato, può entrare in contatto con pazienti immunodepressi o donne gravide, oppure può riacquistare col tempo la sua originaria patogenicità. INNOVATIVI: Attenuazione di virus tramite manipolazione genetica. Il concetto è quello di introdurre mutazioni delete che danneggino il virus ma non lo inattivino completamente in modo che posa essere usato per produrre un vaccino. Questa tecnica è un evoluzione dei vaccini attenuati che elimina la contaminazione e rende irreversibile l inattivazione. Vettori virali avirulenti. È possibile introdurre geni che codificano per i principali antigeni di patogeni particolarmente virulenti contro cui vogliamo vaccinare l individuo in batteri o virus attenuati. L organismo attenuato serve come vettore capace di replicarsi nell ospite ed esprime il prodotto genico del patogeno. A questo scopo sono stati utilizzati vari microrganismi tra cui il vaccinia virus, il poliovirus attenuato, adenovirus, ceppi attenuati di Salmonella e il ceppo BCG del Mycobatterium bovis. Il virus vaccinico, il vaccino attenuato usato per estinguere il vaiolo, un virus grande e complesso con un genoma di circa 200 geni, può essere modificato in modo da portare parecchie dozzine di geni estranei senza danneggiare la sua capacità di infettare cellule ospiti e di replicarsi. Il gene che codifica per l antigene desiderato viene inserito in un vettore plasmidico in prossimità di un promoter del vaccinia virus fiancheggiato su entrambi i lati da sequenze che codificano per la timidina chinasi del vaccinia. Cellule in coltura vengono poi infettate con il vaccinia virus e trasfettate con il plasmide ricombinante. Il gene desiderato e il promoter vengono così inseriti nel genoma del virus vaccinico mediante ricombinazione omologa a livello del gene della timidina chinasi del vaccinia, che non è essenziale per la crescita virale. Si ottiene così un virus ricombinante negativo per la timidina chinasi. Le cellule infettate con vaccinia virus ricombinanti vengono poi selezionate in coltura con bromodeossidina, un analogo della timidina che uccide tutte le cellule timidina chinasi positive. Come il vaccino del vaiolo anche il vaccinia virus può essere somministrato mediante semplice scarificazione dermica dove produce una limitata infezione locale delle cellule dell ospite. Se il prodotto del gene estraneo espresso dal vaccinia è una proteina dell involucro virale, esso viene inserito nella membrana della cellula dell ospite infettata e induce l immunità mediata da cellule T e quella mediata da anticorpi (vedi figura 2). In individui sani i vaccini attenuati crescono in modo limitato, ma in individui con immunodeficienza questi virus possono essere fatali. Altri vettori attenuati sono potenzialmente più sicuri rispetto al virus vaccinico, ad esempio un ceppo attenuato di Salmonella thipimurium modificato con geni del batterio del colera. Il vantaggio di questo vaccino è che la Salmonella infetta le cellule della mucosa intestinale e induce la produzione di IgA secretorie fondamentali nell immunità nei confronti del colera. Proteine purificate prodotte usando geni clonati. I geni virali possono essere facilmente clonati in plasmidi; questi cloni successivamente possono essere espressi in cellule procariote o eucariote usando determinate procedure. Gli antigeni immunizzanti del virus dell epatite B sono stati ad esempio sintetizzati in modo soddisfacente in batteri e in cellule fermentanti. Se il sistema di espressione permette di produrre l antigene in quantità sufficiente, la produzione di un vaccino purificato contenente solo l antigene immunizzante è possibile. Proteine purificate di rota-virus e virus di Norwalk prodotte con geni clonati, usando il sistema di espressione del baculovirus, sono state testate come vaccini possibili. Peptidi sintetici. La costruzione di peptidi sintetici da usare come vaccini per indurre immunità umorale o cellulo-mediata richiede che si tenga conto delle caratteristiche degli epitopi T e B; questa ricerca è stata rivoluzionata da due progressi fondamentali: la possibilità di dedurre la sequenza proteica degli antigeni dai dati sulla sequenza nucleotidica e preparare così grosse quantità di proteine attraverso la tecnologia del DNA ricombinante; grazie allo screening con peptidi sovrapposti e all analisi mutazionale la possibilità di identificare epitopi o singoli residui riconosciuti dai linfociti T o B che si legano alle molecole MHC per la presentazione a linfociti T. Lo screening a tappeto di peptidi che contengono sostituzioni aminoacidiche singole o multiple ha consentito di costruire antigeni dotati di maggior capacità di legarsi alle molecole MHC o di attivare linfociti T. Nel preparare vaccini con peptidi sintetici contro virus si cerca di utilizzare in generale regioni invarianti del virus la cui sequenza 4

7 Figura 2. Produzione di un vaccino inserendo un gene che codifica per un antigene del patogeno nel vettore vaccinico. Quando cellule in coltura vengono incubate con il plasmide ricombinante e con il virus vaccinico, avviene la ricombinazione omologa nel sito del gene della timidina-chinasi (Tk) del virus vaccinico. Le cellule che contengono il virus vaccinico ricombinante vengono selezionate aggiungendo bromodeossiuridina (BUdr), che uccide le cellule Tk+. 2

