Messa a punto di un protocollo operativo attento alla presenza di Agrobacterium vitisper la produzione di barbatelle di qualità

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1 AGRO.FREE Messa a punto di un protocollo operativo attento alla presenza di Agrobacterium vitisper la produzione di barbatelle di qualità Misura 124 -PSR DGR n del 03/08/2011 Convegno finale Cantina Sociale di Negrar (VR) 12 gennaio 2015

2 CRA-VIT (Angelini, Lucchetta, Filippin, Dalla Cia, Forte, Bazzo, Bertazzon) VITIVER (Falconi, Bevilacqua) Tutela e monitoraggio della sanità delle barbatelle di vite nella filiera vivaistica

3 ATTIVITA 1. Filiera vivaistica e innesti 2013: monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica identificazione dei punti critici di contaminazione da parte del patogeno 2. Prove in vitro per testare efficacia di diversi agenti disinfettanti/ batteriostatici/ battericidi 3. Filiera vivaistica e innesti 2014: disinfezione nelle fasi di idratazione, innesto e forzatura per: evitare ulteriori infezioni eliminare il patogeno 4. Tracciabilità molecolare

4 PRIMO ANNO

5 ATTIVITA 1. Filiera vivaistica e innesti 2013: monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica identificazione dei punti critici di contaminazione da parte del patogeno 2. Prove in vitro per testare efficacia di diversi agenti disinfettanti/ batteriostatici/ battericidi 3. Filiera vivaistica e innesti 2014: disinfezione nelle fasi di idratazione, innesto e forzatura per: evitare ulteriori infezioni eliminare il patogeno 4. Tracciabilità molecolare

6 ATTIVITA 1. Filiera vivaistica e innesti 2013: monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica identificazione dei punti critici di contaminazione da parte del patogeno 2. Prove in vitro per testare efficacia di diversi agenti disinfettanti/ batteriostatici/ battericidi 3. Filiera vivaistica e innesti 2014: disinfezione nelle fasi di idratazione, innesto e forzatura per: evitare ulteriori infezioni eliminare il patogeno 4. Tracciabilità molecolare

7 ATTIVITA A -1 Monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica monitoraggio dei terreni, delle PM e dei vigneti, per capire la diffusione del patogeno, soprattutto in forma latente controllo della filiera vivaistica e viticola, dagli impianti di PM fino all impianto del vigneto, ai fini di tutelare la sanità dei materiali di moltiplicazione ed identificare i punti critici della filiera vivaistica

8 RISULTATI -terreni del veronese - Analisi terreni da vivaio: Vivaio 2012: 17 negativi, 1 positivo Vivaio 2013: 30 campioni, tutti negativi Terreni dove c è stata vite negli ultimi 50 anni: 20 negativi, 1 positivo Terreno vicino a vigneto sintomatico: 3 positivi, 3 negativi

9 RISULTATI -Piante Madri Marze e Portainnesto - Analisi PMM E PMP non sintomatiche: 16 campioni di vari portinnesti 8 campioni di Corvina Tutti negativi

10 Analisi in vitrodi tralci da vigneti con viti sintomatiche (tumore evidente alla base): 40 campioni di Corvina, da 8 piante sintomatiche RISULTATI -vigneti sintomatici - 2 positivi, 38 negativi (5% positivi)

11 PIANO SPERIMENTALE MarzedaPMM dicorvina innesti 2013 Portinnesti tolleranti/ suscettibili Marze e talee idratate con / senza disinfezione chimica (Virkon S, Dupont) Forzatura in segatura/ forzatura in acqua Trattamentopost forzaturatrichodermaspp. (Remedier *) / non trattato Impiantoin vivaiocon / senzala presenzadia. vitis nel suolo *Trichoderma asperellum (ceppo ICC 012), Trichoderma gamsii(ceppo ICC 080)

