Kit per test APPY1 - Italiano

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1 Kit per test APPY1 - Italiano Uso previsto Il test APPY1 è un test diagnostico in vitro a indice multivariato (IVDMIA) utilizzato come ausilio nell identificazione dei pazienti a basso rischio di appendicite acuta. Il test APPY1 misura le concentrazioni dell eterocomplesso di proteine mieloide-correlate MRP 8/14 (calprotectina) e della proteina C reattiva (CRP) nel plasma EDTA mediante saggio immunologico a flusso laterale. Le concentrazioni quantitative di MRP 8/14 e CRP, in aggiunta a un conteggio determinato indipendente dei globuli bianchi (WBC), vengono quindi calcolate mediante un algoritmo proprietario pre-programmato per generare un risultato del test APPY1. Indicazioni per l uso Il test APPY1 è indicato per l uso in pazienti pediatrici, adolescenti e giovani, di età compresa tra 2 e 20 anni, con dolori addominali e altri segni e sintomi fisici e clinici indicativi di appendicite acuta. Esclusivamente per uso professionale Sommario e spiegazione La diagnosi di pazienti che presentano dolore addominale rimane una delle problematiche più comuni e difficili nella medicina di emergenza. Oltre 22,2 milioni di pazienti si sono recati presso i reparti di pronto soccorso degli ospedali di Europa e Stati Uniti nel 2010 per dolore addominale come problema principale. 1,2 L appendicite registra la massima incidenza nei pazienti pediatrici, adolescenti e giovani di età compresa tra 10 e 19 anni, 3 ma la diagnosi di appendicite in questi pazienti rimane difficile poiché essi presentano un ampia varietà di caratteristiche cliniche atipiche. 4 Fino al 50% di neonati e bambini con appendicite acuta (AA) possono presentare segni e sintomi atipici 5 in grado di ritardare la diagnosi e portare a complicazioni potenzialmente fatali quali appendice perforata, ascesso addominale, peritonite, sepsi e shock. Quindi è importante identificare strumenti diagnostici che facilitino una diagnosi obiettiva, tempestiva e accurata e la stratificazione del rischio di pazienti con sospetta AA. Attualmente, la capacità di diagnosticare con precisione l appendicite è limitata all acquisizione di segni e sintomi fisici e clinici e a varie modalità diagnostiche. Sono stati sviluppati numerosi strumenti di previsione clinica che fanno uso di sintomi classici quali data point come ausilio nella diagnosi dell appendicite. Le prestazioni di questi sistemi di punteggio non sono coerenti e sono altamente variabili. 5,6 Inoltre, tali sistemi non vengono utilizzati di routine dai reparti di pronto soccorso. 7 Viene eseguito di routine il conteggio dei globuli bianchi, che si è tuttavia dimostrato di limitata utilità quale singolo marker, anche quando combinato con segni e sintomi clinici di AA. 8 In funzione della valutazione del rischio iniziale del paziente del svolta dal medico, possono essere ordinati imaging diagnostico, incluse l ecografia addominale (US) o la tomografia computerizzata (TC) con o senza contrasto, nei casi in cui la presentazione clinica è equivoca e sono necessarie più informazioni. Mentre la TC è accurata nella diagnosi dell appendicite acuta quando l appendice possa essere visualizzata con chiarezza, essa comporta un rischio significativo dovuto all aumentata esposizione alle radiazioni ionizzanti, accrescendo pertanto la dipendenza da test meno dannosi Report recenti hanno mostrato che l uso della TC nei pazienti in età pediatrica ha raggiunto una stabilizzazione; tuttavia, la preoccupazione correlata all esposizione alla TC, specialmente nei pazienti giovani, non è diminuita. 12,13 La combinazione di tre biomarker nel test APPY1, anziché di un singolo marker, aumenta la capacità di identificare pazienti a basso rischio. 7 Il test APPY1, impiegato in associazione con risultati fisici e clinici, fornisce ulteriori informazioni obiettive che consentono di guidare le decisioni nella stratificazione del rischio di pazienti che presentano dolore addominale indicativo di AA. I pazienti identificati come a basso rischio dal test APPY1 possono essere gestiti in modo maggiormente conservativo, ad es. con test o imaging minimi oppure in assenza di essi, con la sola osservazione o dimissione precoce. Principi del test Il sistema APPY1 comprende lo strumento APPYReader (il lettore), un vassoio di test APPY1 monouso, una fiala monouso di buffer di diluizione e una fiala monouso di anticorpi liofilizzati coniugati con microparticelle marcate con un colorante fluorescente. La procedura di test richiede l aggiunta del plasma del paziente al buffer di diluizione, seguita dalla ricostituzione del coniugato liofilizzato con il plasma/buffer diluito. I complessi MRP 8/14 e CRP disponibili nel campione diluito del paziente sono legati dal coniugato dell anticorpo ricostituito. Un aliquota della miscela viene quindi applicata al vassoio di test, dove i complessi MRP 8/14 e CRP ora marcati con colorante fluorescente si legano agli anticorpi corrispondenti della zona di acquisizione sulla membrana di nitrocellulosa. Il vassoio di test viene inserito immediatamente nel lettore che misura la concentrazione di ciascun analita presente nel APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 45

