Protocolli analitici (sostanze inorganiche)

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1 Protocolli analitici (sostanze inorganiche) 1. Arsenico nei prodotti ittici. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana 2. Cadmio, cromo, nichel, piombo, rame, e vanadio nei prodotti ittici. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana 3. Mercurio totale nei prodotti ittici. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana 4. Metilmercurio (MeHg) nei prodotti ittici. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana

2 1. Arsenico nei prodotti ittici Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Dipartimento di Chimica e Sostanze Biologicamente Attive Acronimi As CV-AAS arsenico spettrofotometria per assorbimento atomico con la tecnica dei vapori freddi 1.1 Scopo e applicazione Il metodo è proposto per la determinazione dell arsenico nei prodotti ittici mediante spettrofotometria per assorbimento atomico con la tecnica dei vapori freddi (CV-AAS) Il metodo si applica a campioni costituiti da prodotti ittici (pescato fresco, lavorato e conservato, molluschi bivalvi, molluschi cefalopodi) nei quali l As è presente in concentrazioni comprese tra e mg/kg. Per concentrazioni superiori si procede alla diluizione della soluzione o si pesano quantità inferiori di campione. 1.2 Principio del metodo L As viene determinato come As(0) mediante CV-AAS, previo incenerimento del campione in muffola. 1.3 Apparecchiature, materiali, reagenti e materiali di riferimento APPARECCHIATURE Omogenizzatore;

3 bilancia tecnica 0.01 g; bilancia tecnica g; stufa a 80 C; muffola (tempereatura massina 1100 C); spettorofotometro per assorbimento atomico con accessorio per la tecnica dei vapori freddi mod. FIAS 100 completo di autocampionatore e sistema computerizzato per acquisizione dati MATERIALI Capsule in quarzo; normale vetreria da laboratorio REAGENTI E STANDARD CERTIFICATI Acido cloridrico per analisi 37 %; acqua demineralizzata ottenuta facendo passare acqua distillata in una colonna di resine a scambio ionico; potassio ioduro per analisi; acido ascorbico per analisi; soluzione standard certificata da 1000 µg/ml di As; magnesio nitrato esaidrato per analisi. 1.4 Procedura analitica PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI LAVORO Soluzione standard di As a 10 µg/ml: prelevare 100 µl di soluzione standard a 1000 µg/ml di As trasferirli in un matraccio tarato da 10 ml e portare a volume con la soluzione è stabile per una settimana a temperatura ambiente; soluzione di modificante di matrice per As: pesare 1.62 g di magnesio nitrato esaidrato, trasferirli in un matraccio da 100 ml sciogliere in acqua demineralizzata e portare a volume; la soluzione è stabile per tre settimane a temperatura ambiente; soluzione KI e acido ascorbico (reattivo per sviluppo colore): in un matraccio da 25 ml pesare 1.25 g di acido ascorbico e 1.25 di ioduro di potassio e portare a volume con acqua bidistillata TRATTAMENTO DEL CAMPIONE Dopo aver opportunamente omogeneizzato il campione, un aliquota di circa 5.00 g viene pesata in una capsula di quarzo e addizionata con 2 3 ml di modificante di matrice in modo da bagnare completamente il campione.

4 Il campione viene posta in stufa a 80 C e poi in muffola a 550 C per tutta la notte. Dopo raffreddamento, viene ripreso con 3 ml di acido cloridrico 37 % e trasferire in una falcon da 50 ml dove è portato al volume di 25 ml con acqua demineralizzata ml della soluzione di campione viene mescolata con 1 ml di acido cloridrico al 37 % e 1 ml di soluzione KI + acido ascorbico. La miscela viene mescolata e lasciata al buio per 45 minuti. Terminata la reazione la miscela è portata al volume di 10 ml con acqua demineralizzata e sottoposta alla lettura strumentale CURVA DI TARATURA La curva di taratura viene costruita utilizzando gli standard la cui preparazione è illustrata dettagliatamente di seguito: Bianco (punto 0): 1 ml della soluzione di KI + acido ascorbico; Std 1 (25 ng/ml): 125 µl As 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml portare a volume con Std 2 (75 ng/ml): 375 µl As 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml portare a volume con Std 3 (150 ng/ml): 750 µl As 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml portare a volume con Prima della lettura strumentale ad 1 ml di ogni standard è aggiunto 1 ml di acido cloridrico al 37 % e 1 ml di soluzione potassio ioduro + acido ascorbico. La miscela viene mescolata e lasciata al buio per 45 minuti. Terminata la reazione, la miscela è portata al volume di 10 ml con acqua demineralizzata e sottoposta alla lettura strumentale Gli standard sono letti in ordine crescente di concentrazione (tre repliche per ogni standard). La curva di taratura è costruita utilizzando il software dello spettrofotometro per assorbimento atomico, riportando la media delle aree rispetto alle relative concentrazioni. È accettata una curva di taratura con coefficiente di correlazione non inferiore a LETTURA STRUMENTALE DEL CAMPIONE La lettura allo spettrofotometro del campione incognito avviene nelle stesse condizioni utilizzate per gli standard impiegati per costruire la curva di taratura. Sulla base del peso del campione sottoposto all analisi e del volume finale della soluzione sottoposta a lettura spettrofotometrica il software calcola direttamente la concentrazione di As in mg/kg nel campione.

