CENTRO INTERUNIVERSITARIO DI DERMATOLOGIA BIOLOGICA E PSICOSOMATICA (Dir. Prof. Torello Lotti)

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1 CENTRO INTERUNIVERSITARIO DI DERMATOLOGIA BIOLOGICA E PSICOSOMATICA (Dir. Prof. Torello Lotti) PROGETTO DI RICERCA PER STUDI DI GENETICA DELLE MALATTIE DERMATOLOGICHE E FARMACOGENETICA PER LA VALUTAZIONE DELL APPROPRIATEZZA DEI FARMACI BIOLOGICI NELLA CURA DELLE MALATTIE DERMATOLOGICHE Premesse Le malattie dermatologiche trasmesse geneticamente sono un gruppo di più di duecento disordini, clinicamente ed eziologicamente differenti, che si presentano con vari gradi di coinvolgimento di aree cutanee e degli annessi. Lo spettro di gravità delle manifestazioni si estende da sintomi cutanei localizzati con impatto esclusivamente estetico a forme severe, generalizzate, multisistemiche e con diverso grado di morbilità e mortalità. Molte forme di dermatosi geneticamente predeterminate sono diagnosticabili con difficoltà dal dermatologo clinico che si trova di fronte a forme rare seppur gravi. Una diagnosi iniziale errata comporta il cambiamento della strategia terapeutica in corso di trattamento, con ovvie conseguenze negative per il paziente. Gli entusiasmanti recenti progressi della genetica molecolare accompagnati dai progressi in campo informatico hanno cambiato il modo di fare diagnosi. Il chiarimento infatti dei meccanismi molecolari di più del 60% delle dermatosi su base genetica ottenuto con studi di linkage, mirati ad individuare geni difettosi localizzati in specifici loci cromosomici, o con studi di clonaggi posizionali e di analisi di sequenze di geni o di regioni di DNA opportunamente individuate, ha reso molto più semplice ed affidabile la diagnosi. La ricerca dermatogenetica ha scoperto più di 170 diversi geni che possono presentare mutazioni legate a malattie dermatologiche. Queste importanti informazioni hanno permesso di sviluppare test diagnostici biochimici o molecolari che permettono di porre una diagnosi sicura per un ampio numero di dermatosi su basi molecolari note. La possibilità di identificare specifiche mutazioni portatrici di malattia nei singoli pazienti e successivamente nelle famiglie portatrici permette inoltre, di stabilire il meccanismo di trasmissione della malattia e di fare dunque previsioni di ricorrenza di malattia nella progenie, e permette inoltre, di effettuare diagnosi prenatale. Questa traslazione delle conoscenze di base nella pratica clinica ha un enorme impatto nella cura del paziente ed in modo particolare in quelle forme morbose in cui un trattamento adeguato e tempestivo può modificare la speranza di vita del paziente. La FDA nel corso del 2006 ha fornito varie linee guida per la messa a punto e la successiva validazione di biomarkers. Nuove frontiere della genetica moderna in campo dermatologico sono rappresentate dalla farmacogenetica e dalla farmacogenomica soprattutto in considerazione dell uso dei nuovi farmaci biologici, che in campo dermatologico trovano raccomandazioni d uso. L EMEA raccomanda l uso dei biologici nelle forme di psoriasi grave e nella artrite psoriasica. PSORIASI La psoriasi è la malattia dermatologica più comune ed ormai è chiaramente indicata come una malattia immunologica su base genetica e con fattori scatenanti ancora parzialmente ignoti e rappresentati soprattutto da infezioni microbiche, disordini endocrini, ipocalcemia, farmaci, stress psicologici e traumi locali. La psoriasi affligge 25 di milioni di persone in Europa e nel Nord America ed in alcune popolazioni la prevalenza della malattia raggiunge il 5% degli individui. E legata a fattori genetici ed ambientali come dimostrato dalla diversa incidenza tra le varie popolazioni, colpisce in egual misura entrambe i sessi e compare prevalentemente in età giovanile. Alcuni autori descrivono due picchi di incidenza in relazione all età, che potrebbero contribuire a distinguere la malattia in due tipi differenti come succede nel caso del diabete: uno con esordio tra i 20 e i 30 anni (tipo I) associata a modificazioni HLA e caratterizzata da una storia familiare di casi con quadri severi, e un secondo picco (tipo II) con insorgenza tra i 50 ai 60 anni HLA negativa e 1