12 8000 gemme Gemme/portinnesto sensibile (4000) 4000 talee portinnesto sensibile 4000 talee portinnesto resistente Gemme/portinnesto resistente (4000) Numero TESI: 2 Metà di ciascun gruppo trattate con disinfettante aziendale, metà con sperimentale (gruppi da 2000) 4 Metà di ciascun gruppo forzatura in segatura, metà in acqua (gruppi da 1000) 18 Metà di ciascun gruppo trattate con Trichodermacommerciale, metà non trattate (gruppi da 500) 16 Metà di ciascun gruppo piantate su terreno sano, metà su terreno infetto (gruppi da 250) 32

13 DATI CERNITA DOPO STERRO Resa media: 48,5% resa % Tesi peggiori: 140Ru, Vir kon, acq ua R 140 Ru NT Virkon acqua segatura NT Trichoderma terreno infetto terreno sano (conferma i dati postforzatura)

14 INCIDENZA TUMORI DOPO STERRO Incidenza media dei tumori: 3,5% Poche differenze fra tesi % sinto omatiche Virkon, Trichoderma, portinnesto: nessun effetto R 140 Ru NT Virkon acqua segatura NT Trichoderma terreno infetto terreno sano

15 ANALISI MOLECOLARI DOPO STERRO Eseguite solo sulle tesi da terreno infetto 144 campioni, analisi a pool di 3 % infette Quasi tutti infetti (media 94%) 0 Nessuna differenza statistica fra le diverse tesi per la presenza di infezione da A. vitis(per lo più latente) 110 R 140 Ru NT Virkon segatura acqua NT Trichoderma

16 ANALISI MOLECOLARI FILIERA % infezione Terreno infetto marze/talee da PM innestatrici avanzi di taglio innestitalea barbatelle preimpianto barbatelle allo sterro Pre-lavorazioni fase di innesto forzatura dopo sterro (vendita) forzatura

17 ATTIVITA 1. Filiera vivaistica e innesti 2013: monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica identificazione dei punti critici di contaminazione da parte del patogeno 2. Prove in vitro per testare efficacia di diversi agenti disinfettanti/ batteriostatici/ battericidi 3. Filiera vivaistica e innesti 2014: disinfezione nelle fasi di idratazione, innesto e forzatura per: evitare ulteriori infezioni eliminare il patogeno 4. Tracciabilità molecolare

18 Sostanze testate Prodotto Principio Attivo Bioaction ES Cu 2%+olii essenziali BIO FE Fe >8% Ipoclorito di sodio NaClO 3% Acqua acida Acqua Elettrolizzata Argento Ag Virkon (Rely+On Virkon) Potassio Peroxomonosolfato 50% JetFive Ac. Peracetico 5%+Ac. Acetico 10%+Perossido di Idrogeno 20% BIOSELECT 45 Zn+olii essenziali P-TRONCO (P33) Cu 0,5%+Zn 1,5% D50 Ac. Peracetico 5%+Ac. Acetico 10%+Perossido di Idrogeno 20%

19 PROVE DIINIBIZIONE INIBIZIONE IN VITRO mno lmno no jklmno hij efgh cdef efghi hijkl jklmno bc jklmno ijklmn hijk jklmno fghi defg bcd lmno ghi cde mno klmno jklmno ijklm jklmno fghi cde b b a , , ,125 0,25 0,5 1 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 2, , ,1 0,25 0,5 1 diametro alone inibizione (mm) o k BIO ES BIO FE Ag Virkon Jet5 BIO SEL P33 D50 NT Varechina Acqua acida Effetto inibitore aumenta con la concentrazione del prodotto Migliori risultati: Bio action ES, JetFive, D50, Ag

20 TRATTAMENTO CON ACQUA ACIDA IN VITRO A. vitis coltivato in vitro: messo a crescere in piastra vicino ad acqua acida: cresce, nessuno effetto messo a contatto per sommersione con acqua acida: muore Acqua acida, A. vitis cresce Varechina, A. vitis non cresce Probabilmente l acqua acida ha un effetto immediato, ma non persistente

21 TRATTAMENTO CON NaClO (VARECHINA) IN VIVO Valutazione della sopravvivenza di marze e talee immerse in NaClO al 3% per 2,5-5-7,5-10 minuti prima dell innesto Circa 250 talee di 1103 P messe a germogliare in vaso: nessun effetto significativo sulla sopravvivenza fino a 7,5 minuti talee viv ve a a a a b 0 2,5 5 7,5 10 minuti in NaClO

