Su proposta del gruppo di esperti «Specificazioni dei prodotti enologici»

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1 RISOLUZIONE OIV/ENO 367/2009 MONOGRAFIA SULLA CHITINA-GLUCANO L'ASSEMBLEA GENERALE Visto l'articolo 2, paragrafo 2 iv dell'accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell'organizzazione internalzionale della Vigna e del Vino, Su proposta del gruppo di esperti «Specificazioni dei prodotti enologici» DECIDE di completare il Codex Enologico internazionale con la monografia seguente: CHITINA-GLUCANO [C 6 H 10 O 5 ] m - [C 8 H 13 NO 5 ] n Numero CAS Chitina: Numero CAS -glucano: OGGETTO, ORIGINE E CAMPO DI APPLICAZIONE La chitina-glucano d origine fungina è un [Tapez polimero une naturale, il costituente principale delle pareti cellulari dell Aspergillus niger. È citation estratto prise e purificato a partire dal micelio di Aspergillus niger. Questa risorsa fungina d è l un sottoprodotto della produzione dell acido citrico destinato ai mercati alimentari e farmaceutici. La chitina-glucano è costituita da chitine polisaccaridi (unità di ripetizione N-acetil-Dglucosamina) e 1,3-ß-glucano (unità di ripetizione D-glucosio). I due polimeri sono legati in modo covalente e formano una rete tridimensionale. La proporzione glucano/chitina è di 25:75+ a 60:40 (m/m). È utilizzato come agente per la chiarifica del mosto al momento della sfecciatura per ridurre il tenore di colloidi e la torbidità. Inoltre è utilizzato per la stabilizzazione dei vini prima della messa in bottiglia dopo la loro fermentazione alcolica. Questo polimero ha un potere stabilizzante nei confronti delle casse ferriche. Permette altresì di eliminare i composti indesiderati quali i metalli pesanti (piombo, cadmio), le micotossine, ecc. 2 SINONIMI Poli(N-acetil-D-glucosamina)-poli(D-glucosio) e 1,3-ß-glucano 3 ETICHETTATURA Le indicazioni che seguono devono comparire sull etichetta d imballaggio: origine fungina, prodotto ad uso enologico, le condizioni d uso, di conservazione e la data limite d utilizzo. OIV

2 4 CARATTERI 4.1 Aspetto La chitina-glucano si presenta sotto forma di polvere inodore, insapore e di colore bianco. La chitina-glucano è in pratica totalmente insolubile in ambiente acquoso od organico. 4.2 Purezza e residui solubili La purezza del prodotto deve essere uguale o superiore al 95 %. Mettere in soluzione 5 g di chitina-glucano in 100 ml d acqua bidistillata e agitare 2 minuti. Filtrare dopo il raffreddamento su filtro fitto o su membrana. Evaporare il filtrato e asciugare C. Il tenore di materie solubili non deve essere superiore al 5 %. 5 PROVE 5.1 Identificazione e rapporto chitina-glucano Determinazione del rapporto chitina-glucano Si determina il rapporto glucano/chitina grazie allo spettro di NMR 13 C in fase solida, per confronto con lo spettro di un testimone di chitina pura. Questo metodo é illustrato in dettaglio nell allegato I. 5.2 Perdita all essicazione In un crogiolo di vetro, in precedenza asciugato per 1 ora in una stufa a C e raffreddato in un essiccatore, porre 10 g del prodotto da analizzare. Fare asciugare in una stufa a C fino a raggiungere peso costante. Pesare la quantità di residuo dopo raffreddamento all essiccatore. La perdita di peso deve essere inferiore al 10 %. Annotazione: tutti i limiti fissati qui di seguito sono rapportati in peso secco ad eccezione delle analisi microbiologiche. 5.3 Ceneri Incenerire, senza superare 600 C, il residuo rimasto nella determinazione della perdita all essiccazione descritto al punto 5.2. Lasciare terminare la calcinazione per 6 ore. Far raffreddare il crogiolo in un essiccatore e pesare. Il tasso di ceneri totali non deve essere superiore al 3 %. 5.4 Preparazione della soluzione per le prove Prima del dosaggio dei metalli, il campione messo in soluzione con una digestione acida (HNO 3, H 2 O 2 et HCl). La mineralizzazione avviene in un microonde chiuso. Il campione non subisce né macinazione né essiccazione prima della mineralizzazione. OIV