2 campione in base all intensità della fluorescenza di ciascuna zona di acquisizione della linea di test. La concentrazione di MRP 8/14 e CRP presente nel campione viene calcolata in base alle curve di calibrazione pre-programmate sui tag RFID incorporati in ogni singolo vassoio di test. Le concentrazioni dei due marker, in combinazione con i valori del conteggio dei globuli bianchi ottenuti da un analizzatore ematologico dell ospedale e inseriti in un lettore dedicato, vengono utilizzate per generare i risultati del test APPY1 del paziente mediante l uso di un algoritmo proprietario pre-programmato. Il sistema APPY1 comprende inoltre i controlli di qualità elettronici (a secco) e procedurali (liquido) per garantire l integrità dei risultati. Il tempo totale necessario per l elaborazione del campione e per l esecuzione del test è di circa 20 minuti. La MRP 8/14 (nota anche come S100A8/A9 o calprotectina), un complesso di proteine che si legano al calcio, è presente nel citoplasma dei neutrofili ed è associata a condizioni infiammatorie acute aspecifiche. È stato rilevato che la MRP 8/14 è elevata in modo differenziale nel tessuto dell appendice e nel sangue periferico in pazienti con appendicite acuta La proteina C reattiva (CRP), prodotta dal fegato, è associata a infiammazione. La CRP è una proteina di fase acuta che risulta elevata in varie malattie e condizioni associate a infiammazione acuta aspecifica. Concentrazioni elevate di CRP nel sangue periferico sono state correlate ad appendicite acuta Le caratteristiche prestazionali analitiche del dosaggio della CRP con il test APPY1 sono coerenti con quelle del dosaggio della CRP a elevata sensibilità (hscrp), come descritto in basso. Valori totali elevati della formula leucocitaria sono associati ad appendicite acuta quando i sintomi sono presenti per 24 ore o più. 22 La leucocitosi non è specifica dell AA poiché è osservata anche in varie altre condizioni infettive e disturbi infiammatori. Gli studi suggeriscono che una normale formula leucocitaria, in combinazione con bassi livelli di MRP 8/14 e CRP e altri biomarker, riduce la probabilità che sia presente appendicite acuta. 18 Reagenti e materiali Kit per test APPY1, 25 test F10000 Vassoio di test APPY1, sacchetto, 25 Membrana in nitrocellulosa con striscio di anticorpi monoclonali specifici per CRP e MRP 8/14 e una IgY policlonale di capra non correlata anti-pollo come controllo interno. Tampone di test APPY1, 990 µl, 25 Coniugato di test APPY1, liofilizzato, 25 Istruzioni per l uso, 1 Materiali necessari, ma non forniti Kit APPYReader F10008 Vassoio APPYReader QC, sacchetto, 1 F10004 Kit di controllo APPY1, 10 fiale F10005 Livello di controllo 1 APPY1, 40 µl, 5 Livello di controllo 2 APPY1, 40 µl, 5 Centrifuga per trattamento del plasma, rotore ad angolo fisso 45 gradi o rotore oscillante, in grado di raggiungere x g ± 100 (RCF, forza centrifuga relativa) Micropipette calibrate e punte monouso per micropipette in grado di dispensare 10 µl, 70 µl e 150 µl Miscelatore vortex Minicentrifuga (per centrifugare i controlli se necessario) Dispositivi di protezione personale e contenitori per smaltimento di rifiuti pericolosi sotto il profilo biologico Conservazione e stabilità Subito dopo il ricevimento, il kit per test APPY1 deve essere conservato a 2-8 ºC (35,6-46,4 ºF) lontano dalla luce diretta. I componenti del kit devono essere conservati nella confezione originale, intatta, fino al momento dell utilizzo. Il kit per test APPY1 è stabile fino alla data di scadenza stampata sulla scatola del kit e sui componenti del test, se conservato come raccomandato. Il vassoio APPYReader Quality Control (QC) deve essere conservato a C ( F) nella confezione originaria, non aperta, fino al primo utilizzo. Il vassoio QC è riutilizzabile e deve essere richiuso nel sacchetto originale subito dopo ogni utilizzo. Non gettare. Proteggere dall esposizione alla luce diretta. Il kit di controllo APPY1 deve essere conservato nella confezione originale a una temperatura -20 C (-4 F). Non conservare in un congelatore no-frost. Scongelare prima dell uso solo il numero di fiale di controllo APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 46