2 con manifestazioni più leggere. La psoriasi rientra nella definizione generale di malattia autoimmune organo specifica ossia sindrome clinica causata da attivazione dei linfociti T e B in assenza di una causa infettiva o di altro tipo in atto. Rientrano in questa definizione altre sindromi che possono manifestarsi in forme altrettanto severe e gravi e che coinvolgono in maniera specifica organi e tessuti target specifici come il morbo di Chron, l artrite reumatoide, la sclerosi multipla ed il diabete giovanile (4). Istologicamente la psoriasi è caratterizzata da un ispessimento marcato dell epidermide dovuto ad una accelerazione del ritmo proliferativo dei cheratinociti interfollicolari, da un alterazione della differenziazione degli stessi che si manifesta con uno strato granuloso di spessore molto ridotto, con alterazione della funzione barriera e formazione di uno strato corneo paracheratosico. L epitelio oltre ad essere ispessito presenta rapporti molto più estesi, come dimostrato dall aumento dell estensione delle interdigitazioni, con lo strato connettivo dermico da cui trae i fattori necessari per mantenere l iperattività. Sono evidenti a livello epiteliale infiltrati leucocitari, mentre a livello dermico oltre ad infiltrati leucocitari molto evidenti, si notano un aumento della vascolarizzazione ed un iperplasia dei vasi che contribuiscono a conferire il tipico arrossamento alle lesioni. Numerosi linfociti, monociti e neutrofili aderiscono alle pareti endoteliali, che come dimostrato dall immunostainig presentano aumentata espressione di molecole di adesione come I-CAM, E-CAM ed E-Selectina necessarie per la trasmigrazione cellulare (5). Tuttavia a livello dermico sono presenti linfociti e leucociti residenti in grado essi stessi di proliferare e di creare la popolazione capace di mantenere lo stato infiammatorio. E stato dimostrato infatti in modelli di topi immunodeficicienti, che il trapianto di pelle sana proveniente da soggetti psoriasici era capace di sviluppare malattia con segni istologici di aumento della popolazione di cellule dendritiche e di linfociti T (6). Le lesioni psoriasiche sono determinate dall interazione e dalla reciproca attivazione tra leucociti mononucleati e cheratinociti, che rappresentano tutt altro che una popolazione cellulare spettatrice passiva dell attacco immunitario, ma essi stessi secernono fattori autocrini e paracrini capaci di mantenere ed amplificare la reazione infiammatoria e proliferativa. Le cellule dell immunità innata presenti nelle lesioni psoriasiche sono principalmente neutrofili, cellule dendritiche plasmacitoidi (CD) e cellule dendritiche mieloidi CD11c + (CD11c + DC). I neutrofili avendo ciclo vitale breve devono essere continuamente reclutati dal torrente circolatorio, attraverso fattori chemiotattici prodotti dai cheratinociti e rappresentati principalmente da IL8, Growth regulated oncogene-α GRO -α e probabilmente le proteine S100A7/A8/A9 (5). Le CD plasmacitoidi che in seguito all attivazione producono elavati livelli di Interferon α sono state indicate come principali responsabile delle lesioni (7). Le cellule dendritiche mieloidi (CD11c + DC) sono presenti in abbondanza nelle lesioni psoriasiche ed esprimono elevati livelli di Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), dell enzima ossido nitrico sintetasi inducibile (inos) e sono inoltre responsabili della secrezione di citochine come IL-23 ed IL-20 che hanno la capacità di attivare rispettivamente i linfociti T ed i cheratinociti (8, 9). Inoltre una frazione di CD11c + DC esprime molecole coattivatrici del tipo CD83 e può funzionare con il suo ruolo convenzionale di Antigen Presentino Cells (APC) determinando attivazione linfocitaria e dunque innescando la risposta immunitaria acquisita come dimostrato dalla presenza di aggregati tra cellule T e DC a livello dermico e dalla compresenza di chemochine come CCL19, CCL21, CXCL12, CCL18 che possono favorire l attivazione linfocitaria. I linfociti T nelle lesioni psoriasiche sono principalmente polarizzati in senso T Helper1 (TH1) e T citotossici (Tc1;CD8 + ), ma evidenze recenti indicano la presenza di una popolazione TH17 indotta probabilmente dalla IL23. Alcune popolazioni linfocitarie sono specializzate per l homing epidermico attraverso l espressione di molecole integriniche che legano specificamente le E.caderine cheratinocitarie. I cheratinociti possono secernere molecole capaci di attivare gli immunociti, mentre questi ultimi possono paracrinamente rispondere determinando la produzione di molecole di adesione cheratinocitarie capaci di reclutare un maggior numerosi immunociti. Alcuni autori pensano, infatti, che un ruolo patogenetico nella psoriasi sia rappresentato da un difetto delle cellule T regolatorie. 2