5 2. Cadmio, cromo, nichel, piombo, rame, e vanadio nei prodotti ittici Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Dipartimento di Chimica e Sostanze Biologicamente Attive Acronimi Cd Cr Cu FG-AAS Ni Pb V cadmio cromo rame spettrofotometria per assorbimento atomico con fornetto di grafite nichel piombo vanadio 2.1 Scopo e applicazione Il metodo è proposto per la determinazione per la determinazione di Pb, Cr, Cd, Ni, V, Cu nei prodotti ittici mediante spettrofotometria per assorbimento atomico con fornetto di grafite (GFAAS) Il metodo si applica a campioni costituiti da prodotti ittici (pescato fresco, lavorato e conservato) nei quali gli analiti di interesse sono presenti in concentrazioni comprese tra 10 e 500 µg/kg. Per concentrazioni superiori si procede alla diluizione del campione di analisi o si pesano quantità inferiori di campione.

6 2.2 Principio del metodo I metalli vengono determinati mediante spettrofotometria per assorbimento atomico con fornetto di grafite previa mineralizzazione del campione, con un sistema a microonde ed una miscela di HNO 3 : H 2 O 2 (4:1). 2.3 Strumentazione APPARECCHIATURE Omogenizzatore; bilancia tecnica 0.01 g; bilancia tecnica g; mineralizzatore a microonde; spettorofotometro per assorbimento atomico con fornetto di grafite mod. AAnalyst 600 completo di autocampionatore e sistema computerizzato per acquisizione dati; vessels per la mineralizzazione a microonde; normale vetreria da laboratorio REAGENTI E STANDARD CERTIFICATI Acqua ossigenata 130 volumi (40 %); acido nitrico concentrato per analisi 65 %; acqua demineralizzata ottenuta facendo passare acqua distillata in una colonna di resine a scambio ionico; magnesio nitrato esaidrato, titolo minimo 99 %; ammonio di idrogeno fosfato, titolo minimo 99 %; soluzione standard certificata da 1000 µg/ml di Pb, Cr, Cd, Ni, V, Cu. 2.4 Procedura analitica PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI LAVORO Soluzione di modificante di matrice per Pb e Cd: pesare 6.25 g di ammonio di idrogeno fosfato e 0.65 g di magnesio nitrato esaidrato, trasferirli in un matraccio da 100 ml sciogliere in acqua demineralizzata e portare a volume; la soluzione è stabile per tre settimane a temperatura ambiente; soluzione di modificante di matrice per Cr e Ni: pesare 1.62 g di magnesio nitrato esaidrato, trasferirli in un matraccio da 100 ml sciogliere in acqua demineralizzata e portare a volume; la soluzione è stabile per tre settimane a temperatura ambiente;