3 necessarie e gettarle dopo l analisi. Le fiale di Controllo 1 e Controllo 2 APPY1 non devono essere ricongelate dopo lo scongelamento. Precauzioni Precauzioni generali Esclusivamente per uso professionale Ciascun vassoio di test è destinato esclusivamente a un singolo utilizzo su un solo campione di un paziente. I vassoi di test non possono essere riutilizzati. Non miscelare i componenti di diversi lotti di kit di test, poiché i componenti sono abbinati all interno di ciascun lotto di kit per garantire prestazioni ottimali. Non rimuovere i vassoi di test dal sacchetto fino al momento dell uso. Non rimuovere dalla confezione il coniugato di test fino al momento dell uso. Tra un utilizzo e il successivo, conservare il vassoio APPYReader QC nel sacchetto originale richiudibile che protegge dalla luce. Dopo ogni utilizzo, riporre il vassoio QC nel sacchetto originale richiudibile. Non gettare. Non usare fiale di controllo APPY1 scongelate e ricongelate. Non forare o danneggiare il vassoio di test durante la manipolazione prima dell uso. Qualora venga forato o danneggiato, gettare il vassoio e usarne uno nuovo. Non usare i componenti del kit oltre la data di scadenza indicata sulla scatola del kit e sulle etichette dei componenti stessi. Dopo aver caricato il campione da analizzare nell apposito pozzetto del vassoio di test, chiudere immediatamente il cassetto del vassoio per avviare il ciclo di test. Un ritardo può determinare un risultato non valido. Per ottenere un risultato valido occorre inserire un valore confermato della formula leucocitaria del paziente entro 90 minuti dall avvio del ciclo di test. Tutti i materiali che sono stati a contatto con sangue o emoderivati di origine umana devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi sotto il profilo biologico. Il kit di controllo APPY1 contiene derivati di pool di plasma di origine umana. Ciascuna unità di donatore è stata analizzata mediante metodi approvati dalla FDA ed è risultata negativa per HBsAg, HCV, HIV-1, HIV-2, HIV-1Ag, HIV-1-NAT, ALT e sifilide. Poiché nessuno degli attuali metodi di analisi è in grado di offrire la totale garanzia relativamente all assenza di agenti infettivi, i reagenti devono essere maneggiati come plasma umano potenzialmente infetto. Si raccomanda di attenersi alle precauzioni universali e alle norme di sicurezza relative agli agenti patogeni a trasmissione ematica. Ogni laboratorio deve seguire le linee guida stabilite internamente in relazione alle prassi di sicurezza del laboratorio stesso. Il tampone di test contiene azoturo di sodio allo 0,095% come conservante. In caso di contatto cutaneo, sciacquare con acqua abbondante. L azoturo di sodio può reagire con tubazioni in piombo e/o in rame, formando azidi metalliche esplosive; far scorrere abbondante acqua durante lo smaltimento. Tutti i campioni dei pazienti devono essere manipolati come materiali in grado di trasmettere malattie. Si raccomanda di attenersi alle precauzioni universali e alle norme di sicurezza relative agli agenti patogeni a trasmissione ematica. Ogni laboratorio deve seguire le linee guida stabilite internamente in relazione alle prassi di sicurezza del laboratorio stesso. Prelievo e conservazione dei campioni Il sangue del paziente deve essere prelevato tramite normale venipuntura o linea endovenosa (con flush) in una provetta K2 EDTA (tappo color lavanda) contenente 1,8 mg di EDTA/cc di sangue. Dopo il prelievo ematico, centrifugare la provetta per 10 minuti a 1300 x g ± 100 (RCF) a temperatura ambiente. La centrifugazione deve iniziare entro una (1) ora dal prelievo del campione. La centrifuga deve essere a rotore fisso con un angolo maggiore di 45 o a rotore oscillante. Per calcolare la conversione di RPM in RCF, consultare il manuale d uso per il modello di centrifuga o contattare l assistenza tecnica di Venaxis. Procedura di test Impostazione del Lettore Eseguire l impostazione del lettore come descritto nel manuale d uso dell APPYReader e/o nella guida all avvio. Accedere al lettore con l ID operatore assegnato. Attendere che il lettore si riscaldi per almeno 10 minuti prima di eseguire l analisi di un controllo o di campioni dei pazienti. APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 47

4 Preparazione dei reagenti per il QC e il test Se si utilizza il controllo di qualità (QC) liquido, rimuovere il necessario numero di fiale di Controllo 1 e Controllo 2 dal kit di controllo APPY1 conservato a -20 C. Scongelare a temperatura ambiente mentre il lettore si riscalda. Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni per l uso del kit di controllo APPY1. Rimuovere una quantità sufficiente di vassoi, fiale di tampone e fiale di coniugato da un kit per test APPY1 conservato a 2-8 C necessaria per completare tutti i test (QC e campioni dei pazienti). Attendere che i componenti raggiungano la temperatura ambiente mentre il lettore si riscalda. Utilizzo del vassoio QC Utilizzarlo ogni giorno in cui si eseguono test dei pazienti e/o prima di eseguire i Controlli 1 e 2. I campioni dei pazienti non possono essere analizzati a meno che il vassoio QC non abbia riportato un risultato valido (PASS (RIUSCITO)) entro le ultime 24 ore. IMPORTANTE: per mantenere la durata utile prevista del vassoio QC, evitare l esposizione alla luce. Conservare e richiudere il vassoio QC nel sacchetto originale in alluminio subito dopo ogni utilizzo. Non gettare il vassoio QC fino alla data di scadenza. Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni per l uso del vassoio APPYReader QC. 1. Accedere come operatore o passare alla modalità operatore. 