Simplexa Bordetella Universal Direct

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1 REF MOL2775 Rev. A Un saggio di reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale per la rilevazione qualitativa del DNA di Bordetella pertussis e/o Bordetella parapertussis Per uso diagnostico in vitro USO PREVISTO Il saggio Simplexa Bordetella Universal Direct di Focus Diagnostics è stato progettato per l'uso sullo strumento 3M Integrated Cycler per la rilevazione qualitativa in vitro e la differenziazione di Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis in tamponi nasofaringei di pazienti umani con segni e sintomi di infezione batterica del tratto respiratorio. Questo test è un sussidio alla diagnosi differenziale delle infezioni da Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis. Il test con Simplexa Bordetella Universal Direct deve essere eseguito solo se il paziente soddisfa i criteri clinici ed epidemiologici per l esame di campioni sospetti. L'identificazione di Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis deve essere eseguita congiuntamente ad una valutazione clinica ed epidemiologica. Risultati negativi non escludono un infezione da Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis e non vanno utilizzati come unica base per il trattamento o per altre decisioni relative alla gestione del paziente. Non è previsto l'uso del saggio come screening per la rilevazione della presenza di analiti nel sangue o in emoderivati ed è esclusivamente per uso professionale. SINOSSI E SPIEGAZIONE La pertosse, conosciuta anche come tosse canina, è una malattia altamente contagiosa del sistema respiratorio causata da piccoli batteri gram-negativi: Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis. Clinicamente è caratterizzata da tosse persistente e i pazienti con la forma tipica della malattia sono spesso affetti da violenti accessi di tosse, che possono essere seguiti da urlo inspiratorio e da vomito. In casi gravi, riscontrati più tipicamente nei neonati, questi sintomi possono causare ipossia, danni cerebrali permanenti o morte. Nei bambini più grandi e negli adulti, specialmente coloro che sono stati vaccinati o hanno contratto la malattia in precedenza, questa malattia può essere più lieve e manifestarsi come una tosse prolungata. Durante la prima metà del 20 secolo, la prevalenza della pertosse era elevata; la malattia colpiva ogni anno circa l'1% della popolazione 1, nella maggior parte dei casi bambini piccoli. L'introduzione di vaccini per la pertosse a cellule intere negli anni '40 ha consentito una drastica riduzione della patologia. Ciononostante la malattia persiste ancora con un basso livello di incidenza. Dalla fine degli anni '90, c'è stato un notevole aumento nel numero di casi di pertosse denunciati nei Paesi sviluppati con alti tassi di vaccinazione. Negli Stati Uniti il 2004 è stato l'anno con il maggior numero di casi denunciati (25 827) dal Aumenti simili sono stati registrati in Canada e in Europa 3. L'Organizzazione Mondiale della Sanità stima che ogni anno si verifichino circa 50 milioni di casi di pertosse, con decessi 4. La pertosse può essere riscontrata in tutti i gruppi di età (neonati, bambini, adolescenti e adulti). Gran parte di questi casi è causata da Bordetella pertussis; tuttavia, una frazione di tutti i casi di pertosse, dal 3% al 35% circa, è causata da Bordetella parapertussis, una patologia più lieve, simile alla pertosse 5, 6. Sebbene la causa esatta della ricomparsa dei casi di pertosse da Bordetella pertussis sia ancora misteriosa, è ampiamente diffusa la convinzione che l'immunità conferita dal vaccino si attenui dopo 7-10 anni. Pertanto i bambini immuni possono diventare suscettibili durante l'adolescenza, contrarre la patologia e trasmettere i batteri ai neonati del loro nucleo familiare 1, 4. Per la diagnosi della pertosse sono disponibili diversi metodi di laboratorio, tra cui coltura, sierologia e PCR. La coltura è il metodo di riferimento ed è specifica quasi al 100%; tuttavia, la sua sensibilità è molto inferiore. La sensibilità della coltura può raggiungere il 56% all'inizio del decorso della patologia, ma decresce nel tempo ed è inferiore nei pazienti sottoposti a terapia antimicrobica o precedente vaccinazione. Per isolare B. pertussis in coltura sono necessari terreni speciali e tempi da 7 a 14 giorni; pertanto potrebbe non essere indicata per la gestione dei casi acuti. La sierologia, utilizzando campioni di siero da fase acuta e da convalescenza, richiede un intervallo di almeno 4 settimane tra i prelievi di campione e non è utile ai fini della diagnosi immediata. I test sierologici a campione singolo per le IgG contro la tossina della pertosse sono stati sviluppati per fini di ricerca, ma devono essere eseguiti almeno 2 settimane dopo la comparsa dei sintomi. Sono disponibili inoltre saggi sierologici per la pertosse, che utilizzano reagenti disponibili in commercio, ma non sono stati validati a livello clinico e potrebbero non distinguere l'infezione

2 Pagina 2 recente da quella remota o dalla vaccinazione 10. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test è un sistema di amplificazione e identificazione tramite reazione a catena della polimerasi in tempo reale, che sfrutta una sonda-primer fluorescente bifunzionale per la rilevazione e la differenziazione del DNA di Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis in tamponi nasofaringei. Il saggio è stato convalidato con due differenti protocolli di analisi. Il protocollo di ESTRAZIONE utilizza il DNA estratto dai campioni provenienti dai pazienti; il protocollo DIRETTO utilizza campioni non processati. Il DNA viene amplificato utilizzando una sonda-primer fluorescente bifunzionale con un primer inverso per ciascun analita e per il controllo interno del DNA. Il saggio fornisce due risultati: Bordetella pertussis (Bp) viene identificata nel campione attraverso l' IS481 mentre Bordetella parapertussis (Bpp) viene identificata attraverso l'is1001. Un controllo interno del DNA viene utilizzato per monitorare il processo di estrazione (ove applicabile) e rilevare eventi di inibizione della PCR. MATERIALI