3 I reagenti utilizzati sono i seguenti HNO 3 (65 %) (Suprapur), HCl (37 %) (Suprapur), H 2 O 2 (35 %) per la mineralizzazione della chitina-glucano. Il campione di chitina-glucano da 0,5 a 2 g è posto in un matraccio al quale si aggiungono 25 ml di HNO 3, 2 ml di HCl e 3 ml di H 2 O 2. L insieme è a questo punto sottoposto ad una digestione con microonde. (Potenza del 60 % per 1 min, 30 % per 10 min, 15 % per 3 min, e 40 % per 15 min). La soluzione a questo punto viene diluita e portata ad un volume finale di 25,0 ml in un pallone tarato con acqua bidistillata. Si potranno ricercare i tenori dei metalli. 5.5 Piombo Il piombo è dosato con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di piombo deve essere inferiore a 1 mg/kg. È anche possibile procedere al dosaggio del piombo con assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale. 5.6 Mercurio Il mercurio si dosa con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di mercurio deve essere inferiore a 0,1 mg/kg. È inoltre possibile procedere al dosaggio del mercurio mediante assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale. 5.7 Arsenico L arsenico si dosa con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di arsenico deve essere inferiore a 1 mg/kg. È inoltre possibile procedere al dosaggio dell arsenico con assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale. 5.8 Cadmio Il cadmio si dosa con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di cadmio deve essere inferiore a 1 mg/kg. È inoltre possibile procedere al dosaggio del cadmio per assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale. 5.9 Cromo Il cromo si dosa con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di cromo deve essere inferiore a 10 mg/kg. OIV

4 È inoltre possibile procedere al dosaggio del cromo per assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale Zinco Lo zinco si dosa con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di zinco deve essere inferiore a 50 mg/kg. È inoltre possibile procedere al dosaggio dello zinco per assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale Ferro Il ferro si dosa con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di ferro deve essere inferiore a 100 mg/kg. È inoltre possibile procedere al dosaggio del ferro per assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale Rame Il rame si dosa con spettrofotometria ad emissione atomica secondo il metodo descritto nell allegato II. Il tenore di rame deve essere inferiore a 30 mg/kg. È inoltre possibile procedere al dosaggio del rame per assorbimento atomico secondo il metodo descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale CONTROLLO MICROBIOLOGICO Microorganismi totali La conta dei microorganismi totali si esegue secondo il metodo orizzontale di conteggio delle colonie a 30 C su mezzo PCA descritto nell allegato III. Meno di 1000 UFC/g di preparazione. È anche possibile procedere alla conta come descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale Enterobatteri La conta degli Enterobatteri si esegue secondo il metodo orizzontale di conteggio delle colonie a 30 C descritto nell allegato IV. Meno di 10 UFC/g di preparazione OIV

5 Salmonelle Procedere alla conta come descritto al capitolo II del Codice Enologico internazionale. Assenza controllata su un campione da 25 g Coliformi Procedere alla conta come descritto al capitolo II del Codice Enologico internazionale. Meno di 100 UFC/g di preparazione Lieviti La conta dei Lieviti si esegue secondo il metodo orizzontale di conteggio delle colonie a 25 C su mezzo YGC descritto nell allegato V. Meno di 100 UFC/g di preparazione. È anche possibile procedere alla conta come descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale Muffe La conta delle Muffe si esegue secondo il metodo orizzontale di conteggio delle colonie a 25 C su mezzo YGC descritto nell allegato VI. Meno di 100 UFC/g di preparazione. È anche possibile procedere alla conta come descritto nel capitolo II del Codice Enologico internazionale. 6 RICERCA DI OCRATOSSINA A Mettere la chitina-glucano in soluzione acquosa (acqua distillata) all 1% e agitare per 1 ora, poi effettuare il dosaggio con l aiuto del metodo descritto nella Raccolta dei metodi internazionali di analisi dei vini e dei mosti. Meno di 5 µg/kg. 7 CONSERVAZIONE Conservare in imballaggi chiusi al riparo dall umidità, in locali con temperatura controllata. OIV

