HPV metodiche molecolari e considerazioni su una casistica eterogenea Sara Galastri, Michela Donatelli

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1 19 Corso Nazionale per Tecnici di Laboratorio Biomedico Riccione, maggio 2012 HPV metodiche molecolari e considerazioni su una casistica eteroea Sara Galastri, Michela Donatelli SOD Istologia Patologica e Diagnostica Molecolare, DAI Biomedicina, AOU-Careggi AOU-CAREGGI Firenze

2 HPV Virus a DNA (Fam. Papovaviridae) DNA circolare (~7900 bp in lunghezza) circondato da capside Specie-specifici Tropismo cellule epitelio-squamoso (epiteliotropi) > 100 tipi HPV sono stati caratterizzati

3 HPV I papillomavirus sono molto diffusi nella specie umana, con uno specifico tropismo per le cellule dell epitelio squamoso, replicandosi solo nelle cellule epiteliali della cute e delle mucose; E la più comune delle infezioni a trasmissione sessuale e la trasmissione può avvenire anche tramite semplice contatto nell area itale; Il 50-80% dei soggetti sessualmente attivi si infetta nel corso della vita con un virus HPV e fino al 50% si infetta con un tipo oncoo.

4 HPV La storia naturale dell infezione è fortemente condizionata dall equilibrio che si instaura fra ospite ed ate infettante; L infezione può regredire, persistere o progredire: La maggior parte (70-90%) delle infezioni da HPV è transitoria, asintomatica e guarisce spontaneamente. La persistenza dell infezione è condizione necessaria, ma non sufficiente per la trasformazione neoplastica La probabilità di progressione delle lesioni è correlata anche ad altri fattori: elevato numero di partner sessuali, fumo di sigaretta uso prolungato di contraccettivi orali co-infezione con altri virus

5 HPV

6 HPV e lesioni cliniche Genotipo Patologia associata 1 Verruche plantari 2, 4, 29 Verruche volgari 3,10,28,49 Verruche piane 6, 11, 42 Condilomi itali, papillomi laringei 16, 18, 31, 33, 35, Displasie anoitali, carcinomi 39, 45, 51, 52, 56 58, 59, 68

7 Patoesi Sexual Exposure HPV Infection Cervical Transformation Zone Squamous Ep Columnar Ep Low Risk-6,11 High Risk Types (16,18) Smoking, Hormone, Oral contr. parity, Altered immune response etc. Condyloma Squamous Ca Adeno Ca

8 Lesioni preneoplastiche cervice uterina La maggior parte dei carcinomi della cervice è preceduta da una lesione precancerosa che può persistere in uno stadio non invasivo per molti anni. ISTOLOGIA CITOLOGIA Displasia: lieve/condiloma moderata grave/carcinoma in situ Neoplasia intraepiteliale cervicale CIN I/condiloma CIN II CIN III Lesione intraepiteliale squamosa: Basso grado (L-SIL) Alto grado (H-SIL)

9 HPV test A fronte di alcune lacune diagnostiche della citologia (falsi negativi dall 1.6% al 28%), si è reso necessario individuare un test diagnostico aggiuntivo, capace di incrementare la specificità e la sensibiltà dell esame citologico nel riconoscimento delle displasie di basso ed alto grado e dei carcinomi, riducendo così il rischio di falsi negativi; Il razionale per l introduzione e la diffusione dell HPV test si fonda soprattutto sul suo elevato valore predittivo negativo; L associazione HPV test-pap test ha una sensibilità maggiore a quella del test da solo, con un valore predittivo negativo del 100%.

10 HPV test: possibili applicazioni 1. Test primario di screening, da solo o con la citologia (pap test) 2. Triage nelle lesioni dubbie (ASC-US) 3. Follow-up delle pazienti trattate per lesioni di alto grado

11 1 - HPV test: test primario L infezione da HPV è molto frequente, specie nelle fasce di età più giovanili (28%-46%, sotto i 25 anni). Il test evidenzia infezioni che nella maggior parte dei casi saranno destinate a risolversi spontaneamente (infezioni transienti). Il costo elevato e le diverse realtà locali dei programmi di screening non rendono utilizzabile l HPV-test come test di screening.