3 La natura infiammatoria della psoriasi è stata confermata dal successo terapeutico dei farmaci biologici capaci di bloccare selettivamente e specificamente molecole attivatrici di attori cellulari responsabili di attivazione del sistema immunitario, confutando in pieno la vecchia ipotesi che la patogenesi fosse determinata da un semplice disordine iperproliferativo dei cheratinociti. La ulteriore definizione dei meccanismi fisiopatologici contribuiranno sicuramente in futuro ad ottenere farmaci sempre più potenti, efficaci e selettivi. I FARMACI BIOLOGICI I farmaci denominati biologici o meglio biotecnologici derivano dallo sforzo compiuto dalla comunità scientifica internazionale nella definizione dei meccanismi patogenetici delle malattie e dai recenti progressi delle biotecnologie sia a livello di ricerca che di produzione industriale. La scelta del trattamento farmacologico per la cura della psoriasi dipende da molti fattori come l estenzione delle lesioni, l effetto che esse hanno sulla qualità di vita del paziente e la percezione che esso ha della sua malattia. Negli ultimi tre anni è stato approvato da parte delle autorità competenti della FDA e dell EMEA l uso di farmaci biologici per la cura dei quadri severi. I farmaci biologici approvati sono Alefacept (Amevive, approvato solo dalla FDA) Efalizumab (Rapiva, approvato da FDA ed EMEA), Infliximab (Remicade, approvato da FDA ed EMEA), Eternecept (Enbrel, approvato da FDA ed EMEA). Gli agenti biologici sono proteine o anticorpi destinati a bloccare specifiche molecole essenziali nel processo patogenetico della malattia. In particolare si possono distinguere in due gruppi: i bloccanti del TNF-α e i bloccanti di molecole responsabili dell attivazione dei linfociti T. Alefacept è una proteina di fusione che contiene il dominio extracellulare della proteina CD58 (Leucocyte Antigen Function-3, LFA-3) capace di legare la molecola co-stimolatoria CD-2 e la frazione costante degli anticorpi umani IgG1. Le principale cellule che esprimono CD-2 sono i linfociti T e le cellule natural killer (NK) e una piccola porzione di cellule dendritiche circolanti CD14+. Alefacept legando CD2 e la frazione costante (fc) delle IgG forma un ponte tra i linfociti T e le cellule NK inducendo apoptosi dei linfociti T (10). Questo meccanismo potrebbe spiegare la riduzione dei linfociti T associata al trattamento con Alefacept e la successiva riduzione della trascrizione di geni coinvolti nell attivazione di meccanismi infiammatori come INF-γ, STAT-1, MIG(CXCL9), inos, IL-8, IL-23, IL-20 (9,11). Efalizumab, è un esempio di un agente disegnato per interferire con il meccanismo di interazione tra molecole co-stimolatorie e proteine di adesione che partecipano all attivazione dei linfociti T. Si tratta di un anticorpo monoclonale murino umanizzato capace di legare CD11a, subunità proteica che forma un eterodimero con la ß2-integrina CD18, per formare LFA-1 (Leucocytes Activating Factor-1). La molecola CD11a/CD18 espressa selettivamente dai linfociti T si lega ad ICAM-1 e 2. Dalla formazione del complesso LFA-1/I-CAM deriva l interazione tra i linfociti T e le cellule dendritiche ICAM+ con attivazione della presentazione antigenica nei linfonodi, a livello locale nel derma e trasmigrazione dei linfociti T dal derma all epidermide. Efalizumab determina inoltre leucocitosi periferica dovuta prevalentemente ad apoptosi delle cellule T CD8+ memoria determinata probabilmente dalla mancanza dell interazione LFA-1/ICAM-1 tra linfociti e cellule endoteliali. (12). Gli inibitori del TNF-α hanno ampliato enormemente le opportunità terapeutiche per i pazienti con psoriasi grave. I farmaci attualmente approvati dalla FDA e dall EMEA sono infliximab ed etanercept, mentre adalimumab è attualmente in fase III avanzata di sperimentazione e in fase di revisione. Etarnecept è una proteina di fusione costituita dalla porzione extracellulare dei due recettori umani per il TNFα e la Fc delle immunoglobuline IgG1. E dunque capace di inattivare mediante legame selettivo il TNFα e la linfotossina inibendo la loro attività biologica. Infliximab è un anticorpo monoclonale chimerico umano-murino capace di legare TNFα libero o legato al suo recettore e media inoltre la lisi delle cellule che producono TNFα. Adalizumab è il primo anticorpo anti-tnfα completamente umano e teoricamente dovrebbe funzionare come infliximab. 3