2. Premere per visualizzare la schermata Main Menu (Menu principale). 3. Usare e per evidenziare Maintenance (Manutenzione) e premere Select (Seleziona). 4. Usare e per evidenziare Check APPYReader (Controlla APPYReader) e premere Select (Seleziona). 5. Usare e per evidenziare APPYReader QC Cassette (Vassoio APPYReader QC) e premere Select (Seleziona). Il cassetto del lettore si apre e viene visualizzata la schermata Insert Cassette (Inserisci vassoio). Al termine del test viene visualizzata la schermata APPYReader QC Cassette (Vassoio APPYReader QC). 6. Per stampare il risultato del vassoio QC: a. Premere Options (Opzioni). b. Usare e per evidenziare Print Result (Stampa risultato) e premere Select (Seleziona). 7. Per inviare il risultato a un sistema informatico di laboratorio, consultare il manuale d uso dell APPYReader. 8. Premere Back (Indietro) per ritornare alla schermata Check APPYReader (Controlla APPYReader) o premere per ritornare alla schermata Main Menu (Menu principale). Valori attesi a. Se i risultati dell unità di fluorescenza relativa (RFU) rilevati sul vassoio QC rientrano negli intervalli accettabili programmati sul chip RFID del vassoio QC, il risultato del test viene refertato come PASS (RIUSCITO). b. Se i risultati RFU rilevati sul vassoio QC non rientrano negli intervalli accettabili programmati sul chip RFID del vassoio QC, il risultato del test viene refertato come FAIL (NON RIUSCITO) e all operatore non è consentito analizzare i campioni dei pazienti. Ripetere il test con un altro vassoio QC. c. Se il risultato del secondo vassoio QC è PASS (RIUSCITO), procedere con l analisi dei campioni dei pazienti. d. Se non è disponibile un altro vassoio QC diverso o se il risultato del secondo vassoio QC è FAIL (NON RIUSCITO), il lettore resterà bloccato. Contattare l assistenza tecnica Venaxis al numero o il distributore di zona per assistenza. Test dei campioni dei pazienti Preparazione del vassoio di test APPY1 1. Accedere come operatore o passare alla modalità operatore. 2. Premere per visualizzare la schermata Main Menu (Menu principale). 3. Usare e per evidenziare Run Test (Esegui test) e premere Select (Seleziona). 4. Inserire l ID paziente utilizzando uno dei metodi riportati di seguito. Manualmente, usare il tastierino numerico per inserire l ID paziente. a. Premere Keypad (Tastierino) per inserire lettere, spazi e punteggiatura. b. Quando sullo schermo del lettore appare il tastierino, usare,, e per evidenziare il APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 48

5 carattere desiderato. c. Premere Confirm & Next (Conferma e avanti) per aggiungere il carattere evidenziato all ID paziente. d. Ripetere i punti a, b e c secondo necessità. e. Una volta completato l ID paziente, premere Back (Indietro) o selezionare Done (Fatto) per uscire dalla funzionalità del tastierino. Utilizzando il lettore di codice a barre esterno opzionale, leggere il codice a barre del paziente 5. Nella schermata Enter Patient ID (Inserisci ID paziente), premere Confirm (Conferma). 6. Se è disponibile il risultato della formula leucocitaria del paziente, inserirlo e premere Confirm (Conferma). In caso contrario, premere Skip (Ignora). Se si preme Skip (Ignora), viene chiesto di inserire la formula leucocitaria del paziente dopo il test. 7. Estrarre il vassoio di test dal sacchetto e collocarlo nel cassetto. Preparazione del campione di plasma del paziente per il test 1. Predisporre il tampone e le fiale di coniugato. 2. Usare una nuova punta monouso per pipetta per ciascun trasferimento. 3. Rimuovere 10 µl di campione di plasma del paziente dalla provetta K2 EDTA centrifugata, prestando attenzione a non disturbare lo strato di leucociti e piastrine (buffy coat). Trasferire nella fiala con il tampone. Tappare e agitare nel vortex o miscelare bene manualmente. 4. Trasferire 150 µl del campione di plasma diluito del paziente nella fiala di coniugato. Miscelare bene pipettando in alto e in basso per 8-10 volte, assicurarsi che tutto il coniugato venga risospeso. Non introdurre aria nella miscela per evitare che si formi schiuma. Avvio del test 1. Aggiungere immediatamente 70 µl della miscela costituita dal campione diluito del paziente/coniugato anticorpale nel pozzetto del campione del vassoio di test. 2. Chiudere con delicatezza il cassetto. Il test si avvia automaticamente. 3. Il lettore visualizza lo stato del test nella schermata Run Test (Esegui test). 4. Al termine del test, viene chiesto di inserire la formula leucocitaria del paziente o di confermarne l inserimento prima del test. Nel frattempo il vassoio di test deve rimanere nel lettore. 5. Reinserire la formula leucocitaria del paziente e premere Confirm (Conferma). Viene visualizzata la schermata Test Result (Risultato del test). 6. Premere Next (Avanti) per visualizzare la schermata Confirm Patient ID (Conferma ID paziente). 