FORNITI Il saggio Simplexa Bordetella Universal Direct di Focus Diagnostics contiene materiale sufficiente per 1000 reazioni (compresi i controlli). Al ricevimento del materiale, conservare tutti i reagenti a temperature comprese tra -10 C e -30 C (non utilizzare un congelatore no-frost). Se conservati alla temperatura indicata, i reagenti rimarranno stabili fino al termine del mese di scadenza riportato sulla confezione del kit. Dopo il primo utilizzo, conservare i reagenti scongelati a temperature comprese tra 2 e 8 C per non più di 30 giorni. Kit Descrizione dell etichettatura e dei componenti del kit Etichetta Focus Diagnostics Simplexa Bordetella Universal Direct (REF MOL2775) Componenti Simplexa Bordetella Primer Mix (Miscela di primer Bordetella Simplexa ) Simplexa Master Mix (Miscela master Simplexa ) Simplexa Extraction and Amplification Control DNA (SEAC) (DNA di controllo per l estrazione e l amplificazione Simplexa (SEAC)) Simplexa Bordetella Positive Control (PC) (Controllo positivo per Bordetella Simplexa (CP)) INGLESE REF SIMBOLO CE Simplexa Bordetella Primer Mix MOL2776 REAG A Simplexa Master Mix MOL2007 REAG B Simplexa Extraction and Amplification Control DNA MOL9001 CONTROL IC Simplexa Bordetella Positive Control MOL0221 CONTROL + Numero di provette per kit Codice colore Etichetta 10 Marrone REF MOL2776 Lotto Scadenza 10 Verde REF MOL2007 Lotto Scadenza 2 Blu REF MOL9001 Lotto Scadenza 2 Rosso REF MOL0221 Lotto Scadenza Componente del kit Simplexa Bordetella Primer Mix (Miscela di primer Bordetella Simplexa ) Reazioni per kit/flacon cino Volume per flaconcino (µl) 1000/ Descrizione dei componenti del kit Descrizione del componente Primer fluorescenti marcati con colorante specifici per la rilevazione di Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e per il controllo interno del DNA. Bersaglio Fluoroforo sonda Eccitazio ne (nm) Emission e (nm) Gene bersagli o Bp FAM IS481 Bpp CFR IS1001 SEAC Q N/A Simplexa Master Mix (Miscela master Simplexa ) Simplexa Extraction and Amplification Control (SEAC) (Controllo di estrazione e amplificazione Simplexa ) 1000/ DNA polimerasi, tampone e dntp variabile 250 Amplicone di DNA per controllo interno

3 Pagina 3 Simplexa Bordetella Positive Control (PC) (Controllo positivo per Bordetella Simplexa ) Simplexa Bordetella Universal Direct (card con codice a barre Bordetella Universal Direct Simplexa ) variabile 50 Amplicone di DNA IS481 e IS1001 n.a. n.a. Parametri specifici per il saggio. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 3.0 o superiore 2. Universal Discs (dischi universali) per utilizzo su Integrated Cycler 3. Universal Disc Sealer (nastro di copertura per dischi universali) 4. Micropipette singole, multicanale e/o a ripetizione con range di accuratezza di 1-10 µl, µl e µl 5. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione dei componenti del kit) 6. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione dei campioni) 7. Frigorifero da 2 C a 8 C (per i componenti del kit scongelati) 8. Cabina di biosicurezza (cappa a flusso laminare) per l'estrazione e manipolazione del campione 9. Microcentrifuga 10. Miscelatore vortex 11. Puntali sterili monouso RNAsi/DNAsi-free con filtro barriera per aerosol per micropipettatore 12. Provette da 1,5 ml in polipropilene per microcentrifuga (provette RNAsi/DNAsi-free consigliate, ma non necessarie) e rack 13. Provette coniche da 15 ml in polipropilene e rack 14. Acqua priva di nucleasi (RNAsi/DNAsi-free) da utilizzare come controllo senza templato (NTC). 15. Guanti monouso senza talco 16. Rack di raffreddamento per provette da microcentrifuga da 1,5 ml 17. Universal Disc Cold Block (Blocco freddo per dischi universali) MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI - da utilizzare con il protocollo di ESTRAZIONE 1. TE 1X (ph 8,0), RNAsi/DNAsi-free (per la preparazione del Controllo Molecolare da utilizzare solo con il protocollo di ESTRAZIONE) 2. Sistema Roche MagNA Pure LC e materiali di consumo associati. 3. MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche Cat. No ) 4. Set di controllo di estrazione e amplificazione Simplexa (REF MOL9000) Nota: è necessario se verranno effettuate più di 80 reazioni con il protocollo di ESTRAZIONE PERIODO DI VALIDITÀ E MANIPOLAZIONE 1. Conservare i reagenti ad una temperatura compresa tra -10 e -30 C (non usare un congelatore no-frost). 2. Non utilizzare i kit o i reagenti dopo la data di scadenza. 3. Prima dell uso, lasciare scongelare i reagenti a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). 4. Se la PCR non deve essere eseguita immediatamente dopo la preparazione della miscela di reazione, conservare la miscela di reazione a 2-8 C finché non si è pronti a procedere con la PCR. Utilizzare la miscela di reazione entro un'ora. 5. Una volta scongelati, conservare la miscela di primer, la miscela master, il controllo positivo e il SEAC a una temperatura compresa tra 2 e 8 C per non oltre 30 giorni. 6. Non ricongelare la miscela di primer, la miscela master o il controllo positivo. 7. Non utilizzare insieme reagenti provenienti da lotti di kit differenti. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Attenersi alle precauzioni standard. Tutti i campioni dei pazienti e i controlli positivi devono essere considerati come materiale potenzialmente infetto e manipolati di conseguenza. 2. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo, guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test. 3. Non pipettare con la bocca. 4. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani. 5. Smaltire i reagenti del kit non utilizzati e i campioni umani in base alle normative locali, provinciali e nazionali. 6. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in maniera unidirezionale, partendo dalle aree di pre-amplificazione e spostandosi poi nell'area di amplificazione/rilevazione. Segue la sequenza di eventi che va dall'estrazione del campione all'amplificazione mediante PCR in tempo reale: Iniziare con l estrazione del campione, quindi configurare lo strumento per la PCR in tempo reale, preparare i reagenti e infine eseguire l amplificazione mediante PCR in tempo reale.