4 I farmaci biologici rappresentano al momento un opportunità terapeutica nuova e potente, ma sicuramente non priva di rischi ed effetti collaterali. Come tutti i farmaci che vanno a bloccare meccanismi coinvolti in processi biologici complessi e ubiquitari possono interferire con meccanismi fisiologici primari. Lo studio degli effetti su ampie popolazioni ed il monitoraggio degli effetti post-marketing risultano fondamentali, per un uso razionale e sicuro dei farmaci. L uso improprio di farmaci biologici può sottendere infatti effetti collaterali importanti. E stato recentemente descritto il riacutizzarsi di foci tubercolari in soggetti con tubercolosi pregressa o latente, il riacutizzarsi di infezioni da citomegalovirus e di agenti infettivi che determinano infezioni varie come meningiti, polmoniti etc.. L esito di infezioni in soggetti immunodepressi può a volte risultare fatale. L uso dei biologici è riportato in letteratura determinare la riacutizzazione di malattie come Linfomi, Leucemie, Lupus Eritematoso Sistemico, Sclerosi Multipla, Epatite autoimmune, Morbo di Crohn, etc., e causare forme di trombocitopenia, neutropenia, pancitopenia, linfopenia, agranulocitosi. Un prevedibile futuro diffondersi di terapie biologiche, che trovano indicazione oltre che nella psoriasi, anche in numerose forme morbose aggressive e debilitanti e di enorme impatto sanitario e socio-economico, come malattie autoimmuni, forme tumorali di tipo solido o delle cellule circolanti, malattie infiammatorie del tratto digerente etc. richiede un monitoraggio stretto del loro impiego, degli effetti collaterali, dei rapporti rischi-benefici e costibenefici. FARMACI BIOLOGICI E SPESA SANITARIA I farmaci biologici sono classificati come terapie ad alto costo, che possono rappresentare una spesa importante per il Sistema Sanitario Nazionale (SSN). La valutazione del rapporto costibenefici và tuttavia impostata considerando la gravità e la cronicità delle patologie in cui tali farmaci sono impiegati. Una patologia cronica comporta infatti costi tangibibili per il sistema sanitario rappresentati da risorse umane, quali personale medico, infermieristico, personale per il supporto riabilitativo fisico e psicologico, risorse materiali, quali farmaci e materiali di medicazione e costi intangibili rappresentati dal peggioramento della qualità della vita del soggetto malato e delle famiglie e dal minor contributo dei soggetti alla vita sociale e lavorativa. Il rapporto costi-benefici và valutato dunque in termini di risposta positiva al farmaco, tempi di trattamento ed effetti collaterali. Un impiego mirato e su una popolazione opportunamente selezionata rappresenta il goal delle terapie con farmaci biologici. L arruolamento di pazienti psoriasici geneticamente predisposti a rispondere a terapie con farmaci biologici determinerebbe sicuramente un abbassamento ed una giustificazione di costi sostenuti dal SSN ed un aumento dei successi terapeutici, che avrebbero un risvolto positivo sul soggetto e sulla società. Inoltre trattamenti mirati permetterebbero di abbassare gli effetti collaterali dei farmaci biologici, che viceversa un uso improprio contribuirebbe a diffondere. FARMACOGENOMICA E FARMACOGENETICA Al momento non esistono parametri predittivi di attività ottimale dei Farmaci Biologici nei singoli soggetti con malattie dermatologiche. Un uso appropriato prevede sicuramente la valutazione della situazione clinica del soggetto, un attenta anamnesi del soggetto riferendosi in particolare ad infezioni recenti o pregresse e a malattie su base immunologia e la misurazione di markers biochimici con caratteristiche predittive. Ricerche di base atte ad individuare tali markers indicativi del trattamento migliore in termini di velocità di azione, di efficacia e di minimizzazione degli effetti collaterali sarebbero sicuramente auspicabili. I progressi recenti della ricerca genetica e biochimica stanno portando infatti allo sviluppo di numerosi test genetici sia per patologie monogeniche o mendeliane che multifattoriali. La farmacogenetica intende fornire la metodologia per effettuare test sul DNA dei singoli pazienti in maniera da individuare le basi genetiche della diverse risposte ai farmaci. L individuazione di test genetici che indirizzino il medico alla scelta del Farmaco Biologico più adeguato per il singolo paziente fornirebbe sicuramente un guadagno sia in risultati terapeutici che economici. 4