7. Confermare che l ID paziente visualizzato in questa schermata è corretto. Visualizzazione e stampa dei risultati 1. Se l ID paziente è corretto: premere Confirm (Conferma) per visualizzare il risultato del test nella schermata Result List (Risultato del test). Se nel lettore è attivata la funzione di stampa automatica, il risultato viene stampato automaticamente. 2. Se l ID paziente è errato: 3. Inserire l ID paziente corretto e premere Confirm (Conferma) per visualizzare la schermata di mancata corrispondenza dell ID paziente. 4. Reinserire l ID paziente e premere Confirm (Conferma) per visualizzare il risultato del test nella schermata Result List (Risultato del test). 5. Se nel lettore è attivata la funzione di stampa automatica, il risultato viene stampato automaticamente. 6. Premere per aprire il cassetto. Estrarre il vassoio di test e smaltirlo in un contenitore per rifiuti pericolosi sotto il profilo biologico. APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 49

6 Interpretazione dei risultati RISULTATO DEL TEST APPY1 NEGATIVO/Basso rischio di appendicite NON CONCLUSIVO per appendicite RISULTATO NON VALIDO O MESSAGGIO DI ERRORE INTERPRETAZIONE Al di sotto del punto di decisione clinica per il test. Il paziente è a basso rischio di appendicite acuta. Al di sopra del punto di decisione clinica per il test. Rischio non conclusivo per appendicite acuta. Vedere le restrizioni qui di seguito. Ripetere il test. Se il secondo test genera nuovamente un Risultato non valido o un Messaggio di errore, consultare il manuale d'uso dell'appyreader per le istruzioni sulla risoluzione dei problemi o contattare l'assistenza tecnica. Controllo di qualità Funzioni di controllo integrate Il software del lettore include un autoverifica al momento dell inizializzazione che calibra i motori ottici, controlla il sistema di trasporto del vassoio, controlla il sistema del ricevitore ottico ed esegue un controllo di integrità delle impostazioni del lettore. In caso di discrepanza con le specifiche preprogrammate, sarà generato un Risultato non valido o un Messaggio di errore. Controlli esterni Vassoio APPYReader QC Il vassoio APPYReader QC consente il controllo ottico e dell idoneità del sistema volto a confermare il corretto funzionamento del lettore e deve essere eseguito giornalmente prima di utilizzare reagenti liquidi di controllo della qualità o campioni dei pazienti. Per poter procedere con l analisi dei campioni dei pazienti, il vassoio QC deve fornire risultati positivi. Kit di controllo APPY1 Sono disponibili controlli di qualità liquidi come controllo procedurale per il test APPY1. Gli intervalli stabiliti per ciascun controllo sono forniti con ciascun lotto di kit. Seguire le istruzioni per l uso in dotazione a ciascun kit per eseguire i controlli secondo necessità. I controlli devono essere eseguiti: almeno una volta al mese con ogni nuovo lotto e ogni nuova spedizione di kit per test APPY1 in caso di dubbi sull integrità del sistema, sulle condizioni di conservazione dei reagenti o sull affidabilità di qualche risultato del test in conformità con le linee guida nazionali o locali in conformità con le procedure QC del laboratorio Limitazioni 1. Un risultato del test APPY1 Negativo/Basso rischio di appendicite non preclude una diagnosi di appendicite acuta. Nelle fasi iniziali della risposta alla fase acuta (<24 ore dalla comparsa dei sintomi) o nell appendicite focale, i livelli di MRP 8/14 e CRP nel plasma potrebbero non aver raggiunto livelli significativi dal punto di vista clinico, determinando un falso risultato negativo del test. 2. Un risultato del test APPY1 Non conclusivo per appendicite non deve essere usato per formulare una diagnosi di appendicite acuta oppure interpretato come positivo, poiché altri disturbi infiammatori o malattie infettive possono evidenziare la presenza nel plasma di maggiori livelli di MRP 8/14 e CRP e un conteggio elevato dei globuli bianchi. 3. Il risultato del test APPY1 si basa su un punteggio calcolato da un algoritmo proprietario che utilizza input multivariati. Per arrivare al risultato del test APPY1 Test, il punteggio viene quindi messo a confronto con un punto di decisione clinica predeterminato. 4. MRP 8/14, CRP e formula leucocitaria sono regolati verso l alto aspecificamente in condizioni infiammatorie quali infezioni acute, lesioni tissutali acute e altri disturbi infiammatori. Una diagnosi di appendicite acuta deve essere quindi formulata nel contesto dell anamnesi del paziente e dei risultati fisici e clinici. 5. Le variazioni intra-individuali dei livelli di CRP possono essere comprese tra il 30 e il 60%. Anche la variabilità dei livelli di MRP 8/14 è ben caratterizzata. 6. Errori nel trattamento dei campioni possono determinare risultati negativi o falsi positivi. APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 50

