Sensori Nanostrutturati per il Monitoraggio delle Acque
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1 Sensori Nanostrutturati per il Monitoraggio delle Acque Dott. Francesco Chisso NANOFAB S.c.a.r.l..
2 Argomenti della presentazione NanoFAB Sensori nanostrutturati per il monitoraggio As delle acqua Ricerca e monitoraggio di agenti biologici enterici in liquami di impianti di depurazione
3 FAB NANOFAB laboratorio di ricerca e sviluppo nanomateriali inserito nel Distretto Veneto delle Nanotecnologie Univ. Padova Univ. Ca Foscari Venezia Univ. Verona CIVEN Coordinam. Interuniv. Veneto per le Nanotecnologie FAB NANOFAB Supportato dalla Regione Veneto
4 Arsenico La presenza naturale di tale contaminate nelle falde della media e bassa pianura veneta, probabilmente dovuta alla cessione da parte dei minerali argillosi, riscontrabili a diverse concentrazioni nel sottosuolo di tutta la Pianura Padana con composizioni chimiche che giustificano ampiamente la presenza di arsenico. L arsenico (As) è un elemento presente nelle rocce della terra come molti altri elementi e compone una serie di minerali tipici che si trovano anche nelle montagne dell Alto Adige. Gli appassionati di minerali conoscono i luoghi dove è possibile rinvenire l arsenopirite, i diversi tipi dei tetraedriti, il realgar rosso e l oropimento arancione. Nel 600 e nel 700 esistevano diverse miniere che estraevano i minerali di arsenico, dato che questo elemento era ricercato per vari utilizzi. Per esempio si usava per la composizione di creme, per la sua caratteristica di dare una tonalità fresca e rosea alla pelle, inoltre veniva impiegato contro la sifilide. Nel 900 venne usato come fitofarmaco nella frutticoltura fino agli anni 70, dopodiché venne proibito perché nocivo alla salute.
5 Arsenico nelle acque A partire dalla seconda metà del secolo scorso sono stati individuati nel mondo alcuni episodi di contaminazione delle falde acquifere causati dalla presenza di ione arsenico. Tali evidenze hanno spinto la comunità scientifica internazionale ad indagare l impatto che poteva avere sulla popolazione l esposizione prolungata e costante a questo elemento. I dati ricavati hanno portato le autorità legislative competenti ad abbassare nettamente i limiti previsti per le acque destinate al consumo umano, in cui la massima concentrazione tollerata per l arsenico è passata da 50 µg/l a 10 µg/l, al fine di garantire la massima tutela per la popolazione. L Italia, con il D.Lgs.31/01 ha recepito le indicazioni fornite in tal senso dalla Comunità Europea nella direttiva 98/83/CE. Questi nuovi limiti introdotti per le acque destinate al consumo umano, unitamente alla necessità di classificare qualitativamente e quantitativamente le falde acquifere come richiesto dal D.Lgs.152/99 (e dal successivo D.Lgs.152/06), hanno imposto l avvio di specifici progetti di ricerca volti ad approfondire l effettiva entità della diffusione dell arsenico nelle acque sotterranee.
6 Sensore elettrochimico nanostrutturato per la determinazione di Arsenico nelle acque Metodi tradizionali di analisi: Campionamento Analisi di laboratorio ICP-OES ICP-MS 0.2 ppb < DL < 2 ppb Sensore nanostrutturato: Non necessita campionamento Analisi in situ, ad es. ASV, AS-DPV (Differential Pulse Voltammetry) Obiettivo DL < 1 ppb standard di qualità del DM 367/03 5 ppb (2008); 2 ppb (2015)
7 Le determinazioni elettrochimiche di As (III) La voltammetria é una tecnica di analisi basata sulla misura della corrente che passa attraverso un elettrodo immerso in una soluzione contenente specie chimiche elettroattive (che si possono cioè ossidare o ridurre), quando esso é sottoposto ad una variazione di potenziale. L elettrodo, chiamato elettrodo di lavoro, può essere costituito da materiali di vario tipo e possiede generalmente una superficie molto piccola per poter assumere velocemente il potenziale imposto in modo accurato. Può essere solido (in oro, platino o grafite vetrosa), oppure può essere costituito da una goccia di mercurio che pende da un capillare. Au Superficie elettrodica d oro come miglior substrato Utilizzo di superfici elettrodiche sempre più piccole Macro elettrodi Micro elettrodi Ultra micro elettrodi Nanoparticelle su grafite