4 Pagina 4 Non scambiare forniture e apparecchiature tra le aree dedicate all estrazione e alla preparazione del campione. Non effettuare spostamenti tra un area e l altra. Le forniture e le apparecchiature usate per la preparazione dei campioni non devono essere impiegate per le attività di preparazione dei reagenti o per processare DNA amplificato o altre fonti dell acido nucleico bersaglio. Tutte le forniture e le apparecchiature di amplificazione devono essere sempre mantenute nell area della strumentazione per PCR in tempo reale. I dispositivi di protezione individuale, quali guanti monouso e camici da laboratorio, devono essere specifici per ogni area. 7. La contaminazione dei campioni dei pazienti o dei reagenti può determinare risultati errati. Utilizzare tecniche asettiche. 8. Pipettare e manipolare i reagenti con cautela per evitare di mescolare i campioni con quelli dei pozzetti adiacenti. 9. Utilizzare tecniche di pipettamento adeguate e mantenere lo stesso tipo di tecnica per l'intera procedura per assicurare valori ottimali e riproducibili. 10. Non sostituire o miscelare reagenti provenienti da lotti di kit diversi o di altri produttori. 11. Non scambiare i tappi delle provette di reagente. Questo può comportarne la contaminazione e compromettere i risultati del test. 12. Utilizzare unicamente il protocollo descritto nel presente foglio illustrativo. Ogni deviazione dal protocollo o l uso di tempi o temperature diversi da quelli specificati possono comportare risultati errati. 13. L impostazione del saggio deve essere eseguita su un blocco freddo per dischi universali (in un intervallo di temperatura compreso tra 2 e 8 C). Mentre si miscelano i reagenti, mantenere freddi gli enzimi utilizzando un blocco refrigerante. 14. Non riutilizzare Universal Discs (dischi universali) già esposti ai campioni dei pazienti o ai reagenti. 15. Smaltire i dischi usati senza staccare o rimuovere il nastro di copertura. 16. Se sullo stesso disco vengono sistemati diversi kit o lotti Simplexa, testare il controllo positivo di ogni kit e il controllo senza templato (acqua priva di nucleasi). 17. La miscela master contiene una percentuale di glicerolo compresa tra 1 e 10% che può causare irritazione in caso di inalazione o contatto con la pelle. In caso di inalazione o contatto con la pelle, adottare le misure di primo soccorso. 18. Si sconsiglia la conservazione protratta dei campioni estratti a temperature comprese tra 2 e 8 C, poiché non sono stati effettuati test per stabilire le prestazioni del saggio in queste condizioni. ISTRUZIONI PER L USO PROTOCOLLO DEL SAGGIO PER TEST DIRETTO SUI CAMPIONI (PROTOCOLLO DIRETTO) A. RACCOLTA DEI CAMPIONI I tipi di campione accettabili comprendono i tamponi nasofaringei in terreni di trasporto liquidi per virus (ad esempio UTM, VCM, M4). Utilizzare solo tamponi con punta sintetica (ad esempio Dacron, nylon o rayon) e asta in alluminio o plastica. Non utilizzare tamponi in alginato di calcio, poiché possono contenere sostanze che inibiscono il test PCR. Il terreno di trasporto liquido Amies non è compatibile con il protocollo Diretto. B. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER LA PCR IN TEMPO REALE 1. Fare riferimento al manuale per l operatore di Integrated Cycler per maggiori dettagli su come configurare il software Integrated Cycler Studio in modo da aggiungere la definizione di un saggio, impostare sessioni su Integrated Cycler e analizzarle. C. AREA DI PREPARAZIONE REAGENTI Area dedicata alla preparazione della miscela di reazione per il saggio Simplexa Bordetella Universal Direct. 1. Lasciare scongelare la miscela di primer e la miscela master a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). Ogni flaconcino compreso nel kit contiene reagente sufficiente per 100 reazioni. Prima di ogni uso, mescolare delicatamente la miscela dei primer e la miscela master capovolgendole 6-8 volte, quindi centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 2. Preparare il volume richiesto di miscela di reazione in una provetta in polipropilene per microcentrifuga di dimensioni adeguate, pipettando il volume di ogni componente come indicato nella tabella sottostante. Volumi della miscela di reazione da utilizzare con il protocollo DIRETTO Reagente Miscela di reazione Volume/1 reazione Miscela di reazione Volume /10 reazioni Simplexa Master Mix (Miscela master Simplexa ) 4 40 Simplexa Bordetella Primer Mix (Miscela di primer Bordetella 1 10 Simplexa ) Acqua senza nucleasi 1,8 18 SEAC 0,2 2 Volume totale 7 70

