ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe

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1 ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe Optimized for use with Clear-it Stringency Buffer by ZytoVision C C (0.4 ml) 10 (0.1 ml) For the detection of human 1p36.31 and 1q25.3 specific sequences by chromogenic in situ hybridization (CISH).... In vitro diagnostic medical device according to EU directive 98/79/EC

2 Digoxigenin and DNP labeled polynucleotide probe for the detection of human chromosome 1p36.31 and 1q25.3 specific sequences by CISH, ready to use Product Description Content: ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe EmaONF in hybridization buffer. The probe contains DNPlabeled polynucleotides, which target chromosome 1p36.31 specific sequences and digoxigeninlabeled polynucleotides, which target chromosome 1q25.3 specific sequences. Product: Specificity: Storage/Stability: Use: Safety Precautions: C : 0.4 ml (40 reactions of 10 µl each) C : 0.1 ml (10 reactions of 10 µl each) The ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe EmaONF is designed to be used for the detection of chromosome 1p36.31 and 1q25.3 specific sequences in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue or cells by chromogenic in situ hybridization (CISH). The ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe EmaONF must be stored at 2 8 C and is stable through the expiry date printed on the label. This product is designed for in vitro diagnostic use (according to EU directive 98/79/EC). Interpretation of results must be made within the context of the patient s clinical history with respect to further clinical and pathologic data of the patient by a qualified pathologist! Read the operating instructions prior to use! Do not use the reagents after the expiry date has been reached! This product contains substances (in low concentrations and volumes) that are harmful to health

3 Avoid any direct contact with the reagents. Take appropriate protective measures (use disposable gloves, protective glasses, and lab garments)! If reagents come into contact with skin, rinse skin immediately with copious quantities of water! A material safety data sheet is available on request for the professional user! Principle of the Method The presence of certain nucleic acid sequences in cells or tissue can be detected by in situ hybridization using labeled DNA probes. The hybridization results in duplex formation of sequences present in the test object with the labeled DNA probe. Duplex formation of the labeled probe (with sequences of the 1p36.31 and 1q25.3 regions in the test material) can be visualized using primary (unmarked) antibodies, which are detected by secondary polymerized enzyme-conjugated antibodies. The enzymatic reactions of chromogenic substrates lead to the formation of colored signals that can be visualized by light microscopy

4 Instructions Pre-treatment (dewaxing, proteolysis, post-fixation) should be carried out according to the needs of the user. Denaturation and hybridization of probe: NK Vortex the ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe EmaONF and pipette 10 µl each onto individual samples Distribute dropwise on the whole target area to avoid local concentration of probe. Alternatively, add probe to the center of a coverslip and place it upside down on target area. A gentle warming of the probe, as well as using a pipette tip, which has been cut off to increase the size of the opening, can make the pipetting process easier. OK Avoiding trapped bubbles, cover the samples with a coverslip (22 mm x 22 mm). Seal the coverslip, e.g. with a layer of hot glue from an adhesive pistol or with rubber cement PK= Denature the slides at C for 5 min, e.g. on a hot plate QK= Transfer the slides to a humidity chamber and hybridize overnight at 37 C (e.g. in a hybridization oven) It is essential that the tissue/cell samples do not dry out during the hybridization step. Further processing, such as washing, detection, and counter-staining, can be completed according to the user s needs. For a particularly userfriendly performance, we recommend the use of a ZytoDot 2C CISH system by ZytoVision. For best results the probe was optimized for use with the Clear-it Stringency Buffer Et_VF by ZytoVision (separately available, prod. no. WB ) replacing the Wash Buffer SSC (WB1) in the ZytoDot 2C CISH system. These systems were also used for the confirmation of appropriateness of the ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe EmaONF