22 TRATTAMENTO CON OZONO IN VITRO 10 sono sufficienti per eliminare 100 A. vitis In altre 80 prove, aggiunte successive di 60 ozono sono 40 risultate più efficaci di 20 un unica somministrazione 0 sopravvivenza (%) 12 ppm 10' 8' 6' 4' 2' minuti di contatto 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ozono residuo (ppm)

23 SECONDO ANNO

24 ATTIVITA 1. Filiera vivaistica e innesti 2013: monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica identificazione dei punti critici di contaminazione da parte del patogeno 2. Prove in vitro per testare efficacia di diversi agenti disinfettanti/ batteriostatici/ battericidi 3. Filiera vivaistica e innesti 2014: disinfezione nelle fasi di idratazione, innesto e forzatura per: evitare ulteriori infezioni eliminare il patogeno 4. Tracciabilità molecolare

25 ATTIVITA 1. Filiera vivaistica e innesti 2013: monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica identificazione dei punti critici di contaminazione da parte del patogeno 2. Prove in vitro per testare efficacia di diversi agenti disinfettanti/ batteriostatici/ battericidi 3. Filiera vivaistica e innesti 2014: disinfezione nelle fasi di idratazione, innesto e forzatura per: evitare ulteriori infezioni eliminare il patogeno 4. Tracciabilità molecolare

26 PIANO SPERIMENTALE Raccolta gemme e talee innesti 2014 Idratazione standard Conservazione in frigo Disinfezione sperimentale Innesto Paraffinatura Forzatura Sterro e cernita Coltivazione Cernita, paraffinatura, impianto

27 PIANO SPERIMENTALE Raccolta gemme e talee innesti 2014 Idratazione standard Conservazione in frigo Disinfezione sperimentale Innesto Paraffinatura Forzatura Trattamenti prove Sterro e cernita Coltivazione Cernita, paraffinatura, impianto

28 PIANO SPERIMENTALE Raccolta gemme e talee innesti 2014 Idratazione standard analisi analisi Conservazione in frigo Disinfezione sperimentale Innesto Paraffinatura analisi Forzatura Trattamenti prove Sterro e cernita Coltivazione Cernita, paraffinatura, impianto

29 MATERIALI Gemme n. 8000: Corvina 48 solo piante con tumori, segnate in campo a febbraio 2014 Talee portinneston. 8000: 2 cloni di 41B comprati in Francia (clone E12 e clone 195) Tutto già idratato! RISULTATI MOLECOLARI: Analizzati campioni in pool da 5 talee Corvina 48: 7 sani, 1 infetto (12,5%) 41B clone 195: 4 sani, 0 infetti (0%) 41B clone E12: 4 infetti, 0 sani (100%)

30 PIANO SPERIMENTALE 1 Disinfezione: 8 tipi diversi Immersione in diversi disinfettanti per 60 minuti prima dell innesto (eccetto varechina, solo 8 ) 16 tesi, 500 innesti-talea per tesi tesi prodotto Concentrazione 1 - controllo positivo NaClO (varechina) 3% 2 - controllo negativo acqua disinfettante JetFive 0,5% 4 - disinfettante D50 1% 5 - disinfettante Bioaction ES 2% 6 - disinfettante P33 2% 7 - disinfettante Ozono disciolto 5 ppm 8 - BCA Remedier (Trichoderma) 250 g/hl Per ognuno dei due portinnesti

31 RISULTATI MOLECOLARI PRE-FORZATURA Differenze statisticamente significative tra portinnesti, indipendentemente dalle tesi % infetti Alcuni disinfettanti sembrano avere qualche effetto sul mantenimento della sanità o sul risanamento dei materiali ma le differenze non sono significative % infetti a P33 a Trichoderma 0 E12 b b b b Jet5 Ozono NaClO NT 195 b D50 b Bio ES