5 Il comitato nazionale per la Bioetica nella seduta del 21 aprile 2006 ha approvato all unanimità un documento dal titolo Dalla Farmacogenetica alla Farmacogenomica in cui vengono fatte valutazioni preliminari, vengono date le definizioni di farmacogenetica e farmacogenomica e vengono auspicati nuovi studi in materia di proteomica al fine di porre in relazioni sequenze geniche di singoli o più geni con i prodotti genici ad essi associati ossia le proteine. Vengono valutate tutte le questioni bioetiche relative agli studi genetici della risposta individuale ai farmaci, ma vengono auspicate, scendendo anche nei dettagli tecnici, ricerche che pongano in relazione aspetti genetici e previsione di efficacia dei trattamenti. In particolare affrontando il tema del trattamento con farmaci biotecnologici di specifici tumori viene messa in evidenza l alto grado di specializzazione dei ricercatori che dovranno lavorare in tal senso e l opportunità di sviluppo di nuovi farmaci mirati in tempi molto più rapidi rispetto allo sviluppo di molecole attive di tipo tradizionale. Inoltre viene indicato che attualmente la FDA ha emesso una Draft Guidance per i ricercatori che intendano comunicare dati farmacogenetici ottenuti nel corso di sperimentazioni. Questo regime volontaristico potrebbe cambiare rapidamente man mano che la ricerca prosegue e secondo le previsioni di alcuni autori entro il 2014 tutte le nuove medicine saranno ottenute in base a procedimenti che coinvolgono analisi farmacogenetiche. Queste stime vengono fornite basandosi sulla rapidità dell innovazione in campo biotecnologico, grazie alla bioinformatica, al prevedibile abbassamento dei costi di realizzazione dei test molecolari, e alla spinta che potrebbe ricevere questo settore dalla massa sempre maggiori di dati che dimostrandosi sempre più attendibili si mostrano in grado di prevedere efficacia terapeutica e sicurezza di utilizzo dei farmaci riducendo o evitando effetti collaterali. PSO-CARE La psoriasi è una malattia cronica con un ampio spettro di forme, che l EMEA ha definito: 1. Psoriasi di grado lieve (PASI <10): lieve Psoriasi che interessa meno del 10% della superficie corporea, ben controllata con la terapia locale che e che non influenza lo stato emozionale e le relazioni sociali del paziente. 2. Psoriasi moderatamente grave (PASI 10-20) che coinvolge una superficie variabile dal 10 al 25% della superficie corporea o che interessa meno del 10% ma con effetti importanti sul benessere psicologico e sociale del paziente (come per il coinvolgimento di viso e mani). Il ricorso alla terapia locale è tuttavia possibile e non problematico. 3. Psoriasi di grado moderato-grave: Psoriasi che interessa più del 10% della superficie corporea (PASI 10-20) con mancata risposta alla terapia locale. Oppure, psoriasi che interessa <10% della superficie corporea ma con lesioni in aree problematiche (per esempio cuoio capelluto, superfici palmo-plantari). 4. Psoriasi grave che coinvolge più del 25% della superficie corporea (con PASI superiore a 20 o con BSA meno del 25% o PASI meno di 20) o meno del 25% ma con importanti effetti psicologici e sociali e che non risponde alla terapia topica o, ancora, psoriasi che coinvolge meno del 25% ma instabile e rapidamente progressiva. Psoriasi artropatica, psoriasi pustolosa di Hallopeau. Psoriasi che coinvolge più del 20% della superficie corporea (PASI >20) o meno del 20% ma con importanti manifestazioni locali. 5. Psoriasi grave a prognosi riservata. Psoriasi associata a sintomi sistemici. E possibile skin failure : psoriasi pustolosa generalizzata (von Zumbusch), psoriasi eritrodermica. La gravità oggettiva della malattia misurata dal clinico, molte volte viene percepita in maniera molto più grave dal paziente. La psoriasi è infatti una malattia con impatto psicologico molto importante. I tassi di suicidi tra i pazienti psoriasici sono infatti significativamente più alti rispetto a quelli nella popolazione normale. La necessità di terapie farmacologiche mirate, di trattamenti protratti nel tempo, ma anche di continuità di prestazioni da parte di personale medico ed infiermeristico esperto, dedicato e capace di instaurare un rapporto di fiducia rassicurando i pazienti in maniera da rendere più sopportabile il carico psicologico determinato dalla malattia ha fatto sorgere la necessità di centri denominati PSOCARE. Si tratta di centri altamente specializzati e 5