7 soluzione standard di Pb, Cr, Cd, Cu a 10 µg/ml: prelevare 100 µl di soluzione standard a 1000 µg/ml trasferirli in un matraccio tarato da 10 ml e portare a volume con la soluzione è stabile per una settimana a temperatura ambiente.(effettuare per ogni elemento lo standard a 10 µg/ml separatamente); soluzione standard di Ni, V a 1 µg/ml: prelevare 100 µl di soluzione standard a 1000 µg/ml trasferirli in un matraccio tarato da 100 ml e portare a volume con la soluzione è stabile per una settimana a temperatura ambiente (effettuare per ogni elemento lo standard a 1 µg/ml separatamente) TRATTAMENTO DEL CAMPIONE Dopo aver opportunamente omogeneizzato il campione, viene prelevata un aliquota di circa 2.00 g da destinare alla determinazione dei metalli di interesse. Questa viene posta nel vessel di mineralizzazione ed addizionata con 8 ml di acido nitrico al 65 % e con 2 ml di acqua ossigenata. Il campione così preparato viene mineralizzato nel forno a microonde utilizzando il programma di mineralizzazione riportato di seguito: Stadio Potenza (%) Pressione (psi) Tempo (min) Tempo press. prefissata (min) Temperatura ( C) Terminata la mineralizzazione, la soluzione viene trasferita in un matraccio tarato da 20 ml (precedentemente decontaminato con HNO 3 5 %) dove vengono aggiunti 0.8 ml dell opportuno modificante di matrice. La soluzione portata al volume di 20 ml con acqua demineralizzata, viene sottoposta ad analisi spettrofotometrica per assorbimento atomico CURVE DI TARATURA Per ciascuno degli analiti di interesse è necessario costruire le curve di taratura utilizzando gli standard la cui preparazione è illustrata dettagliatamente di seguito.

8 Cadmio Std 1 (1 ng/ml): 10 µl Cd 10 µg/ml in un matraccio da 100 ml aggiungere 4 ml di modificante di matrice per il Cd e portare a volume con Std 2 (2 ng/ml): 150 µl Cd 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Cd e portare a volume con Std 3 (5 ng/ml): 25 µl Cd 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Cd e portare a volume con Std 4 (10 ng/ml): 25 µl Cd 10 µg/ml in un matraccio da 25 ml aggiungere 1 ml di modificante di matrice per il Cd e portare a volume con acqua demineralizzata Cromo Std 1 (5 ng/ml): 50 µl Cr 10 µg/ml in un matraccio da 100 ml aggiungere 4 ml di modificante di matrice per il Cr e portare a volume con Std 2 (10 ng/ml): 50 µl Cr 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Cr e portare a volume con Std 3 (25 ng/ml): 125 µl Cr 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Cr e portare a volume con Std 4 (50 ng/ml): 125 µl Cr 10 µg/ml in un matraccio da 25 ml aggiungere 1 ml di modificante di matrice per il Cr e portare a volume con acqua demineralizzata Nichel Std 1 (3 ng/ml): 300 µl Ni 1 µg/ml in un matraccio da 100 ml aggiungere 4 ml di modificante di matrice per il Ni e portare a volume con Std 2 (6 ng/ml): 600 µl Ni 1 µg/ml in un matraccio da 100 ml aggiungere 4 ml di modificante di matrice per il Ni e portare a volume con Std 3 (12 ng/ml): 600 µl Ni 1 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Ni e portare a volume con Std 4 (24 ng/ml): 600 µl Ni 1 µg/ml in un matraccio da 25 ml aggiungere 1 ml di modificante di matrice per il Ni e portare a volume con acqua demineralizzata.

9 Piombo Std 1 (1 ng/ml): 10 µl Pb 10 µg/ml in un matraccio da 100 ml aggiungere 4 ml di modificante di matrice per il Pb e portare a volume con acqua demineralizzata; Std 2 (3 ng/ml): 15 µl Pb 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Pb e portare a volume con acqua demineralizzata; Std 3 (6 ng/ml): 30 µl Pb 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Pb e portare a volume con acqua demineralizzata; Std 4 (12 ng/ml): 30 µl Pb 10 µg/ml in un matraccio da 25 ml aggiungere 1 ml di modificante di matrice per il Pb e portare a volume con acqua demineralizzata; Std 5 (24 ng/ml): 120 µl Pb 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml aggiungere 2 ml di modificante di matrice per il Pb e portare a volume con Rame Std 1 (5 ng/ml): 50 µl Cu 10 µg/ml in un matraccio da 100 ml portare a volume con Std 2 (10 ng/ml): 100 µl Cu 10 µg/ml in un matraccio da 100 ml portare a volume con Std 3 (25 ng/ml): 125 µl Cu 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml portare a volume con Std 4 (50 ng/ml): 125 µl Cu 10 µg/ml in un matraccio da 25 ml portare a volume con acqua demineralizzata Vanadio Std 1 (3 ng/ml): 300 µl V 1 µg/ml in un matraccio da 100 ml portare a volume con Std 2 (6 ng/ml): 600 µl V 1 µg/ml in un matraccio da 100 ml portare a volume con Std 3 (12 ng/ml): 600 µl V 1 µg/ml in un matraccio da 50 ml portare a volume con Std 4 (24 ng/ml): 600 µl V 1 µg/ml in un matraccio da 25 ml portare a volume con acqua demineralizzata Le soluzioni così preparate vengono lette allo spettrofotometro, impostando la lettura in 3 repliche ed utilizzando per il bianco (punto 0) la soluzione di modificante ed acqua (1 ml in 25 ml). Le curve di taratura sono costruite utilizzando il software dello spettrofotometro per assorbimento atomico, riportando la media delle aree rispetto alle relative concentrazioni. È accettata una