32 PIANO SPERIMENTALE 2 Forzatura: 8 tipi diversi 1. Vermiculite 2. Segatura normale NT 3. Segatura con Trichoderma(Remedier) 4. Segatura bagnata con acqua acida 5. Acqua normale NT 6. Acqua con ozono disciolto ogni 2-5 gg 7. Acqua acida, con ricambio ogni 5 gg 8. Acqua con Zn metalosate In totale 128 tesi (16x8), ciascuna con circa 60 innesti-talea delle 16 tesi di idratazione

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34 RESE ALLA CERNITA POST-FORZATURA a a b b b b % vive c 20 d 0 Trichoderma Acqua JetFive O3 P33 D50 Bio Action ES NaClO Vitalità innesti post-forzatura in relazione alla disinfezione effettuata in pre-forzatura Forte mortalità di NaClO (varechina)

35 RESE ALLA CERNITA POST-FORZATURA a a a a b b % vive 40 c 20 0 d Acqua + ozono Segatura + Trichoderma Segatura con acqua acida Vermiculite Segatura Acqua + acqua acida Acqua + rame (standard) Acqua + metalosate Vitalità innesti post-forzatura in relazione al tipo di forzatura Zn metalosate: tutte morte (concentrazione troppo alta?) Controllo in acqua (NT): metà rese (impianto tardivo? Ma differenza tra le diverse forzature in acqua con disinfettanti)

36 RISULTATI MOLECOLARI POST-FORZATURA Portinnesti: Differenze statisticamente significative tra portinnesti indipendentemente dalle tesi (ma peggioramento per 195 rispetto al dato in pre-forzatura) Disinfezioni: 100 Bio action ES ha un effetto sul mantenimento della sanità e sul risanamento dei materiali D50 presenta efficacia intermedia tra NT e Bio action ES % infetti a % infetti Non Trattato (acqua) D50 Bio Action ES ab E b

37 RISULTATI MOLECOLARI POST-FORZATURA a a a a a a a a Segatura + Acqua acida Vermiculite Segatura + Trichoderma Acqua + Ozono Acqua + Zn metallosate Segatura Acqua Acida Acqua + rame (standard) % infetti Forzature: Nessuna differenza significativa tra le diverse forzature Aumento della contaminazione rispetto al dato in pre-forzatura

38 ATTIVITA 1. Filiera vivaistica e innesti 2013: monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica identificazione dei punti critici di contaminazione da parte del patogeno 2. Prove in vitro per testare efficacia di diversi agenti disinfettanti/ batteriostatici/ battericidi 3. Filiera vivaistica e innesti 2014: disinfezione nelle fasi di idratazione, innesto e forzatura per: evitare ulteriori infezioni eliminare il patogeno 4. Tracciabilità molecolare

39 CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE PER TRACCIABILITA DELLE FONTI DI INFEZIONE SCOPO: Individuare un metodo molecolare per distinguere ceppi di agrobatterio provenienti da diverse regioni geografiche del mondo In questo modo, per esempio, posso determinare l origine dell agrobatterio ritrovato in un lotto di barbatelle vendute all estero: vivaista o viticoltore? ATTIVITA : Individuati 5 geni potenzialmente variabili geneticamente Scelto uno di questi con variabilità genetica del 13% Analizzati con sequenziamento circa 30 ceppi provenienti da tutto il mondo

40 RISULTATI Non c è correlazione fra diversità genetica e zona geografica di origine (probabilmente causa dello scambio di materiali viticoli nel mondo) C è correlazione con il tipo di opina prodotta

41 CONCLUSIONI Primo anno 1. Definizione dei punti critici della filiera vivaistica: Idratazioneditaleee marze Innesto Forzatura 2. Valutazione sostanze battericide efficaci in vitro: Risultati interessanti applicabilità in vivaio? Secondo anno 3. Valutazione metodi per riduzione dei sintomi e della presenza di A. vitis nella filiera: Efficacia di alcuni prodotti sul mantenimento della sanità del materiale Efficacia nel risanamento di materiale già infetto 4. Tracciabilità geografica dei ceppi: Non attuabile

42 Grazie per l attenzione!

43 PROGETTO AGRO.FREE Messa a punto di un protocollo operativo attento alla presenza di Agrobacterium vitis per la produzione di barbatelle di qualità Misura 124 "Cooperazione per lo sviluppo di nuovi prodotti, processi e tecnologie nel settore agricolo, alimentare e forestale" PSR DGR n del 03/08/2011