5 Pagina 5 3. Mescolare delicatamente la miscela di reazione per inversione o pipettando 8-10 volte. 4. Centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 5. Procedere all impostazione della PCR. 6. Utilizzare la miscela di reazione entro un ora dalla preparazione. Se l impostazione della PCR non viene eseguita subito dopo la preparazione della miscela di reazione, conservare quest ultima a 2-8 C fino al momento di procedere (entro un'ora). D. AREA DI AMPLIFICAZIONE CON PCR IN TEMPO REALE Operare in un area dedicata alla preparazione dello Universal Disc a 96 pozzetti per il saggio Simplexa Bordetella Universal Direct. Utilizzare il blocco freddo per il disco universale durante il caricamento del campione e della miscela di reazione. 1. Scongelare il controllo positivo a temperatura ambiente (intervallo approssimativo: C). 2. Aggiungere 7,0 µl della miscela di reazione in ogni pozzetto. 3. Aggiungere 3,0 µl del controllo positivo nel pozzetto "PC" del disco. 4. Aggiungere 3,0 µl del campione del paziente nel pozzetto "S" appropriato del disco. 5. Aggiungere 3,0 µl del controllo senza templato (acqua priva di nucleasi) al pozzetto "NTC" del disco. 6. Coprire il disco con il Universal Disc Cover Tape (nastro di copertura per dischi universali). 7. Caricare il Universal Disc (Disco Universale) sigillato su Integrated Cycler e avviare la sessione. PROTOCOLLO DEL SAGGIO PER TEST SU CAMPIONI ESTRATTI (PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE) A. RACCOLTA DEI CAMPIONI I tipi di campione accettabili comprendono i tamponi nasofaringei in terreni di trasporto Amies o altri terreni di trasporto liquidi per virus (ad esempio UTM, VCM, M4). Utilizzare solo tamponi con punta sintetica (ad esempio Dacron, nylon o rayon) e asta in alluminio o plastica. Non utilizzare tamponi in alginato di calcio, poiché possono contenere sostanze che inibiscono il test PCR. B. AREA DI ESTRAZIONE DEI CAMPIONI Eseguire in un area dedicata all estrazione dei campioni. La preparazione dei campioni per l'estrazione deve essere eseguita in una cabina di biosicurezza. PREPARAZIONE DEL CONTROLLO POSITIVO Preparare il controllo positivo aggiungendo 5 µl di controllo positivo a 195 µl di TE 1X (ph 8,0). Estrazione mediante il metodo Roche MagNA Pure LC 1. Gli acidi nucleici vengono estratti dai campioni dei pazienti e dal controllo senza templato utilizzando il kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid e lo strumento Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Per eseguire l estrazione degli acidi nucleici utilizzando questo kit, fare riferimento alle istruzioni per l'uso del produttore. 2. Nel menu a cascata "Protocol" (Protocollo) nel sistema MagNA Pure LC, selezionare "Total NA" (Acidi nucleici totali), quindi "Total NA Variable_elution_volume.blk" (Acidi nucleici totali Volume_eluizione_variabile.blk) dall elenco. In questo modo verranno caricate le impostazioni adeguate per la sessione. 3. Il Sample Protocol (Protocollo campione) deve essere "Total NA Variable_elution_volume". 4. Impostare il Sample Volume (Volume campione) su 200 µl e il volume di eluizione su 50 µl. 5. Impostare il volume di diluizione su zero per tutti i campioni. 6. Verificare che il Post Elution Protocol (Protocollo post-eluizione) sia impostato su "None" (Nessuno). 7. Verificare che i campioni e i controlli siano correttamente posizionati sulla cartuccia campione. 8. Miscelare ciascun campione per 2-4 secondi con il vortex e centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 9. Per ciascun set di 16 campioni (campioni 1-16), pipettare 100 µl di DNA SEAC in 6 ml di tampone di lisi MagNA Pure in un tubo conico. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio appropriato sullo strumento di estrazione MagNA Pure. Ad esempio, se si estraggono 32 campioni, pipettare 200 µl di DNA SEAC in 12 ml di tampone di lisi MagNA Pure in un tubo conico. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio appropriato sullo strumento di estrazione MagNA Pure. 10. Pipettare 200 µl di ciascun campione, controllo positivo e controllo senza templato (acqua priva di nucleasi) nella posizione corrispondente della cartuccia campione. 11. Controllare visivamente il livello dei campioni e dei controlli nella cartuccia campione per accertarsi che i campioni siano stati effettivamente aggiunti. 12. Trasferire la cartuccia campione contenente i campioni sullo strumento MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid extractor e dare inizio al ciclo di estrazione. 13. Una volta completata l estrazione degli acidi nucleici, la cartuccia contenente i campioni estratti può essere rimossa dal MagNA Pure e sigillata. Conservare il DNA estratto ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino al suo utilizzo. Non