12 2 - HPV test: Triage nelle lesioni dubbie (ASC-US) Diversi studi hanno dimostrato che la sensibilità (96.3%) e la specificità (49%) dell HPV test per CIN II-III sono superiori a quelle della ripetizione citologica (85.3% e 45%). I risultati dello studio ALTS (ASCUS Low Sil Triage Study) dopo 2 anni di followup indicano la superiorità in termini di sensibilità dell HPV-test nei confronti anche della colposcopia. Linee guida SICPCV,2006

13 3 - HPV test: Follow-up L utilità dell HPV test nel follow-up di lesioni di alto grado (CIN II-III) per determinare il rischio di persistenza o di recidiva, è riconducibile all evidenza che una negatività del test corrisponde a un rischio minimo di recidiva. In molti studi, nel 97% dei casi di CIN II-III identificati al follow-up HPV, la sensibilità e il NPV complessivi dell HPV test sono risultati rispettivamente del 96,5% e del 98,8%, rivelandosi superiori ai valori della citologia. Linee guida SICPCV,2006

14 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI Controlli ambulatoriali (adolescenti ) Conferma diagnosi prima del trattamento Gestione ASCUS Follow-up dopo trattamento (conizzazione, vaporizzazione ) COLPOSCOPIA biopsia VAPORIZZAZIONE CONO PAP TEST I diagnosi HPV test Negativo (ASCUS) FOLLOW-UP Pap test HPV test PERDITA

15 TEST HPV: Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA Il test Inno-Lipa Genotyping Extra si basa sul principio dell ibridazione molecolare inversa: Reverse Dot Blot. Il test prevede 3 fasi principali: 1. Estrazione del DNA su colonnine di eluizione da campioni di cellule cervicali; 2. Amplificazione del DNA target mediante primers consensus che abbiano come bersaglio una regione del oma virale conservata tra i vari otipi (regione L1) e una coppia di primers per l amplificazione del e umano HLA-DPB1; 3. Ibridazione degli amplificati con specifiche sonde nucleotidiche fissate su striscia di nitrocellulosa.

16 TEST HPV: Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA 1. Fase di estrazione DNA 2. Fase di amplificazione DNA kit inno-lipa HPV otyping extra QIAprep spin Miniprep kit in QIACUBE

17 TEST HPV: Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA 3. Fase di ibridazione Auto-Lipa 48 Inno-Lipa HPV Genotyping Extra : test a sonde allineate, per uso diagnostico in vitro, creato per l identificazione di 28 diversi otipi dell HPV.

18 TEST HPV: Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA Lettura e Interpretazione risultati Le strisce di nitrocellulosa sono rimosse dall Auto-Lipa 48, asciugate con carta assorbente e attaccate su schede Lipa scan reading templat. Lettura con scanner e interpretazione dei risultati tramite software Liras. Linea identificazione Linea controllo coniugato Linea controllo DNA umano Linee tipi HPV

19 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI RISULTATI HPV TEST TAB 1 RISULTATI HPV N CASI POS 1249 NEG RISULTATI HPV N CASI HR 780 phr 139 LR 134 NC HPV X 151 NEG 1245 TOT pos neg HR = alto rischio LR = basso rischio phr = potenzialmente alto rischio NC = non classificato

20 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI DISTRIBUZIONE RISULTATI POSITIVI TAB 2 RISULTATI HPV POS N % tot pos HR ,7 phr ,1 LR NC HPV X HR = alto rischio phr = potenzialmente alto rischio LR = basso rischio NC = non classificato 10,7% 11,1% 3,6% HR phr LR NC HPV X 12,1% 62.7% 62,4%