44 PARTNER Centro di Ricerca per la Viticoltura (CRA-VIT) Dipartimento Territorio e Sistemi Agro Forestali Te.S.A.F., Università degli Studi di Padova (UNIPD) Consorzio per la Valorizzazione dei Prodotti Ortoflorovivaistici Veronesi (VITIVER) IN COLLABORAZIONE CON: Servizio Fitosanitario della Regione Veneto Provincia di Verona Associazione Florovivaisti Veneti Vivai Bevilacqua e Vivai Falconi Altri vivaisti associati a VITIVER

45 OBIETTIVI tutela della sanità delle barbatelle di vite nella filiera vivaistica con riguardo alle infezioni da agrobatterio (Agrobacterium vitis), agente del tumore batterico della vite miglioramento delle condizioni sanitarie e delle capacità di tolleranza alla malattia in vigneto COME? definizione di un protocollo a basso impatto ambientale, attuabile in vivaio, per la produzione di materiale di moltiplicazione esente dal batterio e/o maggiormente resistente ad infezioni in campo

46 LA MALATTIA Il tumore della vite è una proliferazione anomala dei tessuti legnosi

47 E causato dal batterio Agrobacterium vitis, patogeno che cresce solo su vite e diffuso in tutti gli areali viticoli A. vitis è in grado di sviluppare infezioni su vite a seguito di lesioni meccaniche e da freddo o danni da temperature ed umidità elevate Non sempre causa il caratteristico tumore, ma molte volte rimane latente nella pianta, senza causare danni apparenti, per diverso tempo È in grado di sopravvivere in vecchi tumori in disfacimento e nei residui di vite nel suolo, anche in assenza dell ospite, per almeno due anni, rappresentando un ulteriore serbatoio di infezione

48 NEL VENETO Il tumore della vite era già conosciuto in passato nelle nostre zone, dove appariva ciclicamente o in forma sporadica Negli ultimi anni ha avuto un esplosione improvvisa, causata dalle particolari condizioni climatiche dell inverno , in cui la temperatura ha raggiunto valori molto bassi Da allora si è assistito ad una crescente diffusione dei tumori, specie nei vigneti al primo e secondo anno Le infezioni che avvengono nei primi anni dall impianto portano al progressivo indebolimento delle viti colpite, con conseguenze negative dal punto di vista qualiquantitativo delle produzioni e gravi danni all economia del settore vivaistico e vitivinicolo

49 LA LOTTA La lotta a tale malattia presenta notevoli problematiche, a causa di: mancanza di strategie di difesa efficaci Le strategie di difesa da mettere in atto nei vigneti infetti sono utili a limitare i danni, ma non riescono ad eliminare il batterio, che non può essere eradicato dal territorio una volta instauratosi latenza dei sintomi Agrobatterio è ubiquitario e molto spesso presente nelle viti e nelle barbatelle, senza causare sintomi

50 LOTTA IN VIGNETO: PREVENTIVA Fase pre-impianto vigneto: scartare le barbatelle con tumori/ingrossamenti anomali evitare terreni pesanti, con ristagni idrici, gelivi Evitare pratiche colturali che provocano ferite alla vite (spollonature tardive, grossi tagli di ritorno, lavorazioni meccaniche che provocano ferite) Effettuare potature bilanciate ed evitare sbilanci produttivi Viti giovani: proteggere il tronco da danni da gelo (rincalzi) Evitare crescite vigorose a fine stagione in modo da rendere le piante più resistenti al freddo

51 LOTTA IN VIGNETO: CURATIVA Piante poco infette: rimuovere ed eliminare i tumori prima possibile effettuare trattamenti al bruno con prodotti rameici per proteggere le ferite da nuove infezioni (ossicloruri di rame g/hl, poltiglia bordolese 1500 g/ hl) Piante molto infette, specie se giovani: estirpo ed accurata eliminazione dei residui radicali arieggiare la buca per l intero anno con eventuale distribuzione di calce viva piantagione l anno successivo