7 Risultati attesi L algoritmo e il valore limite/punto di decisione clinica sono stati ottenuti da uno studio clinico pilota condotto su 503 pazienti. In base all analisi relativa alla Curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC) e all accordo clinico con diagnosi di dimissione, è stato determinato il punto di decisione clinica per il test APPY1. I risultati dei test relativi ai pazienti al di sotto del valore limite vengono considerati NEGATIVI/Basso rischio di appendicite acuta, mentre i risultati al di sopra del valore limite vengono considerati NON CONCLUSIVI per appendicite. Prestazioni cliniche Lo studio clinico di convalida dell sistema APPY1 System è stato condotto su campioni di plasma congelati archiviati. I campioni sono stati prelevati durante un precedente studio osservazionale, prospettico, multicentrico, in aperto volto alla valutazione, all analisi, al triage e alle dimissioni di pazienti di età compresa tra 2 e 20 anni che si sono presentati in reparti di pronto soccorso con sintomi indicativi di appendicite acuta. I pazienti arruolati nello studio sono stati sottoposti a prelievi ematici dai quali sono stati ottenuti campioni di plasma, congelati entro 2 ore. I campioni sono stati conservati nei centri a -70 ºC fino alla spedizione a Venaxis, dove sono stati archiviati e conservati a -70 ºC fino al momento del test. Nel laboratorio di Venaxis sono stati condotti test dei campioni in cieco con con il sistema APPY. I risultati del test APPY1 sono stati confrontati con la diagnosi originale alle dimissioni (Negativo per appendicite acuta, AA-) o all istopatologia (Positivo per appendicite acuta, AA+). Nello studio di convalida sono stati usati complessivamente 465 campioni di pazienti prelevati durante precedenti studi clinici pilota, contenenti un volume sufficiente per l analisi completa. I soggetti erano di età compresa tra 2 e 20 anni, età media 12,0 ± 4,3 anni. All incirca il 49% erano di sesso maschile e il 52% di sesso femminile. La razza caucasica era quella predominante corrispondente al 70%, quella ispanica/latina al 19% e altre all 11%. Non vi era una differenza significativa nell età media tra la coorte AA+ (12,5±3,8) e la coorte AA- (11,9±4,5). Risultati del test APPY1 confrontati alla diagnosi clinica Risultato del test APPY1 N=465 AA- AA+ Sotto il valore limite: NEGATIVO/Basso rischio di AA Sopra il valore limite: NON CONCLUSIVO per AA Dati delle prestazioni cliniche Misura Stima (IC al 95%) Prevalenza AA 28,4% (24,5 32,6) Sensibilità 95,5% (90,4 97,9) Specificità 46,2% (41,0 51,6) NPV 96,3% (92,1 98,3) PPV 41,3% (35,9 46,9) Rapporto di verosimiglianza positivo 1,78 (1,60 1,99) Rapporto di verosimiglianza negativo 0,098 (0,045-0,217) Prestazioni analitiche Limite di rilevazione Il limite del bianco (LOB), il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) sono stati determinati da 2 operatori che hanno analizzato 3 lotti di kit per test APPY1 contro 6 campioni di plasma e campioni bianchi di tampone del test APPY1 nell arco di 3 giorni, con i campioni randomizzati ogni giorno. APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 51

8 LOD, LOB e LOQ Limite CRP, µg/ml MRP, µg/ml Bianco 0,201 0,030 Rilevazione 0,254 0,045 Quantificazione 0,341 0,064 Linearità Per ciascun analita è stata dimostrata la linearità per un intervallo compreso all incirca tra il LOD/LOQ fino a oltre il valore di troncamento superiore del dosaggio. Il dosaggio è lineare per entrambi gli analiti nell intervallo del valore limite clinico. Il dosaggio della MRP è lineare da 0,052 a 0,933 µg/ml; il dosaggio della CRP è lineare da 0,187 a 51,4 µg/ml. Utilizzando il LOD della CRP come valore basso, il dosaggio della CRP è lineare da 0,254 µg/ml a 51,4 µg/ml. MRP 8/14 misurata in μg/ml 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Linearità di MRP 8/14 y = 0,9998x - 0,0062 R² = 0,9959 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Stimata in µg/ml CRP misurata in μg/ml Linearità di CRP y = 1,0545x - 0,451 R² = 0, Stimata in µg/ml Precisione Le prestazioni di precisione del test APPY1 sono state valutate in conformità con le linee guida CLSI EP-5A2, Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline (Valutazione delle prestazioni di precisione dei metodi di misurazione quantitativi; Linee guida approvate). Cinque campioni di plasma tra LOQ e il valore limite (punteggio del test APPY1 pari a 4,0), in corrispondenza o in prossimità del valore limite, e a intervalli superiori al valore limite sono stati analizzati nell arco di 20 giorni, 2 cicli di test al giorno, 2 replicati per ciclo, 1 operatore. I campioni sono stati randomizzati su 5 lettori in ciascun giorno di test. Per completare il calcolo del punteggio del test APPY1, a ciascun campione è stata assegnata una formula leucocitaria fissa. Il coefficiente percentuale totale di variazione (CV%) era compreso tra 0,0 e 2,8% per il punteggio del test APPY1, tra 6,5 e 12,0% per MRP 8/14 e tra 4,8 e 15,1% per CRP. Prossimi al valore limite stabilito, i CV% per MRP 8/14 e CRP sono stati 10,6%. APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 52

