Biofilm e quorum sensing

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1 Regolazione della trascrizione in procarioti: da meccanismi semplici a eventi regolativi complessi Biofilm e quorum sensing BIOFILM Comunita ben strutturata di batteri e cellule eucariotiche racchiuse in una matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, e che cresce su superfici (inerti o biologiche ), soprattutto all interfaccia con una fase liquida Importanza dei biofilm microbici Un sistema semplice per la determinazione del biofilm: la piastra microtiter Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente, più tendenti a cronicizzarsi e più resistenti alle terapie Batteri adesi ad una superficie solida o flocculati sono utilizzati preferenzialmente in bioreattori industriali e nella depurazione delle acque di scarico

2 Il biofilm come risposta a stress ambientali? Adesione Colonizzazione Maturazione Condizioni non ottimali di crescita (bassa temperatura, scarsità di sostanze nutritive) favoriscono la formazione di biofilm in piastre microtiter Interazioni fisico-chimiche Pili (idrofobicità, carica elettrica) EPS: produzione/organizzazione Polisaccaridi (alginato) Flagello Quorum sensing Fattori di aggregazione cellulare Proteine di membrana (curli, ecc ) esterna, parete cellulare, LPS.. Fattori di virulenza e di adesione: specifici o non-specifici? A diversi fattori importanti nella formazione dei biofilm è stata assegnata una funzione specifica di interazione con proteine dell ospite pili di tipo I recettore del mannosio curli fibronectina Curli: un fattore coinvolto sia nell adesione a superfici solide che nell interazione cellula-cellula Cell-surface interaction Cell-cell aggregation Ma la funzione di questi fattori è sicuramente più generica..

3 La regolazione dei fattori di adesione/aggregazione cellulare è spesso complessa e modulata da sistemi di regolazione a due componenti Curli: La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento orizzontale di materiale genetico Espressi a: osmolarità medio-bassa (regolatore positivo: OmpR regolatore negativo: CpxR) Pilus Fase stazionaria/crescita lenta (regolatore: σ S ) bassa temperatura (Crl, regolatori non identificati) L espressione del pilus consente la coniugazione batterica e stimola la produzione di biofilm Trasferimento genico orizzontale Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl. con trasposoni annessi) o frammenti cromosomali Tra i geni trasmessi, resistenza ad antibiotici ed enzimi di degradazione di sostanze organiche Considerato come un efficiente strategia di adattamento L alta frequenza di coniugazione nei biofilm rappresenta quindi un vantaggio di questa forma di organizzazione cellulare Il sacro Graal del biofilm: il segnale cellulare di adesione avvenuta Si è identificato un numero crescente di geni/proteine espressi solo o preferenzialmente in cellule adese ad una superficie solida. (alginato, OmpX ) Il meccanismo molecolare di questo processo (probabilmente mediato da sistemi di regolazione a due componenti) non è ancora stato definito

4 La produzione di alginato viene indotta solo ad adesione avvenuta Il polisaccaride alginato e coinvolto nella formazione della microcolonia in Pseudomonas Acido β-d-mannuronico-α-l-glucuronico Luce Epifluorescenza Geni espressi differenzialmente in biofilm e in cellule planctoniche: Genomic analysis of biofilm-dependent gene expression through microarray analysis Biof. Inserzione di un gene reporter (lacz) sul cromosoma batterico e misurazione dell attività di β-galattosidasi in cellule planctoniche ( ) o biofilm ( ). Single cells

5 Il numero di geni che si esprime in maniera diversa in singole cellule e nei biofilm comprende una % molto alta del genoma (10-30%). Il numero di geni che si esprime in maniera diversa in singole cellule e nei biofilm comprende una % molto alta del genoma (10-30%). Tutti coinvolti nella formazione del biofilm? L eterogeneità di espressione genica riflette anche (soprattutto?) le diverse condizioni fisiologiche dei batteri in un biofilm complesso Aerobi, Crescita + veloce Quorum sensing: da curiosità evolutiva a processo biologico globale [O 2 ], Nutr. Eurpymna scolopes Anaerobi, Crescita + lenta Vibrio fischeri

6 Quorum sensing: espressione genica dipendente dalla concentrazione cellulare La comunicazione intercellulare da quorum sensing è favorita in biofilm piuttosto che in colture liquide Molecola segnale Molecola segnale Cultura liquida: cfu/ml Attivatore trascrizionale Attivatore trascrizionale Gene target Gene target Molecole segnale: omoserin-lattoni Bassa concentrazione cellulare Alta concentrazione cellulare Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa: variazione sul tema Sistemi di regolazione a due componenti Geni regolati da Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa C12-HSL C4-HSL Tre classi funzionali principali: fattori di virulenza, sintesi di EPS, uptake del ferro Studi genomici stimano al 5-6% la percentuale di geni regolati da QS