6 1. PRINCIPIO Allegato I Determinazione del rapporto glucano/chitina Questo metodo consiste nel determinare il rapporto glucano/chitina mediante spettro di NMR 13 C in fase solida. 2. REAGENTI E MATERIALI 2.1. Campione di chitina-glucano 2.2. Acqua osmotica 2.3. Acido cloridrico 1M 2.4. Etanolo puro 2.5. Cloroformio puro 2.6. Metanolo puro 2.7. Acetone 2.8. Attrezzatura standard da laboratorio, pipette, vasi cilindrici in vetro, filtri di porosità 30 µm 2.9. Agitatore rotativo Centrifughe da laboratorio Conduttometro Apparecchio di risonanza magnetica nucleare 3. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Prima del dosaggio, i campioni sono preparati secondo un protocollo preciso descritto qui di seguito: 3.1 Lavaggio con HCl 1M (2.3) Questa fase consiste nel miscelare in un tubo 2 g di chitina-glucano (2.1) e 40 ml di HCl 1M. Si agita questa miscela per 30 min a 320 rpm, poi si centrifuga a 4000 rpm per 10 min. Si elimina il surnatante. Si ripete questa fase una volta. 3.2 Lavaggio all acqua osmotica Questa fase consiste nel miscelare il pellet della fase precedente con 40 ml d acqua osmotica (2.2). Si centrifuga questa miscela per 10 min a 4000 rpm. Si elimina il surnatante. Si ripete questa fase fino ad ottenere una conduttività del surnatante inferiore a 100 µs/cm. 3.3 Lavaggio all etanolo Questa fase consiste nel miscelare il pellet della fase precedente con 40 ml di etanolo (2.4). OIV

7 Si centrifuga questa miscela per 10 min a 4000 rpm. Si elimina il surnatante. Si ripete questa fase una volta. 3.4 Lavaggio al cloroformio/metanolo Questa fase consiste nel miscelare il pellet della fase precedente con 40 ml di una miscela 50/50, v/v di cloroformio (2.5) e metanolo (2.6). Si agita questa miscela per 30 min a 320 rpm, poi si centrifuga a 4000 rpm per 10 min. Si elimina il surnatante. Si ripete questa fase una volta. 3.5 Lavaggio con acetone e asciugatura Questa fase consiste nel miscelare il pellet della fase precedente con 40 ml di acetone (2.7). Si agita per 30 min a 320 rpm, poi si centrifuga a 4000 rpm per 10 min. Dopo la centrifugazione,versare il surnatante su di un filtro da 30 µm, risciacquare il tubo flacone con dell acetone (2.7) e versare il tutto sul filtro. Depositare la materia che si trova sul filtro in un cristallizzatore e fare asciugare. Dopo asciugatura, il prodotto è pronto per l analisi NMR. 4. MODALITÀ OPERATIVA I campioni preparati sono in seguito analizzati con il dispositivo di risonanza magnetica nucleare Brücker avanzamento DSX 400WB (o equivalente). Le condizioni di analisi sono le seguenti : 4.1 Campo magnetico: 9,04 Tesla 4.2 Frequenza di Larmor: 83 khz 4.3 Tempo trascorso tra 2 impulsi magnetici: 5 s 4.4 Tempo trascorso durante il quale si applica l impulso magnetico: 5,5 ms 4.5 Numero di sequenze di impulsi magnetici: ESPRESSIONE DEI RISULTATI Si determina la proporzione di beta-glucano dalla superficie delle quattro bande di risonanza. I risultati sono espressi in moli %. OIV