52 LOTTA IN VIVAIO Termoterapia non elimina il patogeno Portainnesti e cv. resistenti? Trattamenti chimici possibili in fase di innesto: antibiotici e ossichinoline non ammessi altri principi attivi? Induttori di resistenza? Selezione di antagonisti (BCAs, Biological Control Agents)

53 ENDOFITI E BCA Alcuni microrganismi possono agire come antagonisti naturali di vari patogeni delle piante. Tra i più noti in letteratura: Trichoderma e Gliocladium tra i funghi, Bacillus e Pseudomonas tra i batteri Gli endofiti sono microrganismi che vivono nei tessuti interni della pianta ospite senza danneggiarla visivamente La comunità microbica endofitica in grado di colonizzare la vite può essere fonte di candidati per agenti di biocontrollo Gli agenti di biocontrollo sono uno dei mezzi più promettenti per il futuro nella difesa delle piante contro patogeni e parassiti Vantaggi: basso impatto ambientale e assenza di residui nel prodotto finale

54 ATTIVITÀ PREVISTE monitoraggio sanitario ed ottimizzazione delle operazioni della filiera produttiva vivaistica prove sperimentali, in campo ed in serra, per la verifica dell efficacia del trattamento di innesti-talea e di barbatelle con prodotti battericidi e agenti di biocontrollo per il contenimento di A. vitis ricerca di nuovi agenti di controllo biologico

55 LAVORO IN SINERGIA CRAVIT: coordinamento, diagnosi e tracciabilità dei patogeni nella filiera vitivinicola UNIPD: ricerca ed uso di agenti di biocontrollo, prova in serra VITIVER: prove sperimentali in campo, innesti Fitosanitario, provincia, vivaisti: informazioni dal territorio, suggerimenti e collaborazione per una migliore conduzione ed implementazione degli esperimenti

56 Università degli Studi di Padova Dip.to Territorio e Servizi Agro-Forestali Lotta al tumore batterico della vite tramite utilizzo di BCA Prof. Roberto Causin Dr. Davide Ferrigo

57 Il controllo biologico la riduzione della densità di inoculo o delle attività patogeniche del patogeno nel suo stato attivo o dormiente, ottenuta attraverso l introduzione, l impiego o la manipolazione di uno o più organismi

58 BCAs: Agenti di Controllo Biologico Microrganismi (funghi e batteri) che agiscono nei confronti dei patogeni per: Competizione nutrienti spazio Produzione sostanze attive antibiosi (sostanze antifungine/antibiotiche) enzimi litici (chitinasi, glucanasi, cellulasi) segnali inducenti resistenza sistemica nella pianta (PGPR) Iperparassitismo

59 Distribuzione dei BCA su vite Trattamento al terreno Inoculo con BCA a livello radicale al momento dell impianto Inoculo in prossimità delle radici nei vigneti già impiantati Inoculo persistente se riesce a competere con la comunità microbica residente Inoculo endofitico L inoculo con specie endofitiche andrebbe effettuato al momento della produzione della barbatella I BCA endofitici selezionati sono solitamente competitivi e l inoculo persiste negli anni Trattamento fogliare L inoculo fogliare ha una persistenza ridotta e mal si concilia con i normali trattamenti di un vigneto.

60 Stato dell arte dei BCA contro A. vitis A. radiobacter K84 Produce agrocina e funziona solo con i ceppi sensibili ad agrocina Può trasferire la propria resistenza all agrocina A. radiobacter K1026 Batterio geneticamente modificato Uguale al ceppo K84 ma non può trasferire il plasmide di resistenza A. vitis F2/5 Bassa produzione di sostanze antibiotiche Inibisce A. tumefaciens e A. rhizogenes ma non altri A. vitis A. vitis VAR03-1 Produce sostanze antibiotiche, generalmente il più efficace Tu#avia i ceppi avirulen. possono acquisire il plasmide da un ceppo virulento e diventare patogeni a loro volta

61 PROVE IN VITRO AGRO.FREE Impiego di BCA per il controllo del tumore batterico La ricerca è stata suddivisa nelle seguenti fasi: isolamento della popolazione fungina e batterica endofita da tralci e foglie di viti asintomatiche in vigneti sintomatici per il tumore batterico; preliminare identificazione morfologica o molecolare delle colonie ottenute; selezione di BCA da prodotti commerciali non registrati per vite saggi in vitro per valutare la capacità antagonista degli isolati; identificazione molecolare degli isolati di interesse;

62 PROVE IN VIVO inoculo in pianta degli isolati antagonisti e valutazione delle capacità antagonista in vivo; valutazione delle capacità dei diversi ceppi di Trichoderma spp. di colonizzare le radici; quantificazione molecolare del patogeno e degli antagonisti in estratto di pianta.