9 Test di precisione: punteggio del test APPY1 con formula leucocitaria fissa Punteggio del test APPY1 Intra-analisi Inter-analisi Totale Campione N (medio) DS CV % DS CV % DS CV % ,2 0,000 0,0 0,000 0,0 0,000 0, ,9 0,000 0,0 0,000 0,0 0,000 0, ,0 0,050 1,2 0,000 0,0 0,050 1, ,1 0,037 0,9 0,027 0,7 0,046 1, ,2 0,143 2,8 0,000 0,0 0,148 2,8 Test di precisione: concentrazione di MRP 8/14 Parametri Campione MRP 8/14 µg/ml Media 0,10 0,15 0,24 0,31 0,52 Ripetibilità (intra-analisi) DS 0,006 0,009 0,024 0,016 0,058 CV % 6,3 6,1 10,0 5,1 11,2 Inter-analisi DS 0,000 0,007 0,002 0,012 0,000 CV % 0,0 4,5 0,7 3,8 0,0 Totale DS 0,006 0,011 0,025 0,021 0,062 CV % 6,5 7,1 10,6 6,9 12,0 Test di precisione: concentrazione di CRP Parametri Campione CRP µg/ml Media 0,58 2,31 5,06 5,25 18,88 Ripetibilità (intra-analisi) DS 0,027 0,126 0,341 0,364 2,953 CV % 4,6 5,5 6,7 6,9 15,6 Inter-analisi DS 0,013 0,097 0,280 0,262 0,000 CV % 2,3 4,2 5,5 5,0 0,0 Totale DS 0,028 0,149 0,453 0,453 2,851 CV % 4,8 6,5 8,6 8,6 15,1 Riproducibilità La riproducibilità è stata valutata nel laboratorio Venaxis da 3 operatori, ciascuno con un lettore dedicato, completamente all oscuro dei risultati ottenuti dagli altri operatori. Una combinazione operatore + lettore è stata designata quale sito separato per un totale di 3 siti. Ogni operatore ha testato 5 campioni di plasma più 2 controlli per 3 giorni, 2 cicli di test al giorno, 2 replicati per ciclo. L ordine dei campioni è stato variato in ciascun ciclo di test. Per completare il calcolo del punteggio del test APPY1, a ciascun campione è stata assegnata una formula leucocitaria fissa. Per i punteggi dei test APPY1, il CV% all interno del ciclo (ripetibilità) era 3,4%, il CV% tra un ciclo e l altro era 0,9%, il CV% tra un giorno e l altro era 0,7% e il CV% tra gli operatori/siti era 0,5%. L imprecisione totale (riproducibilità) era 3,4%. I risultati relativi al punteggio del test APPY1, MRP 8/14 e CRP sono mostrati di seguito: APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 53

10 Test di riproducibilità: punteggio del test APPY1 con formula leucocitaria fissa Parametri Campione Punteggio del test APPY1 Media 3,2 3,9 4,0 4,2 5,4 Ripetibilità (intra-analisi) DS 0,014 0,019 0,048 0,049 0,168 CV % 0,4 0,5 1,2 1,2 3,1 Inter-analisi Inter-die Inter-operatore Riproducibilità (totale) DS 0,004 0,010 0,019 0,017 0,049 CV % 0,1 0,3 0,5 0,4 0,9 DS 0,005 0,014 0,010 0,012 0,036 CV % 0,1 0,4 0,2 0,3 0,7 DS 0,003 0,005 0,011 0,010 0,030 CV % 0,1 0,1 0,3 0,3 0,5 DS 0,015 0,026 0,054 0,054 0,182 CV % 0,5 0,7 1,3 1,3 3,4 Test di riproducibilità: concentrazione di MRP 8/14 Parametri Campione MRP 8/14 µg/ml Media 0,10 0,15 0,25 0,34 0,59 Ripetibilità (intra-analisi) DS 0,003 0,010 0,029 0,026 0,656 CV % 2,9 6,6 11,5 7,7 11,1 Inter-analisi Inter-die Inter-operatore Riproducibilità (totale) DS 0,002 0,005 0,009 0,008 0,013 CV % 1,9 3,1 3,5 2,3 2,3 DS 0,003 0,007 0,006 0,007 0,017 CV % 2,6 4,7 2,4 2,0 3,0 DS 0,010 0,002 0,006 0,006 0,015 CV % 9,6 1,6 2,5 1,7 2,5 DS 0,009 0,013 0,031 0,029 0,071 CV % 8,6 8,8 12,6 8,4 12,0 Test di riproducibilità: concentrazione di CRP Parametri Campione CRP 8/14 µg/ml Media 0,63 2,52 5,55 5,94 24,34 Ripetibilità (intra-analisi) DS 0,039 0,166 0,309 0,568 3,375 CV % 6,1 6,6 5,6 9,6 13,9 Inter-analisi Inter-die Inter-operatore Riproducibilità (totale) DS 0,016 0,13 0,281 0,228 1,226 CV % 2,5 5,2 5,1 3,8 5,0 DS 0,012 0,116 0,065 0,132 0,743 CV % 1,9 4,6 1,2 2,2 3,1 DS 0,009 0,048 0,099 0,121 0,902 CV % 1,4 1,9 1,8 2,0 3,7 DS 0,044 0,245 0,434 0,638 3,776 CV % 7,0 9,7 7,8 10,7 15,5 APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 54

11 Interferenza Sono stati analizzati campioni di pool plasmatico contenenti concentrazioni basse (L), medie (M) e alte (H) di MRP 8/14 e CRP per valutare l interferenza da parte di emoglobina, bilirubina (coniugata e non coniugata), lecitina, anticorpi umani anti-murini (HAMA), fattore reumatoide (FR) e immunoglobulina G (IgG). I valori di controllo per ciascun pool plasmatico (L, M, H) sono stati stabiliti utilizzando la media di 3 misurazioni replicate. L effetto di ciascuna sostanza interferente è stato valutato usando la media di 3 misurazioni replicate su ciascun pool plasmatico. A ciascun pool plasmatico è stato assegnato un valore fisso della formula leucocitaria per calcolare il punteggio del test APPY1. Al pool plasmatico basso è stato assegnato un valore della formula leucocitaria di 4, al pool plasmatico medio è stato assegnato un valore della formula leucocitaria di 7 e al pool plasmatico alto è stato assegnato un valore della formula leucocitaria di 10, assegnando rispettivamente punteggi del test APPY1 di 3,1, 3,6 e 4,6. Non è stata osservata alcuna interferenza significativa sul punteggio del test APPY1 per nessuna delle sostanze interferenti, tutte le differenze sono risultate inferiori al 10%. Tuttavia, è stata rilevata una potenziale interferenza a livelli bassi di MRP 8/14 quando è stata utilizzata la bilirubina non coniugata a questi livelli di test. Come dimostrato nel grafico in basso, questa interferenza ha un effetto molto limitato sul punteggio del test APPY1. Inoltre, è stata rilevata interferenza a bassi