8 NEE (Nano Electrode Ensemble) Dispositivo promettente per rilevare As d o d o = nanometri
9 Vantaggi dei NEEs Migliorato rapporto signal/background Semplicità e rapidità di utilizzo Adatti per applicazioni in situ Economici Dispositivo usa e getta oppure riutilizzabile
10 Vantaggi dei NEEs Migliorato rapporto signal/background Notevole abbassamento della corrente capacitiva del sistema d = 2-3 mm d = 2-3 mm d 0 = nm Macro elettrodo I c = A geom v C d NEE I c = A active v C d minor superficie attiva minor corrente di fondo
11 Vantaggi dei NEEs Semplicità e rapidità di utilizzo NEE in celletta a 3 elettrodi NEE su elettrodi stampati C NEE Adatti per applicazioni in situ Economici Dispositivo usa e getta
12 Preparazione dei NEE Mediante template synthesis che impiega membrane nanoporose Immagine SEM di una membrana nanoporosa
13 Preparazione dei NEE Electroless gold deposition + SnCl 2 + Ag + + Au + Sn 2+ Sn 2+ Sn 2+ Ag Sn 2+ Sn 2+ Ag Sn 2+ Sn 2+ Au Sn 2+ Au Sn 2+ Sn 2 + Sn 2 + Ag Sn 2 + Au Sn 2+ Sn 2+ Sn 2+ Ag Au Sn 2 + Sn 2 + Ag Sn 2 + Au Sn 2+ Sn 2+ Sn 2+ Sn 2+ Ag Sn 2+ Ag Sn 2+ Ag Sn 2+ Au Sn 2+ Au Sn 2+ Au Sn 2+ sensitization Ag + activation Au deposition 2Au + +HCOH + 3OH - HCOO - + 2H 2 O + 2Au 0
14 Preparazione dei NEE Strutture d oro generate all interno dei nanopori
15 Caratterizzazione SEM Scanning Electron Microscopy (SEM)
16 Caratterizzazione AFM Atomic Force Microscopy (AFM)
17 Preparazione dei NEE Tape peel of top gold surface Ø 30 nm 25 mm Polycarbonate membrane Au 6 µm Geometric area Insulating tape Tape assembling Conductive tape Al substrate
18 Preparazione dei NEE Immagine del primo elettrodo sperimentale NNE NanoFAB - CIVEN
19 Caratterizzazione elettrochimica Valutazione della risposta elettrochimica rispetto ad un tracciante redox 8.0x x x10-6 I (A) 2.0x x x10-6 α-metil-ferrocene-metanolo -6.0x E (V), Ag/AgCl
20 Caratterizzazione elettrochimica α-metil-ferrocene-metanolo 1µM Macro elettrodo d oro ( =2mm) NEE ( =2mm, pori = 30 nm) 1.5x x x x x x10-8 I(A) 0.0 I (A) x x x x x E(V), Ag/AgCl E (V), Ag/AgCl
21 Determinazione elettrochimica dell As (III): Sono necessarie tecniche di stripping È possibile seguire solo la riossidazione dell As 0 ad As (III) As (V) non è elettroattivo Det. As (III) mezzo HCl 1M tecnica AS-SWV con predeposizione Det. As (total inorg.) mezzo HCl 3M + KI 30g/L tecnica AS-SWV con predeposizione -0.4V per 180s -1.0V per 180s G. Dugo et al. Chemosphere 61 (2005) 1093
22 Determinazione elettrochimica dell As (III): NEE, AS-SWV I(A) 6.5x x x x x x x ppb 30 ppb 25 ppb 20 ppb 15 ppb 10 ppb 8 ppb 6 ppb 4 ppb 5.0x x10-5 Linear Regression for Data1_B: Y = A + B * X Parameter Value Error A E E-7 B E E R SD N P E-7 10 < x x x10-5 Ip(A) 2.0x x x x x E(V), Ag/AgCl [As(III)] (µg/l) σ b = m = DL =0.27 µg/l
23 Determinazione elettrochimica dell As (III): DL per NEE operanti in AS-SWV Prova Range di Linearità LR (µg/l) Sensibilità R Limite di rilevabilità DL (µg/l) media 0.25 ± 0.12 P. Scopece et al.12th International Conference on electroanalysis, ESEAC 2008 June 16-19, Prague (CZ)
24 Progetto RESMIA Monitoraggio in situ di inquinanti inorganici come i metalli pesanti da eseguirsi in continuo o ad intervalli discreti con successiva trasmissione del dato mediante rete informatica in tempo reale. sensori elettrochimici con struttura nanometrica, per la rilevazione della concentrazione di una specifica specie redox es. As(III), Cr(VI) si tratta di analisi non ancora previste dalle disposizioni legislative, ma il tema della speciazione è sicuramente ritenuto importante dalla comunità scientifica, soprattutto per quegli elementi la cui tossicità deriva da un ben specifico stato di ossidazione.