21 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI HPV ALTO RISCHIO: DISTRIBUZIONE INFEZIONI A GENOTIPO SINGOLO/ COINFEZIONI TAB. 3 HR: inf. singole/coinf. N CASI % su tot pos otipo sing ,9 2 otipi (almeno 1 HR) ,4 di cui prevale coinfez otipi (almeno 1 HR) 101 8,1 4 otipi (almeno 1 HR) 32 2,6 > di 4 ot. (almeno 1 HR) 14 1,1 32,9% , ,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 17.4% 8,1% 2,6% 1.1% 0 otipo sing. 2 otipi 3 otipi 4 otipi > di 4 otipi 0,0 otipo sing. 2 otipi 3 otipi 4 otipi > di 4 otipi

22 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI HPV ALTO RISCHIO: DISTRIBUZIONE DEI SINGOLI GENOTIPI TAB. 4 PREVALENZA IN INFEZIONI PREVALENZA IN INFEZIONI PREVALENZA IN SINGOLE/COINFEZIONI SINGOLE/COINFEZIONI INFEZ. SINGOLE Valore assoluto % su TOT POS , , , , , , , , , , , , , , ,6 TOT

23 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI HPV ALTO RISCHIO: DISTRIBUZIONE DEI SINGOLI GENOTIPII TAB. 5 PREVALENZA IN INFEZIONI SINGOLE/COINFEZIONI % su TOT POS G E NOTIP I HR % 16 18,5 18 4, ,5 33 3,3 35 1,8 39 4,5 45 2,3 51 1, ,0 56 4,9 58 3,0 59 0,9 68 1,9 73 0,7 82 0,

24 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI HPV 31 HPV 52 : FOLLOW-UP COLPOSCOPIA biopsia VAPORIZZAZIONE ( 20%) CONO PAP TEST I diagnosi HPV test ASCUS ( 40%) ( 10%) FOLLOW-UP Pap test HPV test PERDITA ( 30%) 6.3% 6.7% 4.5% 3.8% CONO HPV - CONO HPV - HPV 52 HPV 31

25 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI HPV 31 HPV 52 : FOLLOW-UP VAPORIZZAZIONE COLPOSCOPIA biopsia ( 20%) CONO PAP TEST I diagnosi HPV test ASCUS ( 40%) ( 10%) FOLLOW-UP Pap test HPV test PERDITA ( 30%) 15.2% 15.4% 5.3% 2.9% BIOPSIA HPV - BIOPSIA HPV - HPV 52 HPV 31

26 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI HPV 31 HPV 52 : FOLLOW-UP VAPORIZZAZIONE ( 20%) COLPOSCOPIA biopsia CONO ( 10%) PAP TEST I diagnosi HPV test ASCUS ( 40%) PERDITA ( 30%) FOLLOW-UP Pap test HPV test 30.3% 27.9% 6.3% 9.6% I HPV HPV - I HPV HPV - HPV 52 HPV 31

27 TEST HPV: SOD Citopatologia Diagnostica AOU CAREGGI SUMMARY Nel biennio , nel nostro laboratorio sono stati eseguiti circa 2500 test HPV su una casistica molto eteroea. Il 50% è risultato HPV positivo. Nella maggior parte dei casi si tratta di infezione da singolo ceppo HPV alto rischio e la prevalenza maggiore nelle infezioni è rappresentata dai otipi 16, 31 e 52. Le infezioni da parte di 31 e 52 causano lesioni di alto grado nel 10% circa dei pazienti, nel 20% sono responsabili di lesioni benigne e nel 40% circa causano alterazioni cellulari di dubbia interpretazione (ASCUS). Il 15% delle infezioni virali da parte dei otipi 31 e 52, va incontro a remissione al follow-up.

28 AOU-CAREGGI Firenze GRAZIE PER L ATTENZIONE