6 Pagina 6 si consiglia la conservazione a lungo termine dei campioni estratti a questa temperatura. Mantenere i campioni di DNA estratto su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco. C. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER LA PCR IN TEMPO REALE 1. Fare riferimento al manuale per l operatore di Integrated Cycler per maggiori dettagli su come configurare il software Integrated Cycler Studio in modo da aggiungere la definizione di un saggio, impostare sessioni su Integrated Cycler e analizzarle. D. AREA DI PREPARAZIONE REAGENTI Area dedicata alla preparazione della miscela di reazione per il saggio Simplexa Bordetella. 1. Lasciare scongelare la miscela di primer e la miscela master a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). Ogni flaconcino compreso nel kit contiene reagente sufficiente per 100 reazioni. Prima di ogni uso, mescolare delicatamente la miscela dei primer e la miscela master invertendo 6-8 volte, quindi centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 2. Preparare il volume richiesto di miscela di reazione in una provetta in polipropilene per microcentrifuga di dimensioni adeguate, pipettando il volume di ogni componente come indicato nella tabella sottostante. Volumi della miscela di reazione da utilizzare con il protocollo di ESTRAZIONE Reagente Miscela di reazione Volume/1 reazione Miscela di reazione Volume /10 reazioni Simplexa Master Mix (Miscela master Simplexa ) 4,0 µl 40 µl Simplexa Bordetella Primer Mix (Miscela di primer Bordetella 1,0 µl 10 µl Simplexa ) Volume totale 5,0 µl 50 µl 3. Mescolare delicatamente la miscela di reazione per inversione o pipettando 8-10 volte. 4. Centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 5. Procedere all impostazione della PCR. 6. Utilizzare la miscela di reazione entro un ora dalla preparazione. Se l impostazione della PCR non viene eseguita subito dopo la preparazione della miscela di reazione, conservare quest ultima a 2-8 C fino al momento di procedere (entro un'ora). E. AREA DI AMPLIFICAZIONE CON PCR IN TEMPO REALE Operare in un area dedicata alla preparazione dello Universal Disc a 96 pozzetti per il saggio Simplexa Bordetella Universal Direct. Utilizzare il blocco freddo per il disco universale durante il caricamento del campione e della miscela di reazione. Da utilizzare con il protocollo di ESTRAZIONE 1. Aggiungere 5,0 µl della miscela di reazione in ogni pozzetto. 2. Aggiungere 5,0 µl del controllo positivo estratto al pozzetto "PC" del disco. 3. Aggiungere 5,0 µl del campione paziente estratto all appropriato pozzetto "S" del disco. 4. Aggiungere 5,0 µl del controllo senza templato estratto (acqua priva di nucleasi) al pozzetto "NTC" del disco. 5. Coprire il disco con il Universal Disc Cover Tape (nastro di copertura per dischi universali). 6. Caricare il Universal Disc (disco universale) sigillato su Integrated Cycler e avviare la sessione. PRESENTAZIONE DEI RISULTATI La presentazione dei risultati comprende tre passaggi. 1. Esame dei controlli per determinare se la sessione è valida. Se uno qualsiasi dei campioni programmati come controlli non è valido, il software Integrated Cycler Studio elimina l interpretazione dei risultati del paziente. 2. Esame della validità dei risultati relativi ai campioni dei pazienti. 3. Interpretazione dei risultati relativi ai pazienti. Se i controlli non sono validi, non è possibile interpretare i risultati dei pazienti. 1. Determinare la validità della sessione esaminando il controllo senza templato, il controllo positivo per Bordetella e il controllo interno DNA. Criteri per stabilire la validità dei controlli (semplificati)* Controllo Ct Bp Ct Bpp Ct DNA IC Controllo No Template (NTC) , ma 0 Controllo positivo: 40, ma 0 40, ma 0 Non applicabile (N/A) * Per una descrizione completa, leggere le note seguenti.