6 in grado di fornire terapie mirate e di supportare la terapia farmacologica con indicazioni comportamentali e psicologiche. Il paziente deve infatti essere educato ad uno stile di vita, che minimizzi i fattori scatenanti della malattia che si presenta con ereditarietà multifattoriale e deve essere supportato in maniera tale da consentirgli lo svolgimento delle normali attività lavorative e sociali. La variabilità di risposta a placebo nell ambito di vari studi clinici condotti sui trattamenti farmacologici in corso di psoriasi anche di forma grave dimostra il possibile ruolo delle strategie assistenziali nell esito delle terapie stesse. Le Aziende Sanitarie applicando le linee guida regionali circa l obiettivo di miglioramento della qualità di vita dei soggetti, in termini di prevenzione e di ottimizzazione delle cure al fine di ottenere i risultati attesi con il minor dispendio economico, auspicano la nascita di centri di eccellenza capaci di offrire cure innovative, mirate e dunque più efficaci. Nell ottica di questa visione nuova del Sistema Sanitario proiettato a creare Salute e a prendersi cura in maniera sistematica dei malati cronici sono sorti in varie città Italiane numerosi centri per la cura della psoriasi denominati PSOCARE in cui il personale medico ed infermieristico viene continuamente aggiornato ed educato alla gestione dei servizi clinici dedicati. Solo nell ambito di questi centri possono essere somministrate cure altamente specifiche di derivazione biotecnologia, in quanto la somministrazione di questi necessita di personale altamente specializzato e di un monitoraggio stretto della terapia. Di norma si tratta di farmaci ben tollerati, ma le precauzioni d uso sono d obbligo, la strategia terapeutica in termini di dosaggi e durata delle terapia và considerata in maniera attenta e quando gli effetti collaterali si verificano possono essere anche molto importanti, per cui il centro deve essere predisposto alla gestione dell emergenza. PROGETTO DI RICERCA Utilizzando l opportunità del grande bacino di utenza di malati psoriasici provenienti dalla toscana, ma anche da altre regioni italiane, essendo il centro Fiorentino uno dei più grandi d Italia, e sfruttando la collaborazione tra clinici e ricercatori intendiamo contribuire alla ricerca in senso clinico e molecolare. Intendiamo dunque definire ulteriormente i meccanismi patogenetici della malattia, che sono argomento di dibattito internazionale, e classificare nella nostra casistica l efficacia e la sicurezza delle terapie in uso, associando a studi di popolazioni analisi convenzionali e molecolari specifiche, seguendo procedure, che intendiamo ideare e validare con strumenti di analisi statistica. Rimangono infatti interrogativi importanti a cui trovare le risposte adeguate circa la patogenesi di una malattia che è peculiare della specie umana. Le osservazioni da compiere e la possibilità di ricerca, anche solo utilizzando molecole attualmente in uso, sono ancora tantissime e nel prossimo futuro saranno introdotti, perché già in fase di studio numerosissimi tool farmacologici, da studiare su un organo, la pelle, che fortunatamente per i ricercatori è facilmente accessibile, anche se estremamente complesso e per questo affascinante. I modelli animali possono essere utili per definire alcuni meccanismi responsabili dell infiammazione e nello studio di geni coinvolti nella patogenesi, ma il modello animale rimane troppo lontano rispetto ai meccanismi che si realizzano nell uomo. Lo studio genetico e delle lesioni dei pazienti sono sicuramente i modelli migliori da utilizzare. Inoltre non è completamente noto, ma sembra che i subset leucocitari e di cellule dendritiche infiltrati nella cute di topo siano molto diversi da quelli che si ritrovano nell uomo (13). Il progetto di ricerca prevede la formazione di una banca di dati relativi ai pazienti e alla loro patologia e di campioni biologici di tessuti, cellule e plasma provenienti da questi. Sarà infatti approvata e messa in uso una procedura che medici, ricercatori e pazienti seguiranno al momento di iniziare la ricerca: 1. Ai pazienti verrà effettuata un accurata anamnesi negli ambulatori al fine di ottenere dati importanti per la definizione dei gruppi di studio. 2. I pazienti saranno sottoposti alle analisi cliniche convenzionali con valutazione dei parametri infiammatori e della suscettibilità ad infezioni ed in particolare ai test per la tubercolosi latente. 3. Tutti i dati verranno opportunamente registrati su un sistema informatico. 6