7 La biosintesi degli AHL ha come unico scopo la creazione di una molecola segnale Le proteine regolatrici della famiglia LuxR sono tipici regolatori di risposta Il cluster rhlr/rhli è così chiamato per il suo ruolo nella biosintesi dei rhamnolipidi Rhamnolipidi: un esempio di biosurfattanti e i responsabili della swarming motility

8 I promotori QS-dipendenti sono spesso co-regolati da meccanismi legati a stimoli ambientali/fisiologici Geni quorum sensing-dipendenti determinano la struttura ordinata all interno di un biofilm batterico (sito di legame per LuxR)

9 Patogeni delle piante: l unione fa la forza Non solo piante: il QS è direttamente coinvolto in meccanismi di patogenesi nei mammiferi In Agrobacterium tumefaciens e in Erwinia carotovora l induzione dei sistemi di quorum sensing presiede a sistemi di virulenza specifici (trasferimento di un plasmide coniugativo in A.t.; produzione di enzimi pectinolitici in E.c.); l aggressione all organismo ospite viene preceduta da un contare le proprie forze per evitare di cadere vittima della reazione dell ospite stesso Il QS è un bersaglio di sostanze organiche naturali Effetto dei furanoni sulla formazione del biofilm ore L alga Delisea pulchra produce furanoni alogenati (HF), inibitori specifici del QS e competitori degli AHL per il regolatore di risposta (es. LasR) Controllo Aggiunta di HFs Hentzer et al., Microbiology, 148, (2002)

10 Gli induttori (molecole segnale) appartengono a classi chimiche diverse Quorum sensing in batteri Gram + Molecole segnale: peptidi (modificati) Processi biologici regolati da QS: Coniugazione, virulenza, produzione di enzimi extracellulari, adesione cellulare, formazione di biofilm Competenza Produzione di peptidi antimicrobici Peptidi segnale (auto-induttori) in batteri Gram positivi Sistemi agr e com: una struttura comune agrd (virulenza in S. aureus) comx (competenza in B. subtilis)

11 Secrezione e uptake del peptide AgrD AgrC/A: sistema a due componenti AgrB: secrezione/modificazione Schema generale del QS in Gram + AgrC: sensore PO 4 A AgrA regolatore di risposta Confronto tra processi di QS in Gram - e Gram + La doppia vita dei peptidi segnale: attività antimicrobica Feromoni: HSL Libera diffusione attraverso la membrana Sistemi a due componenti (entrambi citoplasmatici) Molecole segnale o feromoni Feromoni: peptidi Secrezione attiva Sistemi a due componenti: Un sensore inserito nella membrana Un regolatore citoplasmatico Un vasto gruppo di peptidi segnale presenta un attività antimicrobica (generalmente mediata da destabilizzazione della membrana) particolarmente spiccata contro altri batteri Gram+ (plantaricina, enterocina, lantibiotici) Particolarmente presenti in batteri lattici (importanti per biotecnologie alimentari)

12 Un peptide antimicrobico utile : la nisina Se ricordiamo lo schema generale del QS in Gram+. Prodotta da lactobacilli; espressione richiede alta densità cellulare (QS) unitamente a fase stazionaria di crescita. Ampio spettro d azione contro Gram + (a concentrazioni nm) Prodotta spontaneamente (o aggiunta) nella preparazione dei formaggi..possiamo comprendere il sistema di produzione e processamento della nisina! Anche i geni dell immunità sono sotto il diretto controllo della nisina nisb transcript Oltre al sistema di modificazione/esporto e di trasduzione del segnale, i ceppi produttori di nisina posseggono geni per l immunità

13 Biosintesi e processamento dei lantibiotici Auto-regolazione (+ regolazione da segnali ambientali e fisiologici) Largo numero di geni coinvolti in: modificazione, esporto, trasduzione del segnale ed immunità (da 10 a 18) Interesse come nuovo agente antimicrobico e per applicazioni biotecnologiche (ind. alimentare) Nisin-controlled expression (NICE) Referenze biofilm/qs Winzer, Hardie, and Williams. Bacterial cell-to-cell communication: sorry, can t talk now gone to lunch! Current Opinion in Microbiology 2002, 5: Withers, Swift, and Williams. Quorum sensing as an integral component of gene regulatory networks in Gram-negative bacteria. Current Opinion in Microbiology 2001, 4: O Toole and Kolter. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 1998, 30: O Toole, Kaplan, and Kolter. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 2000, 54: Davies, Parsek, Pearson, Iglewski, Costerton, and Greenberg. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science 1998, 10: Kleerebezem. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis Peptides 2004, 25: Web: (University of Montana) med harvard edu/ (Kolter lab)