63 Risultato degli isolamenti In tutto sono stati isolati circa 500 ceppi fungini e 80 ceppi batterici Tra gli organismi fungini isolati, i generi più rappresentati sono: Acremonium (17DP2), Alternaria, Arthrinium, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Cephalosporium, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Nigrospora, Penicillium, Phialophora, Phomopsis, Pithomyces, Ramichloridium, Sordaria, Trichoderma (16AL1), Tritirachium, Ulocladium. Tra gli organismi batterici isolati, i generi più rappresentati sono: Bacillus, Brevibacillus, Curtobacterium (Cf5,Cf38), Enterobacter, Paenibacillus, Streptomyces, Xanthomonas

64 Inibizione della crescita di A. vitis in presenza di alcuni antagonisti endofitici o commerciali * * * * * * * * * Riduzione percentuale nei confronti dei ceppi di A. vitis 3T4 (rosso), 3T11 (giallo) e 3T12 (blu) * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

65 C. flaccumfaciens Cf5 e Cf38 hanno attività di antibiosi nei confronti di A. vitis T. harzianum 16AL1 e A. alternatum 17DP2 non hanno alcuna attività di antibiosi ma bloccano la crescita di A. vitis per competizione Dei ceppi commerciali solo B. subtilis è stato in grado di inibire A. vitis per antibiosi, i Trichoderma agiscono per competizione

66 Inibizione in pianta di A. vitis con BCA endofitici T. harzianum 16AL1 C. flaccumfaciens Cf5 A.alternatum 17DP2 C. flaccumfaciens Cf38 con BCA commerciali Trifender T. asperellum Trianum T. harzianum T22 Micosat F B. subtilis Rizocore T. harzianum Micosat F T. harzianum TH01

67 Rilievo delle piante sintomatiche (%) su 110 Richter /Corvinone * * * * * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

68 Rilievo dell indice di malattia (%) su 110 Richter /Corvinone * * * * * Indice di mala7a calcolato su 5 classi in base alle dimensioni del tumore * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

69 Persistenza del Trichoderma sulle radici a 6 mesi dall inoculo * * * * T. asperellum contenuto in TRIFENDER è risultato il Trichoderma più persistente nel tempo a livello radicale. * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

70 Inibizione in pianta di A. vitis in 41B/Corvinone Trifender T. asperellum Micosat F B. subtilis A. alternatum 17DP2 C. flaccumfaciens Cf5 C. flaccumfaciens Cf38

71 Piante sintomatiche (%) nei due anni di sperimentazione * * * * * * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

72 Indice di malattia (%) nei due anni di sperimentazione * * * * * * Indice di mala7a calcolato su 5 classi in base alle dimensioni del tumore * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

73 Quantificazione di A. vitis su barbatelle tramite RealTime-PCR * * * Diminuzione di 48, 45 e 33% nei trattati con Cf38, B. subtilis e A. alternatum * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

74 Quantificazione dei BCA su barbatelle * * * Aumento di 136, 55 e 100% rispettivamente per Cf5, B. subtilis e A. alternatum * Statisticamente efficace rispetto al controllo A. vitis (P<0.05)

75 Conclusioni Curtobacterium flaccumfaciens BAC5 e BAC38 selezionati inizialmente per le abilità di antibiosi, 50 e 40% rispettivamente. Hanno ridotto del 80% circa l incidenza delle piante sintomatiche l indice di malattia. Sono in grado di colonizzare i tessuti e controllare l inoculo di A. vitis Possibile modo di azione in vite: Agisce da antagonista per antibiosi Agisce da antagonista per competizione Migliora la salute della pianta tramite solubilizzazione di nutrienti (ferro, fosforo, etc) Limita lo stress per la vite mantenendo il patogeno in fase endofita The Endophyte Curtobacterium flaccumfaciens Reduces Symptoms Caused by Xylella fastidiosa in Catharanthus roseus. Lacava et al The Journal of Microbiology 45,