7 4. Sarà chiesto il consenso a far parte di gruppi di studio. 5. Ai pazienti verrà fatto un prelievo di sangue, che sarà inviato al laboratorio di farmacogenetica. 6. Se i pazienti daranno il consenso e saranno disposti a collaborare saranno sottoposti ad esame bioptico della lesione ed eventualmente della zona sana limitrofa. Creazione di una banca di campioni biologici Uno degli steps del progetto sarà la creazione di una banca di colture cellulari (fibroblasti e cheratinociti messe in coltura a partire dai prelievi tissutali effettuati), tessuti provenienti dai prelievi bioptici, leucociti polimorfonucleati e plasma di soggetti psoriasici già inquadrati clinicamente. Il primo dato che cercheremo di mettere in evidenza sarà la ricerca di correlazioni tra i parametri biologici e gravità dei quadri clinici. Successivamente saranno messe in evidenza modificazioni indotte dai trattamenti farmacologici sui parametri molecolari e clinici. Effettuando il follow-up dei pazienti con la raccolta dei campioni biologici ci permetterà di indagare le basi molecolari della risposta ai farmaci. Separazione dei globuli bianchi dal sangue La separazione dei globuli bianchi dal sangue sarà effettuata utilizzando un gradiente di ficoll. Il sangue sarà diluito in PBS e sarà deposto delicatamente su un volume corrispondente di ficoll. La sospensione sarà sottoposta a centrifugazione per 20 min a 2000 rpm. I globuli bianchi, che rimarranno sull anello all interfaccia plasma-ficoll saranno raccolti dopo aver separato e raccolto il plasma. Le cellule saranno dunque diluite in PBS e lavate con questo buffer. La pellet sarà risospesa in medium per colture cellulari addizionato del 10% dimetilsolfossido e saranno poi congelate. Le frazioni congelate saranno sottoposte ad ulteriori separazioni mediante il sistema di anticorpi specifici legati a biglie magnetiche, separazione dei magneti in un campo magnetico esercitato da una calamita ed eluizione delle cellule dal supporto. Le popolazioni ricavate saranno utilizzate negli esperimenti di co-coltura o di attivazione da parte dei cheratinociti, provenienti dallo stesso paziente. Questo consentirà di indagare sui meccanismi molecolari di interazione tra linfociti, neutrofili e cheratinociti. Una porzione dei globuli bianchi sarà utilizzata per l estrazione del DNA. Estrazione del DNA e del RNA L estrazione degli acidi nucleici sarà effettuata con i metodi RNAeasy kit (Quiagen, Valencia, CA) e DNAeasy kit seguendo le istruzioni. Il DNA così ottenuto sarà utilizzato per andare a cercare mutazioni geniche correlate con la malattia. La sintesi del cdna necessaria per studiare i profili di espressione genica delle varie popolazioni cellulari sarà effettuata con i metodi di retrotrascrizione seguendo i protocolli standard. REAL-TIME QUANTITATIVE RT-PCR: L analisi quantitativa del mrna sarà effettuata secondo le metodologie già ampiamente pubblicate. Per analizzare l espressione di numerosi geni sarà utilizzata la nuova e flessibile tecnologia dei TaqMan Low Density Array fornita da Applied Biosystems. Tale tecnologia permette di selezionare set di probe e primers per ciascun gene dal catalogo online dei TaqMan Gene Expression Assays che verranno precaricati nella piastra dei Low Density Array. La PCR real time sarà effettuata combinando 25ng di cdna per ciascun campione con i reagenti TaqMan Universal PCR Master Mix nella piastra del TaqMan Low Density Array. L amplificazione e acquisizione dei dati verrà effettuata con lo strumento ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Il gene della microglobulina beta-2 sarà usato come gene di riferimento. L analisi quantitativa dei risultati sarà basata sul metodo del Ct comparativo. 7