25 Progetto RESMIA ingegnerizzazione e adattamento delle piattaforme nanoelettrodiche al fine di renderle compatibili con le stazioni di monitoraggio previste sensori in grado di lavorare da remoto: da misure in discontinuo a misure in flusso metodo di analisi calibrationless (a) nessuna aggiunta di reagenti chimici (b) frequenza di analisi prestabilita sistema a sostituzione della parte sensibile a) L. Jurica et al. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (2000) b) P. Sala un et al. / Analytica Chimica Acta 585 (2007)
26 Ricerca e monitoraggio di agenti biologici enterici in liquami di impianti di depurazione
27 Il trattamento delle acque reflue
28 Principali microorganismi indicatori per inquinamento di tipo microbiologico in acque superficiali Nella realtà analitica per accertare la qualità microbiologica si fa ricorso alla ricerca di organismi in grado di indicare una situazione potenzialmente pericolosa: microrganismi indicatori. Essi non sono dannosi in sé, ma sono in grado di dare informazioni sulle condizioni microbiologiche generali del campione esaminato
29 Principali tecniche di analisi per l identificazione e la caratterizzazione dei microorganismi Piastra Petri con colonie di Streptococchi fecali Con la tecnica delle membrane filtranti sono determinati: Coliformi totali APAT CNR IRSA Met 7010 C Man Coliformi fecali APAT CNR IRSA Met 7020 B Man Escherichia coli APAT CNR IRSA Met 7030 F Man Streptococchi fecali APAT CNR IRSA Met 7040 C Man
30 Esempio di analisi batteriologica di controllo Ingresso depuratore di Andalo Uscita depuratore di Andalo U.F.C /7/01 28/8/01 Coliformi totali Coliformi fecali Streptococchi fecali Escherichia coli 25/9/01 22/10/01 20/11/01 18/12/01 28/1/02 18/2/02 26/3/02 17/4/02 21/5/02 19/6/02 15/7/02 12/8/02 9/9/02 U.F.C Coliformi totali Coliformi fecali Streptococchi fecali Si riporta un esempio di monitoraggio di parametri batteriologici in ingresso ed uscita impianto Escherichia coli è il parametro previsto dalla normativa vigente come indicatore di inquinamento fecale. Non è però previsto un limite restrittivo nel refluo finale. Normalmente il processo comporta una riduzione di circa 3 unità log. Un impianto è stato dotato sperimentalmente di lampade U.V. per garantire un abbattimento ulteriore, Tutti gli impianti sono dotati di bacino di clorazione nel caso la disinfezione si rendesse necessaria 1 31/7/01 28/8/01 Escherichia coli 25/9/01 22/10/01 20/11/01 18/12/01 28/1/02 18/2/02 26/3/02 17/4/02 21/5/02 19/6/02 15/7/02 12/8/02 9/9/02
31 Il Progetto Impianti di depurazione delle acque Provincia Autonoma di Trento Agenzia per la depurazione Metodologia Tradizionali PCR Università degli Studi di Pisa Laboratorio di Igiene e Virologia Ambientale Metodologia microarray CIVEN-NanoFab Obiettivo generale del progetto è lo studio della contaminazione biologica dei liquami ed aerosol di impianti di depurazione utilizzando metodologie molecolari classiche e standardizzate, quali PCR e Real Time PCR, accanto ad un altro metodo altamente innovativo rappresentato dai microarray a DNA, che consentano di analizzare contemporaneamente una serie di generi, specie, ceppi microbici, in termini sia qualitativi che quantitativi.
32 Scelta degli organismi ENTERICI di maggiore interesse: 5 virus e 2 batteri
33 La disponibilità di un sistema di rilevazione efficace e sufficientemente rapido, per il rilevamento della presenza/assenza dei patogeni è un esigenza sempre più forte in ambito ambientale, e per le risorse destinate al consumo umano. La realizzazione e messa a punto un dispositivo di DNA microarray è una risposta ai limiti delle tecniche tradizionali utilizzate fino a questo momento per il riconoscimento degli agenti patogeni.