8 aminoacidica sia altamente conservata nei diversi ceppi virali. Osservazioni fatte hanno anche messo in luce l esistenza di peptidi inducenti immunodepressione; l identificazione dei peptidi soppressori potrebbe permettere la loro eliminazione dai vaccini sintetici e il conseguente potenziamento dell immunità. Questi peptidi soppressori potrebbero essere anche preziosi in situazioni in cui si voglia diminuire la risposta immune come nel trattamento di malattie autoimmuni. Nonostante ciò i principali ostacoli all uso di peptidi sintetici sono sia il fatto che la risposta immunitaria da loro indotta è considerevolmente inferiore rispetto a quella indotta da proteine intatte o virus inattivati ed inoltre spesso un singolo peptide rappresentante un singolo epitopo non è in grado di indurre resistenza contro una proteina virale contenente determinanti antigenici multipli. Vaccini composti da subunità. Uno dei limiti dei vaccini con peptidi sintetici e di quelli con proteine ricombinanti è che tendono ad essere poco immunogenici e ad indurre una buona risposta anticorpale ma una scarsa risposta cellulo-mediata. Questo nuovo metodo permette di preparare vaccini contenenti epitopi immunodo-minanti sia per le cellule B che per le T. Un tipo di approccio prevede di preparare i cosiddetti complessi matrice solida-anticorpo-antigene (SMAA) legando anticorpi monoclonali a parti-colari matrici solide e saturando l anticorpo con l antigene desiderato. Questi complessi vengono poi usati come vaccini; legando differenti anticorpi è possibile creare complessi che coinvolgono una miscela di peptidi o proteine che costituiscono epitopi immunodominanti sia per le cellule T che per le B. Un altro sistema è quello di usare un detergente per incorporare antigeni proteici o peptidi in vescicole lipidiche o in micelle proteiche o in complessi immunostimolanti (ISCOM). Il peptide o la proteina vengono espressi come complesso multivalente sulla superficie della micella e si è inoltre osservato che i liposomi e gli ISCOM possono liberare l antigene nella cellula inducendo immunità cellulo-mediata. Queste procedure permettono l eliminazione di peptidi soppressori e l inclusione nel vaccino solo di quei componenti virali necessari per stimolare una protezione anticorpale (vedi figura 3). Figura 3. Vaccini costituiti da subunità multivalenti. (1) I complessi matrice solida-anticorpo-antigene possono essere preparati in modo da contenere peptidi sintetici corrispondenti ad epitopi sia per cellule T che B. (2) Micelle di proteine, liposomi e complessi immunostimolanti (ISCOM) possono essere preparati con antigeni purificati o peptidi antigenici con i rsidui idrofilici dell'antigene orientati verso l'esterno. Vaccini a DNA. Questo tipo di vaccino prende spunto da un osservazione inaspettata: l inoculo di plasmide contenente un cdna codificante per un antigene proteico porta ad una forte e duratura risposta immunitaria umorale e cellulomediata nei confronti di quell antigene. La "DNA vaccination" consiste nella somministrazione di DNA inglobato in piccoli proiettili metallici, i cosiddetti "gene guns", in modo tale che molte particelle metalliche penetrino nella epidermide, potendo passare 3 anche nel muscolo sottostante. Non è chiaro il sistema d azione a questo livello; è presumibile che il plasmide infetti alcune APC professionali o le cellule muscolari stesse, inducendole ad esprimere i peptidi immunogenici che evocano la risposta immune. In ogni caso la risposta alla "DNA vaccination" non sembra danneggiare il tessuto, è sicura ed efficiente e soprattutto, poiché usa un solo gene microbico: non può portare ad un infezione conclamata,

9 caratteristica unica è che rappresenta l unico approccio, assieme ai batteri vivi, di generare intense risposte CTL, è poco dispendioso, perché non richiede coltivazioni di batteri o virus. Gli svantaggi legati ai vaccini a DNA dipendono soprattutto dal fatto che si sa ancora poco su di loro. Ad esempio non è chiaro il tempo di permanenza nell ospite del plasmide e quindi la durata dell immunità da esso conferita; sembra comunque che il DNA debba essere somministrato continuamente. Vaccini a RNA. In laboratorio sono stati sintetizzati genomi di virus a RNA. Successivamente questi genomi sono stati iniettati in cellule osservando che causavano locali infezioni attenuate. L RNA all interno della cellula replica, per cui la quantità che deve essere somministrata è 1/1000 di quella di DNA necessaria per ottenere una analoga protezione. Inoltre non integrandosi nei cromosomi non presenta rischi di persistenza. Sebbene l utilizzo di RNA sintetico sia troppo costoso per la produzione di vaccini su larga scala e presenti difetti legati alla maggior fragilità dell RNA rispetto al DNA, esso sarebbe applicabile ottimamente sulla febbre gialla e sulla poliomielite. Vaccini anti-idiotipo. Gli anticorpi anti-idiotipo possono servire come immagine interna di un antigene. Partendo da questi presupposti negli ultimi anni si è cercato di utilizzare gli anticorpi antiidiotipo come vaccini. Si cerca di indurre una risposta immune efficace verso un patogeno pericoloso, senza però esporre l individuo a nessuna forma del patogeno stesso. Un vaccino anti-idiotipo sviluppato per l HIV è stato progettato in modo che si leghi ad una regione conservata della glicoproteina gp120 dell involucro virale, necessaria per il legame del virus alla molecola CD4 espressa sulle cellule dell ospite. Il vantaggio di questa vaccinazione è che non vengono inoculati antigeni con capacità patogenica. Purtroppo ci troviamo di fronte ad una novità e quindi occorrerà tempo per sapere la reale efficacia. Aggiornato il 10 ottobre