7 Pagina 7 a. Se il controllo senza templato è: i. Positivo (valore Ct 40, ma 0 per Bp o Bpp), ciò indica la possibile contaminazione dei campioni preparati. Il controllo non è valido e tutti i campioni dei pazienti devono essere nuovamente analizzati. ii. Negativo per il rilevatore Bp e Bpp (Ct = 0), il controllo è valido e accettabile. iii. Se nel controllo senza templato non viene rilevato DNA IC, il saggio non è valido e tutti i campioni dei pazienti devono essere nuovamente analizzati. iv. Se viene rilevato DNA IC per il controllo senza templato, il saggio è considerato valido e accettabile. b. Controllo positivo: i. Se il risultato del Controllo Positivo è Ct = 0 per Bp e Bpp, il saggio è considerato non valido e non accettabile. Tutti i campioni dei pazienti devono essere riesaminati. ii. Se i valori Ct per Bp e Bpp sono 40, ma 0 il saggio viene considerato valido e accettabile. 2. Esame dei risultati da campioni dei pazienti L esame dei risultati da campioni clinici deve essere eseguito dopo avere esaminato e trovato validi e accettabili il controllo positivo e il controllo senza templato. I risultati per Bp, Bpp e DNA IC devono essere esaminati per ciascun campione proveniente da pazienti. a. Esaminare i grafici di amplificazione per tutti i risultati accompagnati dal messaggio "Data Quality" (Qualità dei dati). Una curva di amplificazione valida mostra un aumento esponenziale uniforme. Una curva di amplificazione non valida può essere una curva non esponenziale, una curva lineare oppure una curva che presenta picchi che possono anche superare il valore soglia. Se dopo l'esame la curva è valida, il valore Ct refertato può essere utilizzato per stabilire se i target Bp o Bpp sono stati rilevati come indicato nella sezione 3 seguente. Seguono esempi di curve valide e non valide. Curva di amplificazione valida Curva di amplificazione valida Curva di amplificazione non valida b. Se la curva di amplificazione è valida per Bp o Bpp, non è necessario rilevare il DNA IC per refertare un risultato positivo. 3. Interpretazione dei risultati Interpretazione dei risultati Valore Ct per Valore Ct per Valore Ct per Esempio Interpretazione Bp Bpp DNA IC , 0 Bp e Bpp non rilevate 2 40, 0 0 N/A Bp rilevata , 0 N/A Bpp rilevata 4 40, 0 40, 0 N/A Bp e Bpp rilevate Ct = soglia ciclo. Rilevato è Ct 40, 0. Non rilevato è Ct = 0, Non è necessaria la rilevazione del Simplexa DNA Internal Control (controllo interno DNA Simplexa ) per riportare un risultato positivo. LIMITAZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Solo per l'esportazione. 3. Il test deve essere eseguito solo da personale adeguatamente formato e che abbia acquisito familiarità con le procedure d esame e l'interpretazione dei risultati. 4. Tutti i risultati derivanti da questo e da altri test devono essere correlati al quadro clinico, ai dati epidemiologici e ad altri dati disponibili ai fini della valutazione del paziente da parte del medico.

8 Pagina 8 5. La prevalenza dell infezione influisce sul valore predittivo del test. 6. Come accade con altri test, un risultato negativo non esclude la presenza di infezioni da Bp o Bpp. 7. Si possono avere risultati falsi negativi quando il microrganismo infettante presenti mutazioni genomiche, inserzioni, delezioni o riarrangiamenti del genoma, o se il test viene eseguito in una fase molto precoce della malattia. 8. Si possono avere risultati falsi negativi se il campione contiene un numero inadeguato di microrganismi a causa di prelievo, trasporto o manipolazione non corretti. 9. Come accade per altri test, si possono avere risultati falsi positivi. In alcuni scenari, può essere indicato ripetere il test o eseguirlo con un dispositivo differente. 10. Questo è un test qualitativo e non fornisce informazioni sul valore quantitativo del microrganismo rilevato. 11. Non è stata definita la performance di questo test per pazienti senza sintomi di infezione da Bordetella pertussis o Bordetella parapertussis. 12. Non è stata definita la performance di questo test per monitorare il trattamento dell infezione da Bordetella pertussis o Bordetella parapertussis. 13. Non è stata definita la performance di questo test come screening del sangue o degli emoderivati per la ricerca di Bordetella pertussis o Bordetella parapertussis. 14. Questo test non può escludere la presenza di malattie causate da altri patogeni batterici o virali. 15. È possibile la doppia infezione con Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis 6,7, Questo test potrebbe non effettuare distinzioni tra l'infezione da Bordetella pertussis e Bordetella holmesii. Entrambi gli organismi contengono il gene IS481. L'incidenza di Bordetella holmesii nei campioni clinici è risultata molto bassa (<0,5%) e non è chiaro se la Bordetella holmesii possa causare patologie respiratorie in soggetti altrimenti sani Questo test potrebbe non effettuare distinzioni tra l'infezione da Bordetella pertussis e Bordetella bronchiseptica. B. pertussis e alcuni ceppi di B. bronchiseptica contengono il gene IS481. Sebbene rare, le infezioni da B. bronchiseptica sono state documentate nei neonati e nei soggetti immunocompromessi 11. CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI SENSIBILITÀ ANALITICA / LIMITE DI RILEVAZIONE Il limite di rilevazione (LoD) è la concentrazione che risulta in un tasso di rilevamento 95%. Il LoD del saggio Simplexa è stato valutato utilizzando Bordetella pertussis A639, Bordetella pertussis