8 Allegato II DOSAGGIO DEI METALLI CON Spettroscopia ad emissione atomica 1. PRINCIPIO Questo metodo consiste nella misurazione dell emissione atomica con una tecnica di spettroscopia ottica. 2. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Prima del dosaggio dei metalli, il campione è posto in soluzione con digestione acida (HNO 3, H 2 O 2 e HCl). La mineralizzazzione avviene in micro-onde chiuso. Il campione non subisce né macinazione né essiccazione prima della mineralizzazione. I reagenti utilizzati sono i seguenti HNO 3 (65 %) (Suprapur), HCl (37 %) (Suprapur), H 2 O 2 (35 %) per la mineralizzazione del chitosano. Il campione di chitina-glucano 0,5 a 2 g viene posto in un matraccio al quale si aggiunge 25 ml di HNO 3, 2 ml di HCl e 3 ml di H 2 O 2. L insieme é quindi sottoposto ad una digestione con microonde (potenza del 60 % per 1 min, 30 % per 10 min, 15 % per 3 min, e 40 % per 15 min). La soluzione è quindi diluita e portata ad un volume finale di 25,0 ml in un pallone tarato con acqua bidistillata. Si potranno ricercare i tenori dei metalli. 3. MODALITÀ OPERATIVA I campioni posti in soluzioni sono nebulizzati e l aerosol così prodotto è trasportato in una torcia al plasma indotto da un campo elettrico ad alta frequenza. Gli spettri di emissione sono dispersi da uno spettrometro a reticolo e l intensità dei raggi viene valutata da un rilevatore (fotomoltiplicatore). I segnali del rilevatore sono trattati e controllati da un sistema informatico. Una correzione del rumore di fondo è utilizzata per compensare le variazioni del rumore di fondo stesso. 4. ESPRESSIONE DEI RISULTATI Le concentrazioni dei metalli nei prodotti enologici sono espresse in mg/kg. OIV

9 Allegato III Conta dei microorganismi totali mediante conta delle colonie ottenute a 30 C Terreno PCA Composizione: Peptone 5,0 g Estratto di lievito 2,5 g Glucosio 1,0 g Agar-agar 15 g Regolare a ph 7,0 Acqua portare a volume a 1000 ml Sterilizzare l ambiente prima dell utilizzo con un autoclave a 120 C per 20 min. Le piastre Petri sono inseminate con il metodo della piastra colata e metodo a spirale. Dopo l inseminazione, sono messe in incubazione a 30 C in aerobiosi per ore. Contare il numero di UFC. OIV

10 Allegato IV Conta degli Enterobatteri realizzato secondo il metodo orizzontale mediante conta delle colonie a 30 C Terreno VRBG Composizione: Peptone 7 g estratto di lievito 3 g Agar-agar 13 g glucosio 10g cloruro di sodio 5g cristalvioletto 0,002g rosso neutro 0,03g Sali biliari 1,5 g Portare a ph 7,4 Acqua portare a volume a 1000 ml Sterilizzare il terreno in autoclave a 120 C per 20 min. Le piastre Petri sono inseminate con il metodo della piastra colata e metodo a spirale. Dopo l inseminazione, sono messe in incubazione a 30 C in aerobiosi per ore. Contare il numero di UFC. OIV

11 Allegato V Conta dei lieviti tramite conta Terreno YGC Composizione: Estratto di lievito 5,0 g D-glucosio 20 g Agar-agar 14,9 g Coramfenicolo 0,1 g Regolare a ph 6,6 Acqua portare a volume a 1000 ml Sterilizzare l ambiente prima dell utilizzo con un autoclave a 120 C per 20 min. Le piastre Petri sono inseminate con il metodo della scatola colata e metodo a spirale. Dopo inseminazione esse sono messe in incubazione a 25 C in aerobiosi da 3 a 5 giorni senza rigirare le piastre Petri. Contare il numero di lieviti. OIV

12 Allegato VI Conta delle muffe mediante conta Terreno YGC Composizione: Estratto di lievito 5,0 g D-glucosio 20 g Agar-agar 14,9 g Coramfenicolo 0,1 g Regolare a ph 6,6 Acqua portare a volume a 1000 ml Sterilizzare l ambiente prima dell uso con un autoclave a 120 C per 20 min. Le piastre Petri sono inseminate con il metodo della scatola colata e metodo a spirale. Dopo inseminazione esse sono messe in incubazione a 25 C in aerobiosi da 3 a 5 giorni senza rigirare le scatole. Contare il numero delle muffe. OIV