livelli di CRP nel confronto tra il campione di plasma positivo al FR e il rispettivo controllo. Tuttavia, in questo campione sono stati rilevati bassi livelli di CRP con l immunoblot, indipendentemente dai pool di test. Se si analizza una fonte più pulita di FR, la differenza percentuale indicata in basso risulterà ridotta. Un risultato simile è stato ottenuto con tutti i livelli di MRP 8/14 quando è stato eseguito il test dell interferente IgG. È stato dimostrato che l IgG purificata è contaminata con MRP 8/14 e che se si ottiene un materiale di origine più pulito anche gli effetti dell interferenza indicati in basso dovrebbero ridursi. Test dell interferenza: test APPY1 Potenziale interferente Concentrazione Pool basso Punteggio test APPY1 = 3,1 Pool medio Punteggio test APPY1 = 3,6 Pool alto Punteggio test APPY1 = 4,6 Differenza % rispetto al campione di controllo o NSD Emoglobina 2 g/l 0,69-0,79-0,08 Bilirubina, non coniugata 342 µmol/l 1,37 0,56 1,78 Bilirubina, coniugata 342 µmol/l -0,28-1,52-1,80 Lecitina 11,1 mmol/l 0,38-0,09 0,17 HAMA 153,3 ng/ml 0,24-0,93-2,18 Fattore reumatoide 60 IU/ml 0,06 0,42-1,99 IgG 52,8 mg/ml 5,55 7,06 4,30 Il kit per test APPY1 è destinato esclusivamente all esportazione in USA. Venaxis è un marchio registrato di Venaxis, Inc. APPY1 e APPYReader sono marchi di Venaxis, Inc. APPY1 Test Instructions for Use L10003IT 04 Italiano 2014 Venaxis, Inc. Page 55

12 REFERENCES 1. EU Market Study by Venaxis, Inc. (Benelux, France, Italy, Germany, UK), Venaxis analysis of data from: National Hospital Ambulatory Medical Care Survey, Available at: ahcd_questionnaires.htm#public_use. Accessed November Addiss D, et al. The Epidemiology of Appendicitis and Appendectomy in the United States. American Journal of Epidemiology. 1990;132: Becker, et al. Atypical Clinical Features of Pediatric Appendicitis. Academic Emergency Medicine. 2007;14: Brennan G. Pediatric Appendicitis: Pathophysiology and appropriate use of diagnostic imaging. Canadian Journal of Emergency Medicine. 2006;8: Kharbanda, et al. A Clinical Decision Rule to Identify Children at Low Risk for Appendicitis. Pediatrics. 2005;116: Huckins DS, et al. A novel biomarker panel to rule out acute appendicitis in pediatric patients with abdominal pain, American Journal of Emergency Medicine. (in press), 8. Cardall, et al. Clinical Value of the Total White Blood Cell Count and Temperature in the Evaluation of Patients with Suspected Appendicitis. Academic Emergency Medicine. 2004;11: Hennelly K and Bachur R. Appendicitis Update. Current Opinion Pediatrics. 2011;23: Wan M, et al. Acute Appendicitis in Young Children: Cost Effectiveness of US versus CT in Diagnosis A Markov Decision Analytical Model. Radiology. 2009;250: Glatter R. What role do imaging studies play in diagnosing pediatric appendicitis in the ED? MedScape Emergency Medicine, Web MD. June 18, Available at: Accessed April 9, Stoker J, et al. Imaging patients with acute abdominal pain. Radiology. 2009;253: Bachur R, et al. Advanced Radiologic Imaging for Pediatric Appendicitis: Trends and Outcomes. Journal of Pediatrics Menoch M, et al. Trends in Computed Tomography Utilization in the Pediatric Emergency Department. Pediatrics. 2012:129:e690-e Bealer J and Colgin M. S100A8/A9: A potential New diagnostic Aid for Acute Appendicitis. Academic Emergency Medicine. 2010:17: Mills A, et al. Diagnostic Characteristics of S100A8/A9 in a Multicenter Study with Patients With Acute Right Lower Quadrant Abdominal Pain. Academic Emergency Medicine. 2012;19: Kharbanda A, et al. Novel Serum and Urine Markers for Pediatric Appendicitis. Academic Emergency Medicine. 2012;19: Thuijl G, et al. A Pilot study on potential new plasma markers for diagnosis of acute appendicitis Shindoh J, et al. Diagnostic Power of Inflammatory Markers in Predicting Severity of Appendicitis. Hepato-Gastroenterology. 2011;58: Cole M, Maldonado N. Evidence-Based Management of Suspected Appendicitis in the Emergency Department. Emergency Medicine Practice. 2011;13: Siddique K, et al. Diagnostic accuracy of white cell count and C-reactive protein for assessing the severity of paediatric appendicitis. Journal of the Royal Society of Medicine. 2011;2: Doraiswamy NW. Progress of acute appendicitis: a study in children. British Journal of Surgery 1978;65: Symbol Key: Symbolschlüssel: Leyenda de los símbolos: Légende des symboles: Descrizione dei simboli: Verklaring van symbolen: Symbol Symbol Símbolo Symbole Simbolo Symbool EN DE ES FR IT NL Used for Verwendet für Significa Utilisé pour Spiegazione Gebruikt voor CE Mark CE-Zeichen Marca CE Marque CE Marcatura CE CE-markering Contents Inhalt Contenido Contenu Contenuto Inhoud Venaxis, Inc South Perry Street Castle Rock, CO USA Tel: Fax: Emergo Europe Molenstraat BH, The Hague, The Netherlands The APPY1 Test Kit is for U.S. Export Only. Venaxis is a registered trademark of Venaxis, Inc. APPY1 and APPYReader are trademarks of Venaxis, Inc. APPY1 Test Instructions for Use L Venaxis, Inc. Page 67