10 curva di taratura con coefficiente di correlazione non inferiore a LETTURA STRUMENTALE DEL CAMPIONE La lettura allo spettrofotometro del campione incognito avviene nelle stesse condizioni utilizzate per gli standard impiegati per costruire la curva di taratura. Sulla base del peso del campione sottoposto all analisi e del volume finale della soluzione sottoposta a lettura spettrofotometrica il software calcola direttamente la concentrazione di analita in mg/kg nel campione.

11 3. Mercurio totale nei prodotti ittici Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Dipartimento di Chimica e Sostanze Biologicamente Attive Acronimi CV-AAS Hg spettrofotometria per assorbimento atomico con la tecnica dei vapori freddi mercurio 3.1 Scopo e applicazione Il metodo è proposto per la determinazione del mercurio totale nei prodotti ittici mediante spettrofotometria per assorbimento atomico con la tecnica dei vapori freddi (CV-AAS) Il metodo si applica a campioni costituiti da prodotti ittici (pescato fresco, lavorato e conservato, molluschi bivalvi, molluschi cefalopodi) nei quali il Hg è presente in concentrazioni comprese tra e 1.25 mg/kg. Per concentrazioni superiori si procede alla diluizione della soluzione o si pesano quantità inferiori di campione Principio Il Hg viene determinato come Hg(0) mediante CV-AAS previa mineralizzazione del campione con un sistema a microonde ed una miscela di HNO 3 : H 2 O 2 (4:1).

12 3.3. Apparecchiature, materiali, reagenti e materiali di riferimento APPARECCHIATURE Omogenizzatore; bilancia tecnica 0.01 g; bilancia tecnica g; stufa a 80 C; muffola (tempereatura massina 1100 C); spettorofotometro per assorbimento atomico con accessorio per la tecnica dei vapori freddi mod. FIAS 100 completo di autocampionatore e sistema computerizzato per acquisizione dati MATERIALI Vessels per la mineralizzazione a microonde; normale vetreria da laboratorio REAGENTI Acqua ossigenata 130 volumi (40 %); acido nitrico concentrato per analisi 65 %; acqua demineralizzata ottenuta facendo passare acqua distillata in una colonna di resine a scambio ionico; sodio boro idruro, titolo minimo 96 %; sodio idrossido in pastiglie; acido cloridrico concentrato per analisi 37 %; soluzione standard certificata da 1000 µg/ml di Hg MATERIALI DI RIFERIMENTO Materiale di riferimento certificato BCR CRM 463. Liofilizzato di tonno con concentrazione di Hg totale di 2.85 ± 0.16 mg/kg. 3.4 Procedura analitica PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI LAVORO Sodio idrossido soluzione al 25 %: pesare 25 g di sodio idrossido, trasferirli in un matraccio da 100 ml sciogliere in acqua e portare a volume; la soluzione è stabile per due settimane a temperatura ambiente; sodio boro idruro soluzione circa allo 0.2 % (preparare ogni volta): introdurre 500 ± 5 mg di sodio boro idruro in un matraccio tarato da 250