ATCC 8467, Bordetella parapertussis A747 e Bordetella parapertussis E595. Il LoD per Bordetella pertussis A639 è stato confermato pari a 2,5 UFC/ml per il protocollo di ESTRAZIONE (20/20 casi rilevati) e 250 UFC/ml per il protocollo DIRETTO (20/20 casi rilevati). Il LoD per Bordetella parapertussis A747 è stato confermato pari a 10 UFC/ml per il protocollo di ESTRAZIONE (19/20 casi rilevati) e 1000 UFC/ml per il protocollo DIRETTO (19/20 casi rilevati). Con entrambi i protocolli sono state rilevate sia Bordetella pertussis ATCC 8467, sia Bordetella parapertussis E595. RIPRODUCIBILITÀ Sono stati condotti due studi di riproducibilità separati. Lo studio di riproducibilità per il protocollo di ESTRAZIONE è stato eseguito da due operatori, ciascuno dei quali ha utilizzato uno strumento diverso. Ogni operatore ha eseguito una singola estrazione su ciascun campione di un pannello di riproducibilità e ha eseguito due sessioni di PCR al giorno per un totale di 5 giorni (n=20 test totali). In ogni esecuzione sono state testate tre repliche di ciascun campione ed il controllo positivo. Riproducibilità del protocollo di ESTRAZIONE - Bp Inter/intra-saggio Inter-strumento ID campione n Ct medio DS Intrasaggio CV % Intrasaggio DS Intersaggio CV % intersaggio Ct medio DS % CV BP-Med 60 29,5 1,01 3,4 0,70 2,4 29,5 0,00 0,0 BP-Low 60 32,7 0,92 2,8 0,72 2,2 32,7 0,00 0,0 BPP-Med 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 BPP-Low 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Negative 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0

9 Pagina 9 Riproducibilità del protocollo di ESTRAZIONE - Bpp Inter/intra-saggio Inter-strumento ID campione n Ct medio DS Intrasaggio CV % intrasaggio DS Intersaggio CV % intersaggio Ct medio DS % CV BPP-Med 60 31,1 0,43 1,4 0,28 0,9 31,1 0,41 1,3 BPP-Low 60 34,7 0,77 2,2 0,00 0,0 34,7 0,71 2,0 BP-Med 60 39,9 0,45 1,1 0,00 0,0 39,9 0,00 0,0 BP-Low 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Negative 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Lo studio di riproducibilità per il protocollo DIRETTO è stato eseguito da due operatori. Ciascun operatore ha eseguito 15 sessioni, una su ciascuno di tre strumenti al giorno, per un totale di 5 giorni (n=30 test totali). In ogni esecuzione sono state testate tre repliche di ciascun campione ed il controllo positivo. Riproducibilità del rotocollo DIRETTO - Bp Inter-strumento Inter-operatore Intersessione/giorno Intra-sessione Totale Campione N Ct medio DS % CV DS % CV DS % CV DS % CV DS % CV Positive Control (PC) 90 30,0 0,58 1,9 0,05 0,2 1,40 4,7 0,37 1,2 1,55 5,2 BP Medium Positive 89* 32,3 0,98 3,0 0,00 0,0 0,46 1,4 0,72 2,2 1,30 4,0 BP Low Positive 90 33,2 1,16 3,5 0,00 0,0 0,24 0,7 1,11 3,3 1,63 4,9 Riproducibilità del protocollo DIRETTO - Bpp Inter-strumento Inter-operatore Intersessione/giorno Intra-sessione Totale Campione N Ct med io DS % CV DS % CV DS % CV DS % CV DS % CV Positive Control (PC) 90 27,7 0,67 2,4 0,05 0,2 1,45 5,2 0,38 1,4 1,65 5,9 BPP Medium Positive 89* 31,5 0,95 3,0 0,20 0,6 0,39 1,2 0,57 1,8 1,19 3,8 BPP Low Positive 90 34,6 1,15 3,3 0,14 0,4 0,25 0,7 0,96 2,8 1,52 4,4 *Un replicato è risultato «non valido» REATTIVITÀ ANALITICA / REATTIVITÀ CROCIATA Diciassette (17) organismi sono strati testati per una potenziale reattività crociata con Bordetella pertussis e parapertussis. I risultati dei test sono riepilogati nelle seguenti tabelle: Reattività analitica / Reattività crociata - Bp Cross-reagente potenziale Risultati del protocollo di ESTRAZIONE Risultati del protocollo DIRETTO Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3

10 Pagina 10 Cross-reagente potenziale Risultati del protocollo di ESTRAZIONE Risultati del protocollo DIRETTO Corynebacteria diptheria 2/3; 0/5 0/3 Haemophilus influenzae 1/3; 0/5 0/3 Haemophilus parainfluenzae 0/3 2/3; 1/5* Influenza A/Solomon Island/03/06 H1 0/3 1/3; 0/5 Influenza B/Florida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitides 0/3 0/3 RSV B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 1/3; 0/5 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 1/3; 3/5** 0/3 Streptococcus pyogenes 0/3 0/3 * L analisi di sequenza non ha rivelato omologie significative tra le sequenze usate nel saggio per BP e il genoma di H. parainfluenzae. ** I risultati positivi per BP con S. pneumoniae non sono stati replicati in test successivi. Reattività analitica / Reattività crociata - Bpp Cross-reagente potenziale Risultati del protocollo di ESTRAZIONE Risultati del protocollo DIRETTO Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3 Corynebacteria diptheria 0/3 0/3 Haemophilus influenzae 0/3 0/3 Haemophilus parainfluenzae 0/3 0/3 Influenza A/Solomon Island/03/06 H1 0/3 0/3 Influenza B/Florida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitides 0/3 0/3 RSV B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 0/3 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 0/3 0/3