34 Facility per la costruzione di microarray MICROARRAY SPOTTER NANOSPETTROFOTOMETRO e BIOANALIZZATORE STAZIONE IBRIDAZIONE e LAVAGGIO PCR e REAL TIME PCR MICROARRAY SCANNER
35 La tecnologia del DNA microarray Un DNA-chip o DNA microarray è definito come un supporto solido sul quale sono immobilizzati migliaia di sequenze di geni differenti formando una matrice di sequenze in due dimensioni. Supporto solido: superficie in vetro funzionalizzato Dim. Vetrino: 25 x 75 mm Spots: fino a Dimametro spot: 100 micron Ogni spot rappresenta un gene-organismo-proteina Grazie alla facilities del laboratorio: Possibilità di creare microarrays custom Possibilità di testare fino a 12 diversi campioni sullo stesso vetrino
36 La tecnologia del DNA microarray PROBE TARGET HYBRIDIZATION EVENT AND DETECTION Il Chip viene esposto alla soluzione contenente un ipotetico campione di interesse. Se nel campione è presente un DNA complementare alla sonda depositata sul chip avrà luogo l ibridazione. Il campione in eccesso non legato viene lavato via.
37 Incremento della sensibilita` mediante l uso di nanoparticelle luminescenti di EtO silice come marcatori per DNA microarray OEt NH 3(acq) Si O Si Si OEt O O OEt EtOH Si O Si SiO 2 EtO OEt Si OEt NH 2 (APTES) Aggiunta di diverse specie luminescenti - Alexa Fluor 555, Eu(NO 3 ) 3, Eu(acac) 3 H 2 N H 2 N Produzione di diversi grammi di particelle di silice luminescenti a basso costo in tempi rapidi Si O O O O SiO SiO 2 2 Si O
38 Limite di rilevabilità: tecnica standard Fluoroforo Alexa 555 come marcatore diretto 0.09 nm 90 nm Concentrazione di DNA marcato Fluorescence (arb. units) Experimental Fitted 2 x Background line y = 72 Background line y = 36 Zero: Detection limit ~ 150 pm 10 1E-10 1E-9 1E-8 1E-7 Labeled DNA concentration (M)
39 Limite di rilevabilità: quantum dots Quantum dot QD555 come marcatore dopo ibridazione 0.09 nm 3 nm Concentrazione di DNA marcato 1000 Fluorescence (arb. units) 100 Experimental Fitted 2 x Background line y = 82 Background line y = 41 Zero: Detection limit ~ 250 pm 10 1E-10 1E-9 1E-8 Labeled DNA concentration (M)
40 Limite di rilevabilità: nanoparticelle luminescenti Nanoparticelle con Alexa 555 come marcatori dopo ibridazione 9 pm 0.9 nm Concentrazione di DNA marcato Fluorescence (arb. units) Experimental Fitted 2 x Background line y = 88 Background line y = 44 Zero: Detection limit ~ 20 pm 1E-12 1E-11 1E-10 1E-9 1E-8 Labeled DNA concentration
41 Limite di rilevabilità: confronto Fluorescence (arb. units) QDs 565 Exp QDs 565 Fit Alexa 555 Exp Alexa 555 Fit NPs 555 Exp NPs 555 Fit 1E-12 1E-11 1E-10 1E-9 1E-8 Labeled DNA concentration Marker QD 565 Alexa 555 NPs Detection limit 250 pm 150 pm 20 pm Miglioramento di un ordine di grandezza utilizzando le nanoparticelle di silice luminescenti!
42 Conclusioni e prospettive La sintesi e funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle luminescenti di silice contenenti fluorofori è stata ottimizzata. Si tratta di un processo semplice, economico e veloce per ottenere diversi grammi di prodotto in poche ore. Un prototipo di DNA microarray basato sull utilizzoutilizzo di nanoparticelle di silice contenenti fluorofori come marcatori è stato realizzato ottenendo un limite di rivelabilità di 20 pm, un ordine di grandezza inferiore alla tecnica tradizionale basata sui fluorofori liberi. Attività future potranno essere sviluppate sulle seguenti tematiche: riduzione dimensionale delle particelle utilizzo dei nuovi marcatori in campo clinico ottimizzazione delle strategie di rilevazione alternative per usare efficacemente le particelle contenenti terre rare (misure a tempo ritardato, upconversion) applicazione delle nanoparticelle luminescenti ad altri campi come il bio-imaging imaging aggiunta di proprietà multifunzionali alle nanoparticelle (magnetismo, drug delivery)
43 Grazie per l attenzione! NanoFAB S.c.a.r.l. TORRE HAMMON VIA DELLE INDUSTRIE MARGHERA VENEZIA VEGA PARCO SCIENTIFICO TECNOLOGICO DI VENEZIA CONTATTI Dott. Francesco Chisso f.chisso@nanofab.it
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