13 ml, aggiungere 150 ml di acqua demineralizzata e 0.5 ml di sodio idrossido al 25 %, agitare e portare a volume con acqua; acido cloridrico soluzione al 3 % v/v: prelevare 30 ml di acido cloridrico concentrato e portare a volume con acqua demineralizzata in un matraccio tarato da 1000 ml; la soluzione è stabile per due settimane a temperatura ambiente; soluzione standard di Hg a 10 µg/ml: prelevare 100 µl di soluzione standard a 1000 µg/ml di Hg, trasferirli in un matraccio tarato da 10 ml e portare a volume con acido cloridrico al 3 %; la soluzione è stabile per una settimana a temperatura ambiente TRATTAMENTO DEL CAMPIONE Dopo aver opportunamente omogeneizzato il campione, viene prelevata un aliquota di circa 2.00 g da destinare alla determinazione dei metalli di interesse. Questa viene posta nel vessel di mineralizzazione ed addizionata con 8 ml di acido nitrico al 65 % e con 2 ml di acqua ossigenata. Il campione così preparato viene mineralizzato nel forno a microonde utilizzando il programma di mineralizzazione riportato di seguito: Stadio Potenza (%) Pressione (psi) Tempo (min) Tempo press. prefissata (min) Temperatura ( C) Terminata la mineralizzazione, la soluzione viene trasferita in un matraccio tarato da 25 ml e portata a volume con acqua demineralizzata CURVA DI TARATURA La curva di taratura viene costruita utilizzando gli standard la cui preparazione è indicata di seguito (gli standard vengono preparati in acido cloridrico al 3 % v/v): Bianco (punto 0): acido cloridrico al 3 % v/v; Std 1 (2 ng/ml): 20 µl Hg 10 µg/ml in un matraccio da 100 ml; Std 2 (10 ng/ml): 50 µl Hg 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml;

14 Std 3 (20 ng/ml): 100 µl Hg 10 µg/ml in un matraccio da 50 ml; Std 4 (40 ng/ml): 100 µl Hg 10 µg/ml in un matraccio da 25 ml; Std 5 (50 ng/ml): 125 µl Hg 10 µg/ml in un matraccio da 25 ml Gli standard sono letti in ordine crescente di concentrazione (tre repliche per ogni standard). La curva di taratura è costruita utilizzando il software dello spettrofotometro per assorbimento atomico, riportando la media delle aree rispetto alle relative concentrazioni. È accettata una curva di taratura con coefficiente di correlazione non inferiore a LETTURA STRUMENTALE DEL CAMPIONE La lettura allo spettrofotometro del campione incognito avviene nelle stesse condizioni utilizzate per gli standard impiegati per costruire la curva di taratura. Sulla base del peso del campione sottoposto all analisi e del volume finale della soluzione sottoposta a lettura spettrofotometrica il software calcola direttamente la concentrazione di Hg in mg/kg nel campione.

15 4. Metilmercurio (MeHg) nei prodotti ittici Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Dipartimento di Chimica e Sostanze Biologicamente Attive Acronimi MeHg EtHg NaBPh 4 GC MS metilmercurio etilmercurio sodio tetrafenilborato gas cromatografia spettrometria di massa 4.1 Scopo Lo scopo della presente procedura è quello di descrivere le modalità operative per la ricerca del metilmercurio (MeHg) nel pesce e nei prodotti ittici. 4.2 Principio del metodo Dopo digestione acida del campione, il MeHg viene estratto prima in toluene e poi retroestratto in una soluzione acquosa di cisteina. Dopo derivatizzazione con sodio tetrafenilborato (NaBPh 4 ) in ambiente acidio, l analita di interesse viene determinato mediante gascromatografia con rivelazione a selezione di massa (GC-MS/MS) in modalità full scan, con quantificazione del contenuto di analiti del campione tramite retta di calibrazione in matrice. 4.3 Strumentazione