5 Results In an interphase nucleus of normal cells or cells without aberrations of chromosome 1, two red 1p36.31 signals and two green 1q25.3 signals, which can be clearly distinguished from the background, appear when using a ZytoDot 2C CISH detection system by ZytoVision. Overlapping signals occasionally can be seen as dark dots of undefined color. In cells with a deletion of the 1p36.31 locus, a different signal pattern is visible in interphases. Color and appearance of the signals may vary when a different detection system is used. Due to mitosis, additional signals may be visible even in a small percentage of non-neoplastic cells. Occasionally, nuclei with missing signals may be observed in paraffin-embedded tissue sections. The polynucleotides contained in the ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe EmaONF which recognize the 1q25.3 chromosomal region function in themselves as an internal control that a successful hybridization has occurred, as well as proving the integrity of the cellular DNA. In order to judge the specificity of the signals, every hybridization should be accompanied by controls. We recommend using at least one control sample in which the chromosome 1 copy number is known. Our experts are available to answer your questions

6 Literature Barbashina V, et al. (2005) Clin Cancer Res 11: Cairncross JG, et al. (1998) J Natl Cancer Inst 90: Caron H, et al. (1996) N Engl J Med 334: Isola J, Tanner M (2004) Methods Mol Med 97: Mayr D, et al. (2009) Histopathology 55: Okawa ER, et al. (2008) Oncogene 27: Ragnarsson G, et al. (1999) Br J Cancer 79: Reifenberger J, et al. (1994) Am J Pathol 145: Smith JS, et al. (1999) Oncogene 18: Smith JS, et al. (2000) Genes Chromosomes Cancer 29: Speel EJ, et al. (1994) J Histochem Cytochem 42: Tsukamoto T, et al. (1991) Int J Dev Biol 35: White PS, et al. (2005) Oncogene 24: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN As of: October 16, 2014 (5.8) Trademarks: ZytoVision and ZytoDot are trademarks of ZytoVision GmbH

7 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 Probe IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Produttore: ZytoVision GmbH Codice: C (0.1ml) C (0.4ml) Ottimizzato per l utilizzo con il tampone di stringenza Clear-it di ZytoVision.. Per l identificazione delle sequenze specifiche del cromosoma umano 1p36.31 e 1q25.3 mediante Ibridazione in Situ cromogenica (CISH)... Dispositivo medico-diagnostico in vitro Secondo la direttiva europea 98/79/EC Revisione del 07/03/16 Pagina 1 di 6

8 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Sonda polinucleotidica marcata con Digossigenina e DNP per la rilevazione delle sequenze specifiche del cromosoma umano 1p36.31 e 1q25.3 tramite CISH, pronta all'uso. Descrizione del Prodotto Contenuto: Prodotto: Specificità: Sonda ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 in tampone di ibridazione. La sonda contiene polinucleotidi marcati con DNP, che hanno come target le sequenze specifiche del cromosoma 1p36.31 e polinucleotidi marcati con digossigenina, che hanno come target sequenze specifiche del cromosoma 1q25.3. C : 0.4 ml (40 reazioni da 10μl ciascuna) C : 0.1 ml (10 reazioni da 10µl ciascuna) La Sonda ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 è progettata per essere utilizzata per la rivelazione di sequenze specifiche del cromosoma 1p36.31 e 1q25.3 in tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina o in cellule tramite ibridazione in situ cromogenica (CISH) Stoccaggio/stabilità: La Sonda ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 deve essere conservata a 2 C 8 C ed è stabile fino alla data di scadenza indicata in etichetta. Utilizzo: Il prodotto è progettato per utilizzo come diagnostico in vitro (in accordo con la direttiva EU 98/79/EC). L interpretazione dei risultati deve essere condotta da un patologi esperto considerando la storia clinica del paziente rispettando i dati clinici e patologici. Precauzioni per l uso: Leggere le istruzioni prima dell utilizzo del prodotto. Non usare il prodotto dopo la data di scadenza. Il prodotto contiene sostanze (a basse concentrazioni e volumi) dannose per la salute. Revisione del 07/03/16 Pagina 2 di 6

9 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Evitare il contatto diretto con i reagenti. Usare appropriate misure di protezione (utilizzare guanti monouso, occhiali di protezione e camice). Se il prodotto viene a contatto con la pelle, risciacquare immediatamente e abbondantemente con acqua. Su richiesta dell utilizzatore è disponibile una scheda di sicurezza. Principio del Metodo La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. La formazione del duplex della sonda marcata (con le sequenze delle regioni 1p36.31 e 1q25.3 nel materiale test) può essere visualizzata tramite un anticorpo primario (non marcato) che è a sua volta rivelato tramite un anticorpo coniugato con un enzima polimerizzato secondario. La reazione enzimatica del substrato cromogenico porta alla formazione di segnali colorati osservabili con un microscopio ottico. Revisione del 07/03/16 Pagina 3 di 6