8 Immunoistochimica Porzioni di tessuti sottoposti a congelamento in Azoto liquido e conservati a 80 C saranno utilizzati per analisi immunoistochimiche e di attività enzimatiche e recettoriali. Studi immunoistochimici saranno eseguiti come precedentemente gia ampiamente descritto in letteratura. L immunopositività sarà calcolata mediante un programma computerizzato di analisi di immagine, Adobe Photoshop 6.0, Adobe System Incorporated, USA. In sezioni di biopsie di cute umana proveniente dai soggetti psoriasici nelle lesioni e nelle zone sane sarà valutata mediante analisi quantitativa delle aree marcate tramite anticorpi specifici per i vari marker. Il numero di cellule positive per i diversi anticorpi sarà contato su una griglia e normalizzato sul numero totale di cellule. Colture cellulari di cheratinociti Biopsie tissutali ottenute dai pazienti saranno utilizzate per la separazione delle cellule. I tessuti saranno incubati per circa 18 ore a 4 C in una soluzione di PBS contenente 0.3% dispasi e 50 μg/ml gentamicina. Dopo l incubazione sarà separato il derma dall epidermide e quest ultima sarà sottoposta a digestione triptica con tripsina allo 0,25% per 5 min a 37 C. La reazione verrà bloccata aggiungendo un egual volume di siero fetale bovino (FCS). Le cellule saranno filtrate con un apposito filtro, saranno lavate con un mezzo di coltura per cheratinociti (keratinocytes serum free medium-kgm; In vitrogen Life technology) e saranno coltivate nello stesso medium addizionato di gentamicina 50 μg/ml. Le colture cellulari così ottenute verranno caratterizzate con metodiche di immunoistochimica o RT-PCR per i marker tipici dei cheratinociti ed in particolare delle citocheratine, mentre sarà verificata l assenza di altri marker caratteristici di altri tipi cellulari come HLA-DR (macrofagi, cellule dendritiche, linfociti B), CD3 (linfociti T), tirosinasi (melanociti). Saranno poi amplificate e congelate al fine di far parte della banca che si andrà a costituire. Le colture preparate saranno utilizzate per individuare la differenza nell espressione citochimica in base al paziente da cui provengono, la loro capacità di interagire con i linfociti isolati dal sangue periferico dello stesso paziente e i meccanismi che regolano i processi infiammatori. Dosaggio di citochine e fattori di crescita Le citochine circolanti rappresentano lo stato di attivazione del processo infiammatorio in atto per cui il dosaggio di queste rappresenta un utile marker sierico da correlare con la severità del quadro clinico. Il dosaggio delle citochine ematiche a vari tempi del follow-up della terapia farmacologica può essere utile per correlare la terapia, alle modificazioni cliniche e alla variazione dell assetto citochinico. Per poter comprendere tutto il pannello di linfochine, monochine, chemochine, fattori di crescita si utilizzerà un assay in multiplex fornito dalla upstate, che prevede l uso di uno strumento denominato LUMINEX 100 capace di rivelare contemporaneamente tutte le fluorescenze di tutte le citochine comprese nel set. Doseremo dunque per ogni campione IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, CXCl8 (IL-8), IL-10, IL- 12(p40), IL-13, IL-15, IL-17, interferon (IFN)-α, INF-γ, TNF-α, Epidermal Growth factor (EGF), basic Fibroblast Growth Factor (bfgf), (GM-CSF), CCL2, CCL3, CCL4, CCL11(Eotaxin). Le citochine sieriche giocano un importante ruolo nella patogenesi della psoriasi e dell artrite psoriasica iniziando e perpetuando processi infiammatori di tipo umorale e cellulare, per cui sarà molto interessante correlare questi dati ai dati clinici a lungo termine. Il progetto si avvarrà di: 1. Ambulatorio per la raccolta iniziale delle informazioni cliniche. 2. Laboratorio di ricerca molecolare. 3. Unità di ricerca del Centro Interuniversitario di Dermatologia Biologica e Psicosomatica. 4. Centro PSO-CARE, che fornirà la numerosità dei pazienti e possibilità, in quanto munito di autorizzazione, di utilizzare tutte le terapie farmacologiche in uso comprese quelle con farmaci biologici. 5. Disponibilità alla collaborazione di una grande casa farmaceutica. 8

9 Il ricercatore reclutato dovrà coordinare le attività e effettuare i test di laboratorio e i test di correlazione statistica al fine di permettere la realizzazione del progetto esposto. studiare i test/markers sviluppare degli esami diagnostici predittivi fare gli esami già previsti dalla letteratura monitorare gli effetti collaterali integrare la ricerca con l assistenza follow-up permanente e programmato dei pazienti il campo di applicazione è in così rapida evoluzione che impone le osservazioni in un arco temporale di riferimento lungo. 9