11 Pagina 11 Cross-reagente potenziale Risultati del protocollo di ESTRAZIONE Risultati del protocollo DIRETTO Streptococcus pyogenes 0/3 0/3 INTERFERENZA Quindici (15) sostanze endogene ed esogene sono state aggiunte a campioni di Bordetella pertussis e parapertussis a bassa positività e testate per una potenziale interferenza nel rilevamento di Bp/Bpp. Nel protocollo di ESTRAZIONE, il ceppo di Bordetella pertusiss A639 è stato testato a una concentrazione di 25 UFC/ml e il ceppo di Bordetella parapertusiss A747 è stato testato ad una concentrazione di 50 UFC/ml. Nel protocollo DIRETTO, il ceppo di Bordetella pertusiss A639 è stato testato a una concentrazione di 1250 UFC/ml e il ceppo di Bordetella parapertusiss A747 è stato testato ad una concentrazione di UFC/ml. La tabella sotto riepiloga i risultati degli studi sull'interferenza. Interferenza Potenziale interferente Concentrazione del potenziale interferente Risultati del protocollo di ESTRAZIONE Risultati del protocollo DIRETTO Bp Bpp Bp Bpp Ampicillina 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Azitromicina 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Beclometasone 10% v/v 3/3 3/3 N/A N/A Beclometasone 25 mg/ml N/A N/A 3/3 3/3 Sangue 2% v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Ciprofloxacina 25 mg/ml 3/3 3/3 N/A N/A Ciprofloxacina 250 µg/ml N/A N/A 3/3 3/3 Eritromicina 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Fluticasone 10% v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Quaifenesin/ dextromethorphan 10% v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Mucina 60 μg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Mupirocina 25 mg/ml 3/3 6/8 1 3/3 3/3 Ossimetazolina 10% v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Fenolo clorasettico 10% v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Fenilefrina 10% v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Rifampicina 25 mg/ml 3/3 7/8 2 N/A N/A Rifampicina 250 µg/ml N/A N/A 3/3 3/3 Cloruro di sodio 10% v/v 3/3 7/8 2 3/3 3/3 1 Uno dei tre replicati iniziali e uno dei cinque replicati aggiuntivi (utilizzati per confermare la possibile interferenza) non ha rilevato la Bpp. 2 Uno dei tre replicati iniziali non ha rilevato la Bpp; tuttavia, la Bpp è stata rilevata in cinque replicati aggiuntivi (utilizzati per confermare la possibile interferenza). CONCORDANZA CLINICA Un totale di 222 campioni, comprensivi di campioni di Bordetella pertussis positivi (arricchiti e endogeni) e negativi e di campioni di Bordetella parapertussis positivi (arricchiti e endogeni) e negativi sono stati testati utilizzando il kit Focus Diagnostics Bordetella (MOL0200) e il nuovo kit Simplexa Bordetella Universal Direct usando il protocollo di ESRAZIONE (MOL2700 / MOL2775). I risultati del confronto tra i metodi sono riepilogati di seguito.

12 Pagina 12 Concordanza clinica Risultati per Bp Predicate (MOL0200) Simplexa Bordetella (MOL2700) n Rilevato Non rilevato Indeterminato % concordanza (osservati/previsti) IC al 95% Rilevato ,5%(65/66) 95% CI:91,9-99,7% Non rilevato ,8%(151/156) 95% CI:92,7-98,6% Risultati per Bpp Predicate (MOL0200) Simplexa Bordetella (MOL2700) n Rilevato Non rilevato Indeterminato % concordanza (osservati/previsti) IC al 95% Rilevato %(71/71) 95% CI:94,9-100% Non rilevato %(148/151) 95% CI:94,3-99,3% CONFRONTO TRA I METODI - Protocollo di ESTRAZIONE contro protocollo DIRETTO Per dimostrare la relazione tra i risultati ottenuti utilizzando il protocollo di ESTRAZIONE ed il protocollo DIRETTO, è stata effettuata un'analisi comparativa dei valori Ct ottenuti da un insieme di campioni positivi arricchiti ed endogeni. I valori Ct dei campioni che erano positivi utilizzando il protocollo di ESTRAZIONE sono stati confrontati con i valori Ct degli stessi campioni per cui si è utilizzato il protocollo DIRETTO. Per Bordetella pertussis la pendenza della retta di regressione è 0,98 con una intercetta di 2,89. Per Bordetella parapertussis la pendenza della retta di regressione è 1,04 con una intercetta di 0,56. In entrambi i casi, la pendenza della retta di regressione indica una buona correlazione tra i due protocolli. Figura 1: Regressione di Passing-Bablok - Bordetella pertussis

13 Pagina 13 Figura 2: Regressione di Passing-Bablok - Bordetella parapertussis Contaminazione da carry-over di prodotti di amplificazione Il carry-over di prodotti di amplificazione utilizzando lo Universal Disc e lo Universal Disc Cover Tape è stata valutata con altri saggio Simplexa e non dipende dal saggio. BIBLIOGRAFIA 1. Mattoo & Cherry. Clin Microbiol Rev : Link ai dati dei Centers for Disease Control: 3. Link alla National Consensus Conference on Pertussis, : 4. Kerr et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis : Linneman et al., Am J Dis Child : Mertsola, J. Eur J Clin Microbiol : Hoppe, J.E. Pediatr Infect Dis : Iwatta et al. Dev Biol Stand : Loeffelholz, M.J et al. J. Clin Microbiol : Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity Mortality Weekly Report (MMWR) 2007 Aug 24; 56: Register, J.B. and Sanden, G.N., Journal of Clinical Microbiology, Dec 2006, p L uso delle sonde Scorpions per la diagnostica in vitro nell'uomo è coperto da una licenza concessa da DxS, Ltd a Focus Diagnostics, Inc. I coloranti Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar sono a marchio Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). La tecnologia con colorante Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar è concessa in licenza ai sensi dell accordo con BTI e tali prodotti sono venduti a solo scopo clinico, diagnostico o di ricerca e sviluppo. RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Germania INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Telefono: Fax: ASSISTENZA TECNICA (800) (solo USA) (562) (562) (dall'estero) PI.MOL2775 Rev. A Redatto il: 08 giugno 2012 Telefono: (800) (solo USA) Fax: (562) Visitate il nostro sito web all indirizzo (562) (dall'estero) Cypress, California 90630, Stati Uniti