10 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Istruzioni Il pretrattamento (sparaffinatura, proteolisi, post-fissazione) può essere effettuato in accordo alle necessità dell'utilizzatore. Denaturazione e ibridazione della sonda: 1. Vortexare la sonda ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25 e dispensare 10μl per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. In alternativa, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitando la formazione di bolle, coprire il campione con un vetrino coprioggetto (22 mm x 22 mm). Sigillare il vetrino copri oggetto con colla a caldo o mastice. 3. Denaturare a C per 5 minuti, utilizzando una piastra calda. 4. Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37 C (per esempio: in una stufa di ibridazione). E importante che il campione (cellule o tessuto) non si asciughi durante l ibridazione Eventuali ulteriori processi, quali lavaggio, rivelazione e contro-colorazione, possono essere condotti secondo le esigenze dell'utente. Per ottenere prestazioni ottimali, si consiglia l'uso di un sistema di CISH ZytoDot (ZytoVision). Per risultati migliori, la sonda può essere ottimizzata utilizzando il tampone di stringenza Clear-it (WB9) di ZytoVision (disponibile separatamente, codice prodotto WB ), sostituendo il tampone di lavaggio SSC (WB1) nel sistema CISH ZytoDot2C. Questo sistema viene anche utilizzato per confermare l adeguatezza della Sonda ZytoDot 2C SPEC 1p36/1q25. Revisione del 07/03/16 Pagina 4 di 6

11 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Risultati: Nei nuclei in interfase di cellule normali o cellule senza aberrazioni del cromosoma 1, si possono facilmente distinguere dal background due segnali rossi 1 p36.31 e due segnali verdi 1q25.3, visibili utilizzando il sistema di rivelazione ZytoDot2C CISH di ZytoVision. Segnali sovrapposti occasionalmente possono essere visti come punti scuri di un colore indefinito. Nelle cellule con la delezione del locus 1p36.31, è visibile un pattern di segnali diverso durante l interfase. Il colore e l aspetto dei segnali può variare se viene utilizzato un sistema differente di rilevazione. A causa della mitosi, può essere visibile una piccola percentuale di segnali anche in cellule non neoplastiche. Occasionalmente, nei campioni inclusi in paraffina, è possibile avere cellule con assenza di segnale. I polinucleotidi contenuti nella Sonda ZytoDot 2C 1p36/1q25, che riconoscono la regione cromosomica 1q25.3 funzionano sia come un controllo interno, ad indicare l avvenuta ibridazione della sonda, sia come verifica dell integrità del DNA cellulare. Al fine di valutare la specificità dei segnali, ogni ibridazione deve essere verificata mediante controlli (positivo e negativo). Si consiglia di utilizzare almeno un campione di controllo in cui sia inequivocabilmente noto il numero di copie del cromosoma 1. Revisione del 07/03/16 Pagina 5 di 6

12 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Bibliografia: Barbashina V, et al. (2005) Clin Cancer Res 11: Cairncross JG, et al. (1998) J Natl Cancer Inst 90: Caron H, et al. (1996) N Engl J Med 334: Isola J, Tanner M (2004) Methods Mol Med 97: Mayr D, et al. (2009) Histopathology 55: Okawa ER, et al. (2008) Oncogene 27: Ragnarsson G, et al. (1999) Br J Cancer 79: Reifenberger J, et al. (1994) Am J Pathol 145: Smith JS, et al. (1999) Oncogene 18: Smith JS, et al. (2000) Genes Chromosomes Cancer 29: Speel EJ, et al. (1994) J Histochem Cytochem 42: Tsukamoto T, et al. (1991) Int J Dev Biol 35: White PS, et al. (2005) Oncogene 24: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN Marchi: ZytoVision e ZytoDot sono marchi di ZytoVision GmbH. Traduzione della scheda tecnica originale a cura di Bio-Optica S.p.A. distributore ufficiale italiano. Revisione del 07/03/16 Pagina 6 di 6