76 Conclusioni Bacillus subtilis B. subtilis B63 contenuto in Micosat F ha mostrato la capacità di inibire del 40% la crescita di A. vitis Nei due anni di prova il batterio inoculato al fusto ha ridotto del 80% circa sia l incidenza delle piante sintomatiche che l indice di malattia. In grado di colonizzare i tessuti e controllare l inoculo di A. vitis Possibile modo di azione in vite: Agisce da antagonista per antibiosi Agisce da antagonista per competizione Characterization of new bacterial biocontrol agents Acinetobacter, Bacillus, Pantoea and Pseudomonas spp. mediating grapevine resistance against Botrytis cinerea. Trotel-Aziza et al Environmental and Experimental Botany 64, 21 32

77 Trichoderma asperellum Conclusioni Migliore livello di colonizzazione e persistenza tra i Trichoderma Controlla A. vitis per competizione e non per antibiosi Unico Trichoderma a ridurre del 70% sia l incidenza e l indice di malattia. Acremonium alternatum A. alternatum controlla A. vitis per competizione e non per antibiosi A. alternatum ha mostrato la capacità di ridurre del 80% circa sia l incidenza delle piante sintomatiche che l indice di malattia. Possibile modo di azione in vite: Attiva un sistema di resistenza sistemica indotta Migliora la salute della pianta tramite solubilizzazione di nutrienti (ferro, fosforo, etc) Limita lo stress per la vite mantenendo il patogeno in fase endofita Suppression of clubroot (Plasmodiophora brassicae) development in Arabidopsis thaliana by the endophytic fungus Acremonium alternatum. D. Jäschke et al Plant Pathology 59, ,

78 Ipotesi di implementazione per le normali tecniche produttive. Produzione di barbatelle inoculate alla radice con ceppi specifici di Trichoderma Pratica a basso costo che migliora le condizioni generali della pianta e la resistenza a taluni patogeni tra cui P. viticola e B. cinerea Produzione di barbatelle inoculate endofiticamente con un mix di BCA selezionati Pratica che migliora la comunità endofitica della pianta Sviluppo di un metodo efficace e a basso impatto per l inoculazione endofitica senza compromettere la resa Ipotesi finale è produrre barbatelle contemporaneamente trattate alla radice e inoculate endofiticamente per offrire una protezione integrata e ad ampio spettro verso A. vitis ed altri patogeni

79 Biological Control of Crown Gall of Grapevine, Rose, and Tomato by Nonpathogenic Agrobacterium vitis Strain VAR03-1. Kawaguchi, et al Biological control 98, Trichoderma harzianum Enhances Antioxidant Defense of Tomato Seedlings and Resistance to Water Deficit. Mastouri et al MPMI 25, A Basic Peroxidase Isoenzyme, Marker of Resistance Against Plasmopara viticola in Grapevines, is Induced by an Elicitor from Trichoderma viride in Susceptible Grapevines Barceló et al Journal of Phytopathology 144, Biological soil treatment with Trichoderma harzianum to control root rot disease of grapevine (Vitis vinifera L.) in newly reclaimed lands in Nobaria province. El-Mohamedya et al Archives Of Phytopathology And Plant Protection 43

80 Il tumore della vite appare saltuariamente e ciclicamente, ma l agrobatterio è presente abbondantemente nei vigneti e nelle barbatelle Una lotta specifica in vivaio è possibile: Battericidi nelle fasi critiche della filiera Inoculo delle barbatelle con BCA CONCLUSIONI

81 PROSPETTIVE C è ancora da studiare in ambedue i filoni: Tempi e concentrazioni dei prodotti battericidi più validi (ottimizzare resa e disinfezione) Prove in vivaio su grandi numeri con BCA CERCASI FINANZIATORI! Si può ridurre l inoculo, ma non si può eliminare il patogeno Dobbiamo imparare a conviverci!