16 Bilancia di precisione ± 1 mg; bilancia analitica ± 0.01 mg; centrifuga refrigerata; sistema riscaldato per l evaporazione sotto corrente di N 2 ; gascromatografo Thermo-Finnigan mod. Trace GC dotato di rivelatore a selezione di massa a trappola ionica (MS/ITD) mod. PolarisQ ed autocampionatore Thermo-Finnigan AS 3000; normale vetreria da laboratorio; bagno ad ultrasuoni; provettoni Falcon in polipropilene con tappo a vite da 50 ml; vials a tappo a vite da circa 12 ml con tappo teflonato; vials a tappo a vite da circa 2 ml per gascromatografia. 4.4 Reagenti e standard REAGENTI E MATERIALE CROMATOGRAFICO Acido cloridrico 6 M; sodio cloruro; (L)-cisteina acido solforico %; solfato di rame (II); sodio tetrafenilborato (NaBPh 4 ); colonna capillare con fase RTX 5sil MS (RESTEK) 30 m 0.25 mm 0.25 µm df, o di analoga selettività a basso spurgo per GC/MS SOLVENTI Acqua MilliQ; metanolo per pesticidi; toluene per pesticidi; acetone per pesticidi; n-esano per pesticidi STANDARD CERTIFICATI Standard di metilmercurio PESTANAL ; standard di etilmercurio cloruro analitico.

17 4.4.4 SOLUZIONI STANDARD Soluzione di MeHg 1 mg/ml: 10 mg di metilmercurio, pesati su bilancia analitica, vengono portati a 10 ml con metanolo. Soluzione di MeHg 10 µg/ml: 100 µl della soluzione di MeHg 1 mg/ml vengono diluiti fino al volume di 10 ml con metanolo. Soluzione di MeHg 1 µg/ml: 1000 µl della soluzione di MeHg 10 µg/ml vengono diluiti fino al volume di 10 ml metanolo. Soluzione di EtHg 1 mg/ml: 10 mg di etilmercuri, pesati su bilancia analitica, vengono portati a 10 ml con metanolo. Soluzione di EtHg 10 µg/ml: 100 µl della soluzione di EtHg 1 mg/ml vengono diluiti fino al volume di 10 ml con metanolo. Soluzione di EtHg 1 µg/ml: 1000 µl della soluzione di EtHg 10 µg/ml vengono diluiti fino al volume di 10 ml metanolo. 4.5 Conservazione del campione Il campione omogeneizzato è congelato a 20 C, fino all analisi. 4.6 Procedura analitica DIGESTIONE DEL CAMPIONE Circa 0.50 g di campione, opportunamente omogeneizzato, vengono pesati in una provetta di vetro da 20 ml munita di tappo e addizionati con 100 µl della soluzione di EtHg 1 µg/ml. Dopo l aggiunta di 5 ml di acido cloridrico 6 M il campione è sonicato per 30 minuti ESTRAZIONE DEL METILMERCURIO Il campione raffreddato viene addizionato di 10 ml di NaCl 10 % (w/v) in acqua, agitato manualmente per 3 minuti e centrifugato a t.a. per 10 minuti a 2400 rpm. Il surnatante viene trasferito in una provetta di vetro con tappo a vite teflonato ed estratto per due volte con 4 ml di toluene. Le fasi organiche vengono combinate e retroestratte con 2 ml di soluzione acquosa di (L)-cisteina all 1 % (v/w). La fase acquosa cisteinica viene raccolta in una vial da 12 ml con tappo a vite teflonato.

18 4.6.3 DERIVATIZZAZIONE Dopo acidificazione della fase acquosa cisteinica con 0.2 ml di acido solforico 0.1 M, la reazione di derivatizzazione viene effettuata aggiungendo 1 ml di soluzione satura di solfato di rame (II) e 0.2 ml di NaBPh 4 1 % (v/w) in acqua in presenza di 1 ml di n-esano. Dopo 20 minuti di agitazione, la fase organica viene separata e analizzata mediante GC-MS DETERMINAZIONE STRUMENTALE Gli analiti di interesse sono determinati mediante HRGC-MS/MS (trappola ionica) in modalità Full Scan utilizzando le condizioni operative descritte nell Allegato Il rilevamento quantitativo viene eseguito mediante retta di taratura in matrice.

19 ALLEGATO 4.1 Condizioni operative suggerite per la determinazione strumentale del MeHg Colonna gas cromatografia: RTX 5sil MS (RESTEK) 30 m 0.25 mm 0.25 µm df, o di analoga selettività a basso spurgo per GC/MS. Iniezione in modalità splitless di 1 µl. Temperatura in sorgente 250 C. Damping gas 1.5 ml/min. Polarità positiva. L analisi è effettuata in modalità full scan nel range Programmata GC: 60 C per 1 min; 25 C/min fino a 120 C; 120 C per 1 min; 10 C/min fino 240 C; temperatura post